專利名稱：一種提高傳代細(xì)胞系凍存細(xì)胞復(fù)蘇率的復(fù)蘇方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及體外傳代細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，更具體涉及一種提高傳代細(xì)胞系凍存細(xì)胞復(fù)蘇率的復(fù)蘇方法。
背景技術(shù)：
在生物學(xué)技術(shù)飛速發(fā)展的當(dāng)今，人們在細(xì)胞生物學(xué)及其相關(guān)學(xué)科的研究中，越來越多的運(yùn)用細(xì)胞培養(yǎng)增殖技術(shù)，將有研究意義或有應(yīng)用前景的細(xì)胞采用低溫度進(jìn)行長期保存數(shù)年，數(shù)十年甚至百年，一旦需要，可隨時(shí)對所保存的細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇，恢復(fù)其完整的形態(tài)結(jié)構(gòu)與生物學(xué)特性，供生命科學(xué)研究實(shí)驗(yàn)。復(fù)蘇率是指在長期冷凍保存狀態(tài)下的細(xì)胞，經(jīng)過復(fù)蘇過程，恢復(fù)其活性與生物學(xué)特性的細(xì)胞數(shù)量占凍存細(xì)胞總數(shù)的百分比。影響細(xì)胞復(fù)蘇率的因素有三部分降溫冷凍過程、低溫下保存過程及升溫復(fù)蘇過程。凍存細(xì)胞復(fù)蘇后16-M小時(shí)，在普通光學(xué)顯微鏡下觀察當(dāng)復(fù)蘇率小于40%時(shí)，見活細(xì)胞較少而且形態(tài)不規(guī)則，生長繁殖速度緩慢，甚至停止生長死亡，導(dǎo)致細(xì)胞保存失敗； 當(dāng)復(fù)蘇率大于40%且小于70%時(shí)，顯示部分成活細(xì)胞，細(xì)胞大小不均勻，生長繁殖速度慢， 培養(yǎng)5-7天才能生長成單層細(xì)胞；當(dāng)復(fù)蘇率大于80%時(shí)，顯示成活細(xì)胞較多，細(xì)胞形態(tài)正常，生長繁殖速度快，培養(yǎng)2-3天就能生長成單層細(xì)胞。綜上所述，升溫復(fù)蘇過程，是直接影響人工培養(yǎng)細(xì)胞增殖是否成功和順利進(jìn)行的一個(gè)關(guān)鍵技術(shù)。復(fù)蘇率的高低是直接影響細(xì)胞生長質(zhì)量與增殖周期的重要因素。所以復(fù)蘇的方法對復(fù)蘇率有重要和直接的影響作用。數(shù)十年來，大量國內(nèi)外生物細(xì)胞學(xué)技術(shù)相關(guān)書籍，介紹常規(guī)的復(fù)蘇方法如下操作1、從液氮中取出細(xì)胞凍存管，置37°C水浴，180-300秒融化，加入適配營養(yǎng)液，800 轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，棄上清，加入適配生長液適量，靜止37°C培養(yǎng)；2、16-M小時(shí)鏡下觀察復(fù)蘇后的細(xì)胞狀態(tài)，可見約60-70%的細(xì)胞貼壁生長，細(xì)胞形態(tài)邊緣不光滑，有凹凸，大小不均勻，折光性差，培養(yǎng)液中有大量懸浮圓縮的無活力細(xì)胞；3、更換適配生長液，繼續(xù)培養(yǎng)至48小時(shí)；4、鏡下觀察細(xì)胞未生長成單層，60-80%融合，繼續(xù)培養(yǎng)至72-96小時(shí)，細(xì)胞完全融合，按比例傳代培養(yǎng)；5、完成細(xì)胞復(fù)蘇生長繁殖周期。以上廣泛使用的復(fù)蘇溫度37°C，再者由于聚丙烯凍存管在實(shí)際中的大量廣泛應(yīng)用，造成傳熱性的差異，一般要180-300秒才能溶解完全，每分鐘復(fù)溫25 50°C，在排除其它影響因素的情況下，復(fù)蘇率為40-80%。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種提高傳代細(xì)胞系凍存細(xì)胞復(fù)蘇率的復(fù)蘇方法，該方法能保持細(xì)胞壁的完整，溶解速度更快，以達(dá)到使細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)與生物學(xué)特性恢復(fù)的更完整，復(fù)蘇時(shí)間短，且復(fù)蘇率高。為了達(dá)到上述發(fā)明目的，本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明提供一種提高傳代細(xì)胞系凍存細(xì)胞復(fù)蘇率的復(fù)蘇方法，其特征在于步驟如下(1)從液氮中取出細(xì)胞凍存管，復(fù)蘇溫度46-67°C下水浴30_70秒，加入適配營養(yǎng)液，800轉(zhuǎn)/分，離心5分，棄上清，得離心后的細(xì)胞；(2)離心后的細(xì)胞用適配營養(yǎng)液稀釋，無菌取細(xì)胞，用臺盼藍(lán)染色，計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞總數(shù)，計(jì)算復(fù)蘇率為95-98% ；(3)其余細(xì)胞加入適配生長液，靜止37°C培養(yǎng)5-7小時(shí)，至90_95%的細(xì)胞貼壁；(4)更換細(xì)胞適配生長液繼續(xù)培養(yǎng)48-72小時(shí)，至細(xì)胞完全融合生長成單層；按比例傳代培養(yǎng)；完成細(xì)胞復(fù)蘇生長繁殖周期。進(jìn)一步，所述的復(fù)蘇溫度為55_60°C。在復(fù)蘇過程中，冰晶在-50°C以上時(shí)進(jìn)行得較快，因而緩慢解凍往往會由于重結(jié)晶而造成細(xì)胞死亡，迅速升溫可使重結(jié)晶的晶體數(shù)量減至最少，也可使細(xì)胞處在高濃度溶質(zhì)中的時(shí)間縮到最短，以減少細(xì)胞的“滲透壓休克”，恢復(fù)細(xì)胞的正常生理功能。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，復(fù)蘇溫度提高，復(fù)蘇時(shí)間縮短，溶解速度更快，復(fù)蘇速度分別可達(dá)100-250°C / min，復(fù)蘇時(shí)間在30-70秒，6小時(shí)后鏡下觀察復(fù)蘇后的細(xì)胞狀態(tài)，可見約90-95%的細(xì)胞貼壁，細(xì)胞形態(tài)圓形，大小均勻，折光性好，有部分分支生長狀態(tài)，培養(yǎng)液中有少量懸浮圓縮的無活力細(xì)胞；最終的細(xì)胞復(fù)蘇率達(dá)90-98%，提高了傳代細(xì)胞系凍存細(xì)胞的復(fù)蘇率，保證了細(xì)胞生長質(zhì)量，保持了細(xì)胞壁的完整，縮短了細(xì)胞復(fù)蘇的增殖周期。通過下列實(shí)施例將更具體的說明本發(fā)明，但是所述實(shí)施例僅是為了說明本發(fā)明， 而不是以任何形式限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中的適配營養(yǎng)液、適配生長液為申請人在GIBCO公司購買得到。實(shí)施例中所用的傳代細(xì)胞系可為現(xiàn)有技術(shù)中的相應(yīng)傳代細(xì)胞系。實(shí)施例1 BHK21細(xì)胞的復(fù)蘇方法1、從液氮中取出BHK21細(xì)胞凍存管，置67°C水浴復(fù)蘇，32秒融化，加入適配營養(yǎng)液 (MEM)，800轉(zhuǎn)/分離心5分鐘；2、棄上清，用適配營養(yǎng)液(MEM)適當(dāng)稀釋，無菌取樣用1 %臺盼藍(lán)染色，計(jì)算復(fù)蘇率為97. 6% ；3、其余細(xì)胞加入適配生長液(含10% FBS的MEM)適量，靜止37°C培養(yǎng)；4、6小時(shí)后鏡下觀察復(fù)蘇后的細(xì)胞狀態(tài)，可見約93-95%的細(xì)胞貼壁，細(xì)胞形態(tài)圓形，大小均勻，折光性好，有部分分支生長狀態(tài)，培養(yǎng)液中有少量懸浮圓縮的無活力細(xì)胞；5、更換細(xì)胞適配生長液(含10% FBS的MEM)，繼續(xù)培養(yǎng)至M小時(shí)鏡下觀察，細(xì)胞未生長成單層，85-90%融合，繼續(xù)培養(yǎng)至36小時(shí)鏡下觀察，細(xì)胞完全融合生長成單層，在48小時(shí)細(xì)胞致密單層時(shí)按比例傳代培養(yǎng)；6、完成細(xì)胞復(fù)蘇生長繁殖周期。實(shí)施例2 IBRS-2細(xì)胞的復(fù)蘇方法1、從液氮中取出IBRS-2細(xì)胞凍存管，置46°C水浴復(fù)蘇，62秒融化，加入適配營養(yǎng)液(MEM)，800轉(zhuǎn)/分離心5分鐘；2、棄上清，用適配營養(yǎng)液(MEM)適當(dāng)稀釋，無菌取樣用1 %臺盼藍(lán)染色，計(jì)算復(fù)蘇率為95. 2% ；3、其余細(xì)胞加入適配生長液(含10% FBS的MEM)適量，靜止37°C培養(yǎng)；4、6小時(shí)后鏡下觀察復(fù)蘇后的細(xì)胞狀態(tài)，可見約90-95%的細(xì)胞貼壁，細(xì)胞形態(tài)圓形，大小均勻，折光性好，培養(yǎng)液中有少量懸浮圓縮的無活力細(xì)胞；5、更換細(xì)胞適配生長液(含10% FBS的MEM)，繼續(xù)培養(yǎng)至M小時(shí)鏡下觀察，細(xì)胞未生長成單層，80-85%融合，繼續(xù)培養(yǎng)至36小時(shí)鏡下觀察，細(xì)胞完全融合生長成單層，在 48小時(shí)致密單層時(shí)按比例傳代培養(yǎng)；6、完成細(xì)胞復(fù)蘇生長繁殖周期。實(shí)施例3 PK15細(xì)胞的復(fù)蘇方法1、從液氮中取出H(15細(xì)胞凍存管，置60°C水浴復(fù)蘇，42秒融化，加入適配營養(yǎng)液 (DMEM)，800轉(zhuǎn)/分離心5分鐘；2、棄上清，用適配營養(yǎng)液(DMEM)適當(dāng)稀釋，無菌取樣用1 %臺盼藍(lán)染色，計(jì)算復(fù)蘇率在96. 7%之間；3、其余細(xì)胞加入適配生長液(含10% FBS的DMEM)適量，靜止37°C培養(yǎng)；4、6小時(shí)后鏡下觀察復(fù)蘇后的細(xì)胞狀態(tài)，可見約95-97%的細(xì)胞貼壁，細(xì)胞形態(tài)圓形，大小均勻，折光性好，培養(yǎng)液中有極少量懸浮圓縮的無活力細(xì)胞；5、更換細(xì)胞適配生長液(含10% FBS的DMEM)，繼續(xù)培養(yǎng)至M小時(shí)鏡下觀察，細(xì)胞100%融合，生長成單層，繼續(xù)培養(yǎng)至36-48小時(shí)鏡下觀察，細(xì)胞致密單層，可按比例傳代培養(yǎng)；6、完成細(xì)胞復(fù)蘇生長繁殖周期。實(shí)施例4 Vero細(xì)胞的復(fù)蘇方法1、從液氮中取出Vero細(xì)胞凍存管，置50°C水浴復(fù)蘇，55秒融化，加入適配營養(yǎng)液 (DMEM)，800轉(zhuǎn)/分離心5分鐘；2、棄上清，用適配營養(yǎng)液(DMEM)適當(dāng)稀釋，無菌取樣用1 %臺盼藍(lán)染色，計(jì)算復(fù)蘇率在98. 1% ；3、其余細(xì)胞加入適配生長液(含10% FBS的DMEM)適量，靜止37°C培養(yǎng)；4、6小時(shí)后鏡下觀察復(fù)蘇后的細(xì)胞狀態(tài)，可見約95-98%的細(xì)胞貼壁，細(xì)胞形態(tài)圓形，大小均勻，折光性好，有部分分支生長狀態(tài)，培養(yǎng)液中有極少量懸浮圓縮的無活力細(xì)胞；5、更換細(xì)胞適配生長液(含10% FBS的DMEM)，繼續(xù)培養(yǎng)至M小時(shí)鏡下觀察，細(xì)胞生長成單層，100 %融合，繼續(xù)培養(yǎng)至36-48小時(shí)鏡下觀察，細(xì)胞生長成致密單層，可按比例傳代培養(yǎng)；6、完成細(xì)胞復(fù)蘇生長繁殖周期。
實(shí)施例5 PK15細(xì)胞復(fù)蘇方法與現(xiàn)有技術(shù)方法的對比
權(quán)利要求
1.一種提高傳代細(xì)胞系凍存細(xì)胞復(fù)蘇率的復(fù)蘇方法，其特征在于步驟如下(1)從液氮中取出細(xì)胞凍存管，置46-67°C水浴復(fù)蘇，融化30-70秒，加入適配營養(yǎng)液， 800轉(zhuǎn)/分，離心5分，棄上清，得離心后的細(xì)胞；(2)離心后的細(xì)胞用適配營養(yǎng)液稀釋，無菌取樣，用臺盼藍(lán)染色，計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞總數(shù)，計(jì)算復(fù)蘇率為95-98% ；(3)其余細(xì)胞加入適配生長液，靜止37°C培養(yǎng)5-7小時(shí)，至90-95%的細(xì)胞貼壁；(4)更換細(xì)胞適配生長液繼續(xù)培養(yǎng)48-72小時(shí)，至細(xì)胞完全融合生長成單層；按比例傳代培養(yǎng)；完成細(xì)胞復(fù)蘇生長繁殖周期。
2.權(quán)1所述的復(fù)蘇方法，其特征在于所述的復(fù)蘇溫度為55-60°C。
全文摘要
本發(fā)明屬于細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及體外傳代細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)，更具體涉及一種提高傳代細(xì)胞系凍存細(xì)胞復(fù)蘇率的復(fù)蘇方法。通過改變凍存細(xì)胞復(fù)蘇的溫度，縮短了復(fù)蘇時(shí)間，提高了凍存細(xì)胞的復(fù)蘇率，可達(dá)90-98％，保證了細(xì)胞生長質(zhì)量，縮短了細(xì)胞復(fù)蘇的增殖周期。
文檔編號C12N5/00GK102559573SQ20121000430
公開日2012年7月11日 申請日期2012年1月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月9日
發(fā)明者劉長輝, 王敏, 邊程 申請人:北京大北農(nóng)科技集團(tuán)股份有限公司, 福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司