專利名稱：一種dahp合酶的異源可溶性表達(dá)方法及其重組載體和基因工程菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種在大腸桿菌中異源表達(dá)可溶性的由珍貴橙色束絲放線菌(Actinosynenma pretiosun) aroF基因編碼的DAHP合酶的方法及其重組載體和基因工程菌。
背景技術(shù)：
美登素(Maytansinoid)是1972年首先從衛(wèi)矛科植物美登木(Maytenus hookeri Loes)中分離得到的抗癌化合物。安莎霉素(Ansamitocin)是珍貴橙色束絲放線菌 (Actinosynnema pretiosum)來(lái)源的美登素衍生物，多達(dá)二十幾種，臨床藥理實(shí)驗(yàn)表明該類化合物具有治療白血病和肺癌的作用。安莎霉素是在起始單位3-氨基-5-羥基苯甲酸(AHBA)和延伸單位2_甲氧基丙二酰ACP (2-methoxymalonyl-ACP)作用下通過(guò)一系列的鏈起始、延伸和終止合成碳骨架，再經(jīng)過(guò)一系列的后修飾合成安莎霉素。安莎類化合物的生理活性非常強(qiáng)，目前人們正在努力將它們開(kāi)發(fā)為臨床上有用的抗癌藥物，例如將美登素或其衍生物與以腫瘤細(xì)胞為靶點(diǎn)的抗生素結(jié)合制成導(dǎo)彈藥物。莽草酸途徑是合成芳香族氨基酸包括苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸的重要途徑，它的起始物質(zhì)為戊糖代謝的中間產(chǎn)物赤蘚糖-4-磷酸(erythosd-phosphate， E4P)和糖酵解過(guò)程的一個(gè)中間產(chǎn)物磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenolpyruvate，PEP)，二者在DAHP合酶的作用下縮合形成一個(gè)七碳酮糖開(kāi)鏈磷酸化合物，稱為3-脫氧- α -阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸，即DAHP，再經(jīng)脫磷酸環(huán)化，形成苯環(huán)后通過(guò)脫水、加氫形成莽草酸 (shikimate)。在可以產(chǎn)生利福平素B的菌株Amycolatopsis mediterranei S66中發(fā)現(xiàn)了另一種特殊的莽草酸途徑即氨基莽草酸途徑(aminoshikimate pattway)，它在其早期階段與莽草酸生物合成途徑平行，在合成代謝過(guò)程中有氨基摻入，并在氨基DAHP合酶的作用下形成AHBA。目前，在已經(jīng)公布的珍貴橙色束絲放線菌(A. pretiosum)的安莎合成基因簇的基因中尚未發(fā)現(xiàn)氨基DAHP合酶(amino-DAHP合酶)的基因，因此，莽草酸途徑和氨基莽草酸途徑的第一分歧DAHP合酶和氨基DAHP合酶的差異是否存在值得質(zhì)疑。另外，一些有趣的問(wèn)題例如DAHP合酶是否同時(shí)發(fā)揮著氨基DAHP合酶的作用以及amino-DAHP中的氨基基團(tuán)是怎樣引入的等都值得我們進(jìn)一步深入探討。DAHP合酶的進(jìn)一步研究和應(yīng)用有許多問(wèn)題尚待解決。DAHP合酶的異源可溶性表達(dá)是解決這些問(wèn)題的關(guān)鍵一環(huán)，但是目前還未能實(shí)現(xiàn) DAHP合酶的異源可溶性表達(dá)，不能大量獲得具有酶活性的DAHP合酶。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)目前某些外源基因如珍貴橙色束絲放線菌 (Actinosynenma pretiosun) aroF基因編碼的DAHP合酶無(wú)法實(shí)現(xiàn)異源可溶性表達(dá)的現(xiàn)狀， 提供一種外源基因在大腸桿菌中異源可溶性表達(dá)的方法及其所用的重組載體和表達(dá)菌株以及重組蛋白的純化和檢測(cè)方法。本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題的技術(shù)方案如下本發(fā)明的技術(shù)方案之一是一種外源基因在大腸桿菌中異源可溶性表達(dá)的方法，包括以下步驟，構(gòu)建表達(dá)重組外源蛋白的表達(dá)載體，該重組表達(dá)載體與表達(dá)分子伴侶 GroEL/GroES的載體共同轉(zhuǎn)入大腸桿菌表達(dá)菌株中從而獲得可溶性表達(dá)外源蛋白的大腸桿菌基因表達(dá)工程菌，進(jìn)行共表達(dá)。本發(fā)明中，所述的外源蛋白是常規(guī)蛋白，優(yōu)選來(lái)自珍貴橙色束絲放線菌 (Actinosynnema pretiosum)的DAHP合酶。所述的DAHP合酶優(yōu)選氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。所述的外源蛋白的編碼基因可以是常規(guī)，優(yōu)選來(lái)自珍貴橙色束絲放線菌 (Actinosynnema pretiosum)中編碼DAHP合酶的aroF基因。所述的aroF基因優(yōu)選核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。所述的珍貴橙色束絲放線菌(Actinosynnema pretiosum)是常規(guī)，優(yōu)選珍貴橙色束絲放線菌(A. pretiosum)ATCC 31565。本發(fā)明中，所述的表達(dá)分子伴侶GroEL/GroES的載體是常規(guī)，只要能夠在大腸桿菌中表達(dá)分子伴侶GroEL和GroES即可，優(yōu)選pGro7質(zhì)粒。本發(fā)明中，所述的大腸桿菌表達(dá)菌株是常規(guī)的大腸桿菌表達(dá)菌株，優(yōu)選E. COli BL21(DE3)。本發(fā)明中，所述的重組外源蛋白帶有His-tag標(biāo)簽或者其他的純化標(biāo)簽，也可以不帶純化標(biāo)簽，本發(fā)明優(yōu)選帶有His-tag標(biāo)簽，便于重組蛋白表達(dá)后的分離純化。本發(fā)明中，所述的表達(dá)重組外源蛋白的表達(dá)載體優(yōu)選在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)的質(zhì)粒，如IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。較佳的，該表達(dá)重組外源蛋白的表達(dá)載體具有強(qiáng)啟動(dòng)子。強(qiáng)啟動(dòng)子可以使外源蛋白高效表達(dá)。更佳的，該表達(dá)重組外源蛋白的表達(dá)載體優(yōu)選質(zhì)粒pET28a。質(zhì)粒pET28a插入的外源蛋白基因具有強(qiáng)啟動(dòng)子，可以進(jìn)行高表達(dá)。質(zhì)粒pET28a還使表達(dá)的外源蛋白具有His-tag標(biāo)簽，便于后續(xù)的分離純化，并且是IPTG誘導(dǎo)的。本發(fā)明的技術(shù)方案之二是一種重組表達(dá)載體，其含有來(lái)自珍貴橙色束絲放線菌 (Actinosynnema pretiosum)巾IS石馬 DAHP 白勺 aroF 。本發(fā)明中，所述的重組表達(dá)載體較佳的具有強(qiáng)啟動(dòng)子。優(yōu)選的，所述的重組表達(dá)載體中具有使表達(dá)的外源蛋白具有His-tag標(biāo)簽的序列。該表達(dá)載體骨架可以是常規(guī)表達(dá)載體，優(yōu)選質(zhì)粒pEI^8a，從而形成重組表達(dá)載體pET28-aroF。質(zhì)粒pET28a具有強(qiáng)啟動(dòng)子和 His-tag標(biāo)簽，從而可以使aroF基因高效表達(dá)和方便后續(xù)的分離純化。本發(fā)明中，所述的珍貴橙色束絲放線菌(Actinosynnema pretiosum)的DAHP合酶的aroF基因是常規(guī)，優(yōu)選核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。本發(fā)明中，所述的珍貴橙色束絲放線菌(Actinosynnema pretiosum)的DAHP合酶是常規(guī)，優(yōu)選氨基酸序列如SEQ ID N0. 2所示。本發(fā)明中，所述的珍貴橙色束絲放線菌(Actinosynnema pretiosum)是常規(guī)，優(yōu)選珍貴橙色束絲放線菌(A. pretiosum) ATCC 31565。本發(fā)明的技術(shù)方案之三是一種大腸桿菌基因表達(dá)工程菌，其同時(shí)包含表達(dá)分子伴侶蛋白GroEL/GroES的載體和本發(fā)明所述的含有來(lái)自珍貴橙色束絲放線菌 (Actinosynnema pretiosum)中編碼DAHP合酶的aroF基因的重組表達(dá)載體。本發(fā)明中，所述的大腸桿菌基因表達(dá)工程菌的宿主細(xì)胞是常規(guī)的大腸桿菌表達(dá)菌株，優(yōu)選大腸桿菌E. coli BL21(DE3)。本發(fā)明中，所述的表達(dá)分子伴侶蛋白GroEL/GroES的載體是常規(guī)的能夠在大腸桿菌中共表達(dá)分子伴侶蛋白GroEL和GroES的載體，優(yōu)選pGro7質(zhì)粒。本發(fā)明中，所述的大腸桿菌基因表達(dá)工程菌最優(yōu)選大腸桿菌E.coliBL21(DE3)/ pGro7/pET28-aroF。本發(fā)明的技術(shù)方案之四是一種制備重組珍貴橙色束絲放線菌DAHP合酶的方法， 包括以下步驟，培養(yǎng)所述的大腸桿菌基因表達(dá)工程菌，從培養(yǎng)物中獲得重組珍貴橙色束絲放線菌DAHP合酶。本發(fā)明中，所述的大腸桿菌基因表達(dá)工程菌的培養(yǎng)方法是常規(guī)方法，在常規(guī)的大腸桿菌培養(yǎng)基中，在常規(guī)的溫度、PH值條件下進(jìn)行培養(yǎng)。較佳的，所述的培養(yǎng)方法包括將大腸桿菌基因表達(dá)工程菌培養(yǎng)至0D600達(dá)0. 4-0. 6時(shí)，加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。更佳的，將所述的大腸桿菌基因表達(dá)工程菌(優(yōu)選E. coliBL21 (DE3) /pGro7/pET28-aroF)加入含有IOOmg/ L卡那霉素和100mg/L氯霉素并添加了 2g/L L-阿拉伯糖的液體LB培養(yǎng)基中，在220rpm、 37°C條件下培養(yǎng)至0D600達(dá)0. 4-0. 6。誘導(dǎo)表達(dá)的條件較佳的是IPTG終濃度為ImM，溫度為30°C，轉(zhuǎn)速為160rpm，誘導(dǎo)表達(dá)11小時(shí)。本發(fā)明的技術(shù)方案之五是一種所述的大腸桿菌基因表達(dá)工程菌表達(dá)的重組 DAHP合酶的純化方法，包括如下步驟1)將所述的大腸桿菌基因表達(dá)工程菌菌體用PBS緩沖液洗滌，加入結(jié)合緩沖液， 超聲破碎，破碎條件為每15ml超聲99次，超k，停9s，功率為200W ；2)將步驟1)所得超聲破碎后的菌體在12000rpm，4°C條件下離心25min，取其上清加入終濃度為IOmM的咪唑；3)將步驟2)所得混合液上樣，先用含20mM咪唑的洗滌緩沖液洗滌，最終用含 200mM咪唑的洗脫緩沖液收集洗脫的目的蛋白，收集的洗脫液用超濾離心管進(jìn)行超濾離心濃縮。本發(fā)明的技術(shù)方案之六是一種DAHP合酶酶活性的檢測(cè)方法，包括如下步驟1)準(zhǔn)備75 μ 1的反應(yīng)體系，其包括7. 5μ 1 5mM的磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和 1. 5 μ 1 1. 5mM的4-磷酸赤蘚糖(E4P)，DAHP合酶酶液，并加入終濃度為IOOmM的MnSO4,余為 Tris-HCKpH 7. 5)補(bǔ)齊；2)將步驟1)所準(zhǔn)備的反應(yīng)體系置于30°C條件下反應(yīng)lOmin，加入100 μ 1的40% (wt/vol)三氯乙酸終止酶反應(yīng)，之后加入25μ 1的IOOmM高碘酸鉀到混合液中，在37°C下反應(yīng)30min ；3)向步驟2)所得混合液中加入25 μ 1 8% (wt/vol)的Na2SO3以消除多余的氧化劑并加入175 μ 1 2. 16% (wt/vol)的硫代巴比妥酸后，金屬浴100°C條件下煮沸IOmin ；4)將步驟幻所得混合液加入管子冷卻至室溫，離心后取上清200 μ 1置于微量比色皿，在UV-1800分光光度計(jì)中讀取在549nm處的光吸收值。本發(fā)明中，所述的“室溫”是指進(jìn)行試驗(yàn)的操作間的溫度，一般為25 °C。本發(fā)明所用的原料或試劑除特別說(shuō)明之外，均市售可得。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了 DAHP合酶的異源可溶性表達(dá)表達(dá)，具有重要意義。可以為下述實(shí)驗(yàn)的開(kāi)展奠定基礎(chǔ)
(1)實(shí)現(xiàn)體外添加外源氮源來(lái)確定是否會(huì)形成amino-DAHP ；(2)進(jìn)一步進(jìn)行DAHP合酶的酶學(xué)性質(zhì)的研究；(3)為最終實(shí)現(xiàn)AHBA的異源表達(dá)提供了可能性。這對(duì)于合成生物學(xué)和產(chǎn)生以AHBA為前體的抗體類的基因工程菌的構(gòu)建起到了促進(jìn)作用，最終將促進(jìn)臨床抗癌藥物的研發(fā)，從而造福人類健康。


以下結(jié)合

本發(fā)明的特征和有益效果。應(yīng)理解，下列附圖僅用于說(shuō)明本發(fā)明的具體實(shí)施方案而不用于限定本發(fā)明的范圍。圖1為構(gòu)建表達(dá)載體pET28-aroF的過(guò)程示意圖。圖2為所構(gòu)建的可溶性表達(dá)DAHP合酶的共表達(dá)系統(tǒng)圖。圖3為DAHP合酶酶活性檢測(cè)流程圖。圖4(a)為提取得到的A.pretiosum基因組DNA的電泳圖，圖4 (b)為通過(guò)PCR得到的 A. pretiosum 的 aroF 基因片段電泳圖。其中，M =DNAMaker III ；1 :A. pretiosum 的基因組 DNA ；2 =PCR 擴(kuò)增的 A. pretiosum 的 aroF 基因。圖5為重組子pGEM-aroF的雙酶切驗(yàn)證圖。其中，M :DNA maker III ；1 :pGEM/Nde I，EcoR I；2 :pGEM-aroF/Nde I，EcoR I。圖6為重組子pET28_aroF的雙酶切驗(yàn)證圖。其中，M =DNA maker III ；1 :pET28a/ Nde I，EcoR I ；2 :pET28_aroF/Nde I，EcoR I。圖7為DAHP合酶在大腸桿菌中的異源表達(dá)以及分離純化的蛋白電泳圖。其中， DAHPS 的大小為 50. 2kDa。M =Protein marker SM1881 ；1 未誘導(dǎo)的 BL21 (DE3) /pGro7/ pET28a細(xì)胞裂解液；2 加入IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)的BL21 (DE3) /pGro7/pET28-aroF細(xì)胞裂解液； 3 通過(guò)histrap柱子純化的DAHP合成酶。
具體實(shí)施例方式大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是異源表達(dá)的首選表達(dá)系統(tǒng)，但是由于蛋白的可溶性以及蛋白在合成過(guò)程中的折疊不正確等因素極易形成包涵體。雖然包涵體便于分離純化，但是其必須經(jīng)過(guò)體外變性、復(fù)性才能獲得生物活性。該過(guò)程極其復(fù)雜且效率低下。為了異源表達(dá)珍貴橙色束絲放線菌(Actinosynenma pretiosun)aroF基因，得到可溶表達(dá)的由其編碼的DAHP 合酶，本發(fā)明人經(jīng)過(guò)廣泛的研究和反復(fù)的試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)將該aroF基因和分子伴侶共表達(dá)時(shí)， 可以獲得可溶表達(dá)的有活性的DAHP合酶。在大腸桿菌中，轉(zhuǎn)入分別單獨(dú)表達(dá)DAHP合酶和分子伴侶GroEL/GroES的載體，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，實(shí)現(xiàn)了 DAHP合酶的可溶性表達(dá)，具有優(yōu)良的效果。同時(shí)，為了得到純化的酶，本發(fā)明人構(gòu)建的重組DAHP合酶含有his-tag標(biāo)簽，對(duì)其用簡(jiǎn)單親和吸附柱分離的方法進(jìn)行純化，從而得到純度較高的適應(yīng)于酶學(xué)性質(zhì)研究的DAHP 合酶的純酶。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)盡管大腸桿菌有眾多的優(yōu)點(diǎn)，但并非每一種基因都能在其中有效表達(dá)。這歸因于每種基因都有其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)、mRNA的穩(wěn)定性和翻譯效率、蛋白質(zhì)折疊的難易程度、宿主細(xì)胞蛋白酶對(duì)蛋白質(zhì)的降解、外源基因和E. coli在密碼子利用上的主要差別以及蛋白質(zhì)對(duì)宿主的潛在毒性等等。本發(fā)明人經(jīng)過(guò)研究發(fā)現(xiàn)大腸桿菌并不能簡(jiǎn)單表達(dá)來(lái)自珍貴橙色束絲放線菌aroF基因，得到具有活性的DAHP合酶。而利用和分子伴侶的共表達(dá)則可以達(dá)到表達(dá)有活性的DAHP合酶的目的。表達(dá)DAHP合酶的基因在植物和微生物中，赤蘚糖-4-磷酸(erythose-4-phosphate)和磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)在DAHP合酶作用下縮合形成DAHP，DAHP在氨基DAHP合酶的作用下形成AHBA。以 AHBA為起始單位，最終合成安莎霉素。為了實(shí)現(xiàn)DAHP合酶的大腸桿菌表達(dá)，本發(fā)明選擇來(lái)自珍貴橙色束絲放線菌的編碼DAHP合酶的aroF基因?yàn)橥庠椿颍摶虻捏w外表達(dá)對(duì)研究珍貴橙色束絲放線菌合成AHBA的途徑具有重要意義。aroF 基因珍貴橙色束絲放線菌中編碼DAHP合酶的基因是aroF基因。本發(fā)明中的aroF基因優(yōu)選來(lái)源于珍貴橙色束絲放線菌ATCC 31565。將上述基因從珍貴橙色束絲放線菌中分離出來(lái)以后插入可以轉(zhuǎn)化大腸桿菌的表達(dá)載體中，即得到了本發(fā)明的目的載體。本發(fā)明的一具體實(shí)例根據(jù)已報(bào)導(dǎo)的A. pretiosum的aroF基因(GenBank AF056968. 1)信息設(shè)計(jì)引物，通過(guò)pCR擴(kuò)增A. pretiosum基因組中的aroF基因片段，然后通過(guò)T-A克隆連接到pGEM表達(dá)載體上進(jìn)行片段富集后進(jìn)行雙酶切，膠回收目標(biāo)片段后連接到 pET28a載體上。分子伴侶有效的蛋白質(zhì)翻譯后折疊、多肽裝配成寡聚體結(jié)構(gòu)以及蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)位都是由一種被稱為分子伴侶的專職蛋白來(lái)介導(dǎo)的，這個(gè)觀點(diǎn)在目前已經(jīng)達(dá)成共識(shí)。分子伴侶是一類促進(jìn)蛋白折疊的蛋白。利用分子伴侶在E. coli中進(jìn)行基因高效表達(dá)成為近來(lái)研究的熱點(diǎn)。但是，利用分子伴侶所得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果并不一致，而且迄今為止，伴侶分子的共表達(dá)對(duì)基因表達(dá)的影響似乎都具有蛋白質(zhì)特異性。大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)蛋白的折疊主要由兩個(gè)分子伴侶系統(tǒng)負(fù)責(zé)系統(tǒng)I主要含有3個(gè)分子伴侶蛋白DnaK、DnaJ和GrpE，DnaK與新合成的蛋白質(zhì)結(jié)合， DnaJ和GrpE是輔助分子伴侶。系統(tǒng)II包括GroEL和GroES，GroEL是分子伴侶，而GroES 是輔助分子伴侶。分子伴侶能增加一些外源蛋白在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)量。本發(fā)明優(yōu)選分子伴侶蛋白GroEL和GroES。本發(fā)明優(yōu)選表達(dá)分子伴侶蛋白GroEL 和GroES的載體和表達(dá)本發(fā)明目的蛋白的載體共轉(zhuǎn)化大腸桿菌。本發(fā)明中所述的表達(dá)分子伴侶GroEL/GroES的載體是指該載體可以表達(dá)GroEL和GroES兩種蛋白。表達(dá)分子伴侶蛋白GroEL和GroES的載體可以將GroEL和GroES的表達(dá)盒插入載體中制備而得，也可以采用現(xiàn)有技術(shù)，如Takara公司生產(chǎn)的表達(dá)分子伴侶蛋白GroEL/GroES的pGro7質(zhì)粒。本發(fā)明將表達(dá)目的蛋白的重組載體轉(zhuǎn)化進(jìn)已含有可以表達(dá)分子伴侶蛋白GroEL/ GroES的pGro7質(zhì)粒的大腸桿菌DE3(BL21)中培養(yǎng)至0D600達(dá)到0. 4-0. 6時(shí)加入IPTG在 30°C下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)Ilh后可得到可溶性的具有酶活性的DAHP合成酶。重組表達(dá)產(chǎn)物的分離純化本發(fā)明可以采用現(xiàn)有的任何大腸桿菌中外源蛋白的分離純化方法，較佳的采用親和層析法。本發(fā)明在表達(dá)的重組外源DAHP合酶上連接his-Tag標(biāo)簽。用his-Tag標(biāo)簽分離純化，純化速度快，純化產(chǎn)物酶活性高。本發(fā)明收集誘導(dǎo)表達(dá)的菌體，加入裂解緩沖液進(jìn)行超聲裂解，離心取上清，過(guò)histrap(GE health)進(jìn)行分離純化，收集洗脫液，并對(duì)洗脫液進(jìn)行超濾離心濃縮以收集其中的蛋白。酶活檢測(cè)本發(fā)明對(duì)重組表達(dá)的DAHP合酶的酶活檢測(cè)可以采用現(xiàn)有技術(shù)。較佳的，本發(fā)明選用本發(fā)明優(yōu)化的檢測(cè)方法。本發(fā)明優(yōu)化的DAHP合酶催化反應(yīng)中，反應(yīng)體系包括適量的DAHP酶液，7. 5μ 1 5mM的磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和1. 5 μ 1 1. 5mM的4-磷酸赤蘚糖(E4P)，并加入終濃度為 IOOmM 的 MnSO4,其余部分用 Tris-HCl (pH7. 5)補(bǔ)齊。該催化反應(yīng)的產(chǎn)物是DAHP。DAHP被高碘酸鉀氧化后的產(chǎn)物可以與硫代巴比妥酸反應(yīng)產(chǎn)生粉紅色吸收?qǐng)F(tuán)，該粉紅色吸收?qǐng)F(tuán)在M9nm處有特異性吸收值。因此，通過(guò)檢測(cè)該反應(yīng)在549nm處的光吸收值可以確定DAHP的產(chǎn)生量，從而確定酶活性。本發(fā)明在不改變測(cè)量精度的情況下縮小了每一步所用溶液體積，從而減少昂貴底物PEP和E4P的使用量。以下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。應(yīng)理解，以下實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而非用于限定本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，如《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》中所述的條件進(jìn)行。實(shí)施例1可溶共表達(dá)表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建1. 1重組質(zhì)粒載體pET28_aroF的構(gòu)建重組載體pET28-ar0F的構(gòu)建流程如圖1所示提取珍貴橙色束絲放線菌 (A. pretiosum)ATCC 31565的全基因組DNA(見(jiàn)圖4(a))，以其為模版，設(shè)計(jì)引物，利用該引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增aroF基因片段(見(jiàn)圖4 (b))。根據(jù)已報(bào)導(dǎo)的A. pretiosum的aroF基因(GenBank :AF056968. 1)信息設(shè)計(jì)引物， 所設(shè)引物如下5 ‘ -TCACATATGAACTGGACCGTGGACGT-3 ‘(正向引物，引入 Nde I 限制性酶切位占),
/、、、 / 75' -TATGAATTCTCAGGAGCGGAGCATCTCCGCCACC-3'(反向引物，引入EcoR I 限制性酶切位點(diǎn))?；厥誔CR產(chǎn)物，如圖1所示用T4連接酶連接到載體PGEM(Takara)從而得到重組質(zhì)粒pGEM-aroF。用Nde I，EcoR I雙酶切重組質(zhì)粒pGEM_aroF，膠回收其中約為1. 41Λ的 DNA片段與已經(jīng)用同樣的酶雙酶切的載體pET28a進(jìn)行連接過(guò)夜后從而得到重組的表達(dá)載體pET28-aroF。在此過(guò)程中構(gòu)建的pGEM-aroF和pET28_aroF都經(jīng)過(guò)雙酶切驗(yàn)證，見(jiàn)圖5和圖6，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證與GenBank :AF056968. 1中aroF基因序列相同。1. 2將重組質(zhì)粒pET28-aroF導(dǎo)入表達(dá)菌株并與分子伴侶質(zhì)粒pGro7實(shí)現(xiàn)共表達(dá)。共表達(dá)系統(tǒng)如圖2所示，把構(gòu)建的重組子和分子伴侶質(zhì)粒pGro7共同轉(zhuǎn)化到 E. coli BL2KDE3)中進(jìn)行共表達(dá)。其過(guò)程是先把購(gòu)自Takara公司的表達(dá)分子伴侶蛋白 GroES/GroEL的pGro7質(zhì)粒(購(gòu)于Takara公司)轉(zhuǎn)入感受態(tài)E. coli BL21 (DE3)(購(gòu)買(mǎi)自 novagen公司)中，培養(yǎng)制備成感受態(tài)細(xì)胞，再將已經(jīng)構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pET28-aroF轉(zhuǎn)入該感受態(tài)細(xì)胞中，從而構(gòu)建成共表達(dá)系統(tǒng)E. coli BL21 (DE3)/pGro7/pEI^8-aroF。1. 3DAHP合酶的表達(dá)及純化
①表達(dá)將上述構(gòu)建好的共表達(dá)體系E. coli BL21 (DE3) /pGro7/pET28-aroF菌體加入含有100mg/L卡那霉素和100mg/L氯霉素并添加了 2g/L L-阿拉伯糖的液體LB培養(yǎng)基中，在220rpm、37°C條件下培養(yǎng)至0D600達(dá)0. 4-0. 6時(shí)加入終濃度為ImM的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)llh，并將溫度下調(diào)為30°C，轉(zhuǎn)速調(diào)為160rpm。②純化為了保持DAHP合酶的活性，所有純化操作盡量在冰上進(jìn)行。收集上述誘導(dǎo)表達(dá)Ilh的菌體，用PBS緩沖液洗滌3次菌體后加入結(jié)合緩沖液(參照histrapFF crude GE health的說(shuō)明書(shū))，超聲破碎，破碎條件為每15ml超聲99次，超k，停9s，功率為200W。 將破碎后的菌體在12000rpm，4°C下離心25min，取其上清(即粗裂解液)加入終濃度為 IOmM的咪唑。參照histrapFF crude GE health說(shuō)明書(shū)的步驟進(jìn)行上樣，收集穿出液，先用含20mM咪唑的洗滌緩沖液洗滌，然后用含200mM咪唑的洗脫緩沖液洗脫并收集最終洗下的蛋白。收集的洗脫液用超濾離心管(購(gòu)于millipore)進(jìn)行超濾離心和濃縮，同時(shí)把緩沖液更換為T(mén)ris-HCl (pH7. 5)，以便于進(jìn)行之后的酶活性檢測(cè)。 實(shí)施例2DAHP合酶酶活性的檢測(cè)DAHP合酶的活性檢測(cè)采用的是檢測(cè)產(chǎn)物DAHP的產(chǎn)生量法。利用生成的產(chǎn)物 DAHP被高碘酸鉀氧化后的產(chǎn)物可以與硫代巴比妥酸反應(yīng)產(chǎn)生粉紅色吸收?qǐng)F(tuán)的原理對(duì)生成產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，該粉紅色吸收?qǐng)F(tuán)在M9nm處有特異性吸收值，其中光吸收系數(shù)為ε =4. 5 X IO4M-1CiT1tj IU定義為在30°C下，每分鐘產(chǎn)生Ιμπιο DAHP所消耗的酶量。這禾中方法在文獻(xiàn)中已有 艮導(dǎo)(Liu, Y, et al. , Corynebacterium glutamicum contains 3-deoxy-D-arabino-heptulosonate 7-phosphate synthases that display novel biochemical features. Applied and environmental microbiology,2008.74(17) p. M97-550;3)，本發(fā)明對(duì)其進(jìn)行了改良，從而更方便于檢測(cè)和節(jié)省昂貴底物(見(jiàn)圖幻。其中75 μ 1的反應(yīng)體系為7. 5 μ 1 5mM的磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和1. 5 μ 1 1. 5mM的赤蘚糖-4-磷酸(E4P)，適量的DAHP酶液，并加入終濃度為IOOmM MnSO4,其余部分用Tris-HCl pH 7. 5補(bǔ)齊。蛋白質(zhì)檢測(cè)采用Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，以牛血清白蛋白(BSA)作為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照。DAHP合酶在整個(gè)純化過(guò)程中的粗裂解液、穿出液及最終得到的純化酶的蛋白含量、酶活、比酶活以及純化效率的檢測(cè)結(jié)果如下表所示
權(quán)利要求
1.一種外源基因在大腸桿菌中異源可溶性表達(dá)的方法，其特征在于，其包括以下步驟， 構(gòu)建表達(dá)重組外源蛋白的表達(dá)載體，該重組表達(dá)載體與表達(dá)分子伴侶GroEL/GroES的載體共同轉(zhuǎn)入大腸桿菌表達(dá)菌株中從而獲得可溶性表達(dá)外源蛋白的大腸桿菌基因表達(dá)工程菌， 進(jìn)行共表達(dá)。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的外源蛋白是來(lái)自珍貴橙色束絲放線菌(Actinosynnema pretiosum)的 DAHP 合酶。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的表達(dá)分子伴侶GroEL/GroES的載體為 pGro7質(zhì)粒。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的表達(dá)重組外源蛋白的表達(dá)載體是質(zhì)粒 pED8a。
5.一種重組表達(dá)載體，其特征在于，其含有來(lái)自珍貴橙色束絲放線菌中編碼DAHP合酶的aroF基因。
6.一種大腸桿菌基因表達(dá)工程菌，其特征在于，其同時(shí)包含表達(dá)分子伴侶蛋白GroEL/ GroES的載體和如權(quán)利要求5所述的重組表達(dá)載體。
7.一種制備重組珍貴橙色束絲放線菌DAHP合酶的方法，其特征在于，其包括以下步驟培養(yǎng)權(quán)利要求6所述的大腸桿菌基因表達(dá)工程菌，從培養(yǎng)物中獲得重組珍貴橙色束絲放線菌的DAHP合酶。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述的培養(yǎng)方法包括將權(quán)利要求6所述的大腸桿菌基因表達(dá)工程菌培養(yǎng)至0D600達(dá)0. 4-0. 6，加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。
9.一種如權(quán)利要求6所述的大腸桿菌基因表達(dá)工程菌表達(dá)的重組DAHP合酶的純化方法，其特征在于，其包括如下步驟1)將如權(quán)利要求6所述的大腸桿菌基因表達(dá)工程菌菌體，用PBS緩沖液洗滌，加入結(jié)合緩沖液，超聲破碎，破碎條件為每15ml超聲99次，超k，停9s，功率為200W ；2)步驟1)所得超聲破碎后的菌體在12000rpm，4°C條件下離心25min，取其上清加入終濃度為IOmM的咪唑；3)將步驟2)所得混合液上樣，先用含20mM咪唑的洗滌緩沖液洗滌，最終用含200mM咪唑的洗脫緩沖液收集洗脫的目的蛋白，收集的洗脫液用超濾離心管進(jìn)行超濾離心濃縮。
10.一種DAHP合酶酶活性的檢測(cè)方法，其特征在于，其包括如下步驟1)準(zhǔn)備75μ 1的反應(yīng)體系，其包括7. 5 μ 1 5mM的磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和1. 5 μ 1 1. 5mM的4-磷酸赤蘚糖(E4P)，DAHP合酶酶液，并加入終濃度為IOOmM的MnSO4,其余為 Tris-HCKpH 7. 5)補(bǔ)齊；2)將步驟1)所準(zhǔn)備的反應(yīng)體系置于30°C條件下反應(yīng)lOmin，加入100μ 1的40% (wt/ vol)三氯乙酸終止酶反應(yīng)，之后加入25μ 1的IOOmM高碘酸鉀到混合液中，在37°C下反應(yīng) 30min ；3)向步驟2)所得混合液中加入25μ 1 8% (wt/vol)的Na2SO3以消除多余的氧化劑并加入175 μ 1 2. 16% (wt/vol)的硫代巴比妥酸后，金屬浴100°C條件下煮沸IOmin ；4)將步驟幻所得混合液加入管子冷卻至室溫，離心后取上清200μ 1置于微量比色皿， 在UV-1800分光光度計(jì)中讀取在549nm處的光吸收值。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種由珍貴橙色束絲放線菌(Actinosynenma pretiosun)aroF基因編碼的DAHP合酶的異源可溶性表達(dá)方法及所用的重組載體和基因表達(dá)工程菌。該方法通過(guò)將aroF基因連接到表達(dá)載體上形成重組表達(dá)載體，并將之轉(zhuǎn)化到已含有編碼分子伴侶蛋白GroEL/GroES的質(zhì)粒pGro7的大腸桿菌中，誘導(dǎo)表達(dá)后可得到可溶性的具有酶活性的DAHP合酶，之后進(jìn)行分離純化和酶活檢測(cè)。本發(fā)明首次實(shí)現(xiàn)了珍貴橙色束絲放線菌DAHP合酶的異源可溶性表達(dá)并得到純化的DAHP合酶；分離純化和酶活檢測(cè)的方法較之前有了較大改進(jìn)。本發(fā)明對(duì)于研究珍貴橙色束絲放線菌(A.pretiosum)的莽草酸合成途徑和氨基莽草酸途徑有著重要意義。
文檔編號(hào)C12R1/19GK102505023SQ20111036896
公開(kāi)日2012年6月20日 申請(qǐng)日期2011年11月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月18日
發(fā)明者劉念念, 周燕, 張婕, 李婷蘭, 花強(qiáng), 范宇翔, 韋柳靜, 馬娜 申請(qǐng)人:華東理工大學(xué)