專利名稱：一種利用木質(zhì)纖維素發(fā)酵產(chǎn)生微生物油脂的長孢被孢霉pfy及其產(chǎn)生微生物油脂的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用預處理后的木質(zhì)纖維素為底物發(fā)酵生產(chǎn)不飽和脂肪酸的新菌種。
背景技術(shù)：
通常用微生物發(fā)酵方法對這些廢棄材料進行處理利用時存在生產(chǎn)效率低和生產(chǎn)成本高等問題，而且需要結(jié)合其他的物理或化學方法對材料進行預處理，有時需要多步酶解處理和發(fā)酵才能得到產(chǎn)品。利用酶解糖化液進行發(fā)酵生產(chǎn) ，雖然微生物可以很容易的利用酶解產(chǎn)生的糖化液進行發(fā)酵，但是這樣需要纖維素酶的加入并因此增加了生產(chǎn)成本。在利用木質(zhì)類纖維素發(fā)酵生產(chǎn)的產(chǎn)品以纖維素乙醇報道較多，但是利用其發(fā)酵生產(chǎn)油脂的相關(guān)報道較少，而利用單一菌種對木質(zhì)纖維素直接進行發(fā)酵生產(chǎn)生物產(chǎn)品的研究更少。微生物油脂(microbial oil)又稱單細胞油脂(single cell oil, SCO),主要是由酵母、霉菌、細菌和藻類等微生物利用各種碳源和氮源，輔以無機鹽而合成的油脂。微生物油脂脂肪酸組成和一般植物油的組成大致相同，以油酸、棕擱酸、亞油酸和硬脂酸等C16、 C18系脂肪酸為主。與生產(chǎn)動、植物油脂相比，微生物油脂的生產(chǎn)有許多優(yōu)點原料來源廣泛，價格低廉，而且能利用食品工業(yè)的廢棄物，減輕了對環(huán)境的污染；生產(chǎn)周期短，能連續(xù)大規(guī)模生產(chǎn)；同時不受季節(jié)、氣候變化的限制。由于微生物油脂中含有多不飽和脂肪酸，多不飽和脂肪酸具有許多生理功能，被廣泛應用于食品、醫(yī)藥、化工等領(lǐng)域。另外，利用微生物生產(chǎn)生物柴油已成為國內(nèi)外生物能源領(lǐng)域研究的重點。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種株能直接高效利用木質(zhì)纖維素生產(chǎn)微生物油脂的菌種。為了實現(xiàn)上述目的本發(fā)明采用如下技術(shù)方案
利用木質(zhì)纖維素發(fā)酵產(chǎn)生微生物油脂的長孢被孢霉PFY及其產(chǎn)生微生物油脂的方法， 其特征在于包括以下步驟
A、將長孢被孢霉菌株接種到含有木質(zhì)纖維素的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度 20°C-35°C，搖床轉(zhuǎn)速120 rpm-180 rpm，氮源為尿素，培養(yǎng)4-7天；
B、將發(fā)酵后的物質(zhì)烘干、粉碎后，采用石油醚萃取干物中的粗油脂。所述長孢被孢霉為被孢霉屬真菌，分類命名為長孢被孢霉，經(jīng)中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏中心登記入冊編號為5070。將獲取的土樣梯度稀釋后，稀釋濃度為原樣的KT1至10_6，取90-110 Ul稀釋液均勻涂布到剛果紅培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，挑取生長較快且有透明圈的菌落進行純化培養(yǎng)；篩選得到上述的長孢被孢霉。所述的利用木質(zhì)纖維素發(fā)酵產(chǎn)生微生物油脂的長孢被孢霉PFY及其產(chǎn)生微生物油脂的方法，其特征在于所述的剛果紅培養(yǎng)基配方為=K2HPO4 0. 5-1.0g/L，MgSO40. 2-0. 5g/L，微晶纖維素粉 1.0-2. Og/L，剛果紅 0. 1_0. 5g/L，瓊脂 10_20g/L 和明膠 l_2g/ L0所述的利用木質(zhì)纖維素發(fā)酵產(chǎn)生微生物油脂的長孢被孢霉PFY及其產(chǎn)生微生物油脂的方法，其特征在于所述的木質(zhì)纖維素選自農(nóng)作物秸桿、木質(zhì)材料及其下腳料、纖維類的腐殖質(zhì)、植物果實或果實殘渣。所述的利用木質(zhì)纖維素發(fā)酵產(chǎn)生微生物油脂的長孢被孢霉PFY及其產(chǎn)生微生物油脂的方法，其特征在于所述的木質(zhì)纖維素中木質(zhì)素含量不高于20%的木質(zhì)素基材料，不需要對其進行預處理就可直接進行培養(yǎng)。
所述的利用木質(zhì)纖維素發(fā)酵產(chǎn)生微生物油脂的長孢被孢霉PFY及其產(chǎn)生微生物油脂的方法，其特征在于所述的木質(zhì)纖維素的培養(yǎng)基為(g/L):木質(zhì)類纖維素10-50，尿素 1-5，MgS04 0. 1-0. 5，K2HPO4 0. 5-1. 0，CaCl2 0. 5-1. O。所述的利用木質(zhì)纖維素發(fā)酵產(chǎn)生微生物油脂的長孢被孢霉PFY及其產(chǎn)生微生物油脂的方法，其特征在于所述的菌體培養(yǎng)后的干物中粗油脂為不飽和脂肪酸酯為主的混合脂肪酸酯，含量為10%-30%。所篩菌種已在中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)申請了專利菌種保藏， 保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，保藏日期為2011年7月18日，分類命名為長孢被孢霉(Mortierella elongata))，保藏編號為 CGMCC No. 5070。本發(fā)明的優(yōu)點
(1)所篩菌種來自于自然界，屬于野生型菌種，抗逆性強，易于培養(yǎng)和生長；
(2)對木質(zhì)纖維素進行高效快速利用。菌種可以對未預處理的木質(zhì)類纖維素和預處理后的木質(zhì)類纖維素進行直接發(fā)酵，不需要再對其進行酶解糖化，實現(xiàn)了單一菌種的同步糖化發(fā)酵，發(fā)酵工藝簡單，發(fā)酵周期較短；
(3)菌種在發(fā)酵過程中可以積累含量較豐富的油脂，并且其中不飽和脂肪酸的含量較
聞;
(4)發(fā)酵所得的產(chǎn)品不僅成本較低廉而且產(chǎn)品的營養(yǎng)價值很高，且可以用木質(zhì)類的廢棄物替代葡萄糖進行高附加值產(chǎn)品的發(fā)酵生產(chǎn)。
具體實施例方式實施例I :將土樣梯度稀釋后，分別取0.2mL均勻涂布到剛果紅培養(yǎng)基上，在30°C 下培養(yǎng)，每天觀察培養(yǎng)基上的菌落生長情況，記錄菌落的大小和形成的透明圈的直徑。挑取生長較快的菌落，采用三分區(qū)劃線法再次接種到剛果紅培養(yǎng)基上進行分離純化培養(yǎng)，獲得單菌落，選取生長迅速的單菌落作為目標微生物進行保存。其中，剛果紅培養(yǎng)基的配方為(g/L) =K2HPO4 0. 5-1. 0，MgSO4 0. 2-0. 5，微晶纖維素粉 I. 0-2. 0，剛果紅 0. 1-0. 5，瓊脂 10-20，明膠 1-2，pH 自然。實施例2 :對微生物進行觀察發(fā)現(xiàn)該菌株菌絲起初為白色，而后變成灰綠色，菌落局限，菌絲匍匐生長；菌絲有隔膜，有分枝，無假根；孢子梗直立，孢子囊呈棒狀或橢球狀； 菌絲透明或有淺綠色，孢子串生，孢子淺綠色。經(jīng)ITS全序列分析結(jié)果可知該菌株為長孢被袍篤(Mortierella eIongatalsp.。長孢被孢霉為被孢霉屬真菌；分類命名為長孢被孢霉， 經(jīng)中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏中心登記入冊編號為5070。
實施例3 :以未經(jīng)過預處理的稻草秸桿為底物進行發(fā)酵，在發(fā)酵培養(yǎng)基中接種所篩菌種長孢被孢霉PFY，30°C下培養(yǎng)5天，發(fā)酵完成后將搖瓶中的物質(zhì)過濾、烘干，烘干后的質(zhì)量約為投料量的70%,干物中油脂含量為4%左右。實施例4 :用“三氧化硫氣體處理秸桿的方法”專利技術(shù)(專利號200910116615) 對稻草秸桿進行原位微熱爆預處理，將預處理后的稻草秸桿作為底物進行發(fā)酵，在液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基上接種所篩菌株，在30°C下培養(yǎng)5天，搖床轉(zhuǎn)速為170r/min，發(fā)酵完成后將搖瓶中的物質(zhì)過濾、烘干，烘干后的質(zhì)量約為投料量的50%。用有機溶劑提取其中的油脂、粗油脂產(chǎn)率為20%左右。實施例5 :以粉碎后的玉米芯為底物，不經(jīng)過剝離木質(zhì)素的預處理過程，接種所篩菌種，在30°C下在30°C下培養(yǎng)5天，搖床轉(zhuǎn)速為170r/min，發(fā)酵完成后將搖瓶中的物質(zhì)過濾、烘干，用有機溶劑提取干物中的油脂，測定其中的粗油脂含量，經(jīng)測定，其含量為25%左右。實施例6 :將獲得的油脂作甲酯化處理，之后進行GC-MS分析，經(jīng)分析，該油脂中不飽和脂肪酸含量為59%，亞油酸含量約為27%，甲酯化方法采用國標法，分析檢測條件為 E1:70ev，接口溫度280°C，離子源溫度230°C，全掃描，掃描范圍20m/z-330m/z，溶劑延遲 3. 5min。
權(quán)利要求
1.一種利用木質(zhì)纖維素發(fā)酵產(chǎn)生微生物油脂的長孢被孢霉PFY及其產(chǎn)生微生物油脂的方法，其特征在于包括以下步驟 將獲取的土樣梯度稀釋后，稀釋濃度為原樣的 ο—1至10_6，取90-110 μ I稀釋液均勻涂布到剛果紅培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，挑取生長較快且有透明圈的菌落進行純化培養(yǎng)； 將步驟A所篩菌種接種到含有木質(zhì)纖維素的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度20°C-35°C，搖床轉(zhuǎn)速120 rpm-180 rpm，氮源為尿素，培養(yǎng)4-7天； 將發(fā)酵后的物質(zhì)烘干、粉碎后，采用石油醚萃取干物中的粗油脂； 經(jīng)ITS全序列分析，所篩菌株為被孢霉屬真菌；分類命名為長孢被孢霉，經(jīng)中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏中心登記入冊編號為5070。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的利用木質(zhì)纖維素發(fā)酵產(chǎn)生微生物油脂的長孢被孢霉PFY及其產(chǎn)生微生物油脂的方法，其特征在于所述的剛果紅培養(yǎng)基配方為=K2HPO4 O. 5-1. Og/L，MgSO4 O. 2-0. 5g/L，微晶纖維素粉 I. 0-2. Og/L,剛果紅 O. 1-0. 5g/L，瓊脂 10_20g/L 和明膠l_2g/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的利用木質(zhì)纖維素發(fā)酵產(chǎn)生微生物油脂的長孢被孢霉PFY及其產(chǎn)生微生物油脂的方法，其特征在于所述的木質(zhì)纖維素選自農(nóng)作物秸桿、木質(zhì)材料及其下腳料、纖維類的腐殖質(zhì)、植物果實或果實殘渣。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用木質(zhì)纖維素發(fā)酵產(chǎn)生微生物油脂的長孢被孢霉PFY及其產(chǎn)生微生物油脂的方法，其特征在于所述的木質(zhì)纖維素中木質(zhì)素含量不高于20%的木質(zhì)素基材料，不需要對其進行預處理就可直接進行培養(yǎng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的利用木質(zhì)纖維素發(fā)酵產(chǎn)生微生物油脂的長孢被孢霉PFY及其產(chǎn)生微生物油脂的方法，其特征在于所述的木質(zhì)纖維素的培養(yǎng)基為(g/L):木質(zhì)類纖維素10-50，尿素 1-5，MgS04 O. 1-0. 5，K2HPO4 O. 5-1. O, CaCl2 O. 5-1. O。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的利用木質(zhì)纖維素發(fā)酵產(chǎn)生微生物油脂的長孢被孢霉PFY及其產(chǎn)生微生物油脂的方法，其特征在于所述的菌體培養(yǎng)后的干物中粗油脂為不飽和脂肪酸酯為主的混合脂肪酸酯，含量為10%-30%。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用木質(zhì)纖維素發(fā)酵產(chǎn)生微生物油脂的長孢被孢霉PFY及其產(chǎn)生微生物油脂的方法，其主要是通過剛果紅培養(yǎng)基培養(yǎng)篩選菌種，然后接種到含有木質(zhì)纖維素的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，然后將發(fā)酵后的物質(zhì)烘干、粉碎后，用有機溶劑萃取法提取干物中的粗油脂；最后經(jīng)ITS全序列分析，所篩菌株為被孢霉屬真菌；該菌種生長迅速，能高效的利用木質(zhì)纖維素，發(fā)酵完成后木質(zhì)纖維素利用率高達90%，發(fā)酵完成后干物中含有較多的微生物油脂，其中不飽和脂肪酸的含量為59%。
文檔編號C12R1/645GK102618447SQ201210004558
公開日2012年8月1日 申請日期2012年1月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月10日
發(fā)明者姚力蓉, 姚日生, 張遙, 張鵬, 王淮, 鄧勝松 申請人:合肥工業(yè)大學, 安徽安生生物化工科技有限責任公司