專(zhuān)利名稱(chēng)：一種從細(xì)菌中分離純化大質(zhì)粒的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種從細(xì)菌中分離純化大質(zhì)粒的方法，屬于生物化學(xué)與分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。可用于細(xì)菌大質(zhì)粒的提取和鑒定。
背景技術(shù)：
質(zhì)粒是染色體外可以進(jìn)行自我復(fù)制的遺傳元件，大小范圍從11Λ至2001Λ以上不等，廣泛存在于各類(lèi)生物體的細(xì)胞中，尤其在細(xì)菌中更為常見(jiàn)，編碼細(xì)菌生存非必須的某些生物學(xué)性狀，如性菌毛、細(xì)菌素、毒素和耐藥性等，一般不整合到細(xì)菌染色體上?，F(xiàn)在常用的質(zhì)粒大多數(shù)是經(jīng)過(guò)改造或人工構(gòu)建的，常含抗生素抗性基因，是分子生物學(xué)重組DNA技術(shù)中重要的工具。分離提取細(xì)菌中的質(zhì)粒是研究和改造質(zhì)粒的第一步，對(duì)于大小在101Λ以?xún)?nèi)的小質(zhì)粒通常采用堿裂解法提取質(zhì)粒DNA，其基本原理為當(dāng)菌體在NaOH和SDS溶液中裂解時(shí)，蛋白質(zhì)與DNA發(fā)生變性，當(dāng)加入中和液后，質(zhì)粒DNA分子由于較小能夠迅速?gòu)?fù)性，呈溶解狀態(tài)，離心時(shí)留在上清中；染色體DNA由于較大不容易復(fù)性而與蛋白質(zhì)一起呈絮狀，離心時(shí)可沉淀下來(lái)。因此對(duì)于細(xì)菌中的大質(zhì)粒，由于其大小和染色體相比差別沒(méi)有小質(zhì)粒那么大，所以傳統(tǒng)的堿裂解法用于提取細(xì)菌中的大質(zhì)粒并不奏效。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服傳統(tǒng)的堿裂解法不能用于提取細(xì)菌大質(zhì)粒的不足，本發(fā)明提供了一種簡(jiǎn)單實(shí)用的從細(xì)菌中分離純化大質(zhì)粒的方法。該方法利用脈沖場(chǎng)凝膠電泳技術(shù)結(jié)合膠回收法能有效的提取細(xì)菌中的大質(zhì)粒DNA。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是
(1)培養(yǎng)細(xì)菌挑取單個(gè)菌落接種于細(xì)1 LB液體培養(yǎng)基，37°C振蕩(250rpm)過(guò)夜培養(yǎng)后離心(4000rpm, IOmin, 4°C)，收集菌體。(2)制作膠塊用 PIV 緩沖液(IOmM Tris, IM NaCl, PH7. 6)洗滌后，取 Iml PIV 緩沖液重懸細(xì)菌，與Iml 2%的低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠混勻(溫度保持在50°C)，灌入膠塊澆制槽中制作細(xì)菌膠塊。(3)消化蛋白將膠塊放入新鮮溶菌液Lysis buffer (6mM Tris，0. IM EDTA， IM NaCl,0. 5% Brij-58,0. 2%脫氧膽酸鈉，0· 5% SDS, RNaseA 20μ g/ml，溶菌酶 lmg/ml) 中37°C輕搖過(guò)夜，ES緩沖液(0. 5M EDTA ,1% SDS)洗滌模塊后用ESP緩沖液(含蛋白酶 KlOO μ g/ml的ES) 50°C過(guò)夜消化已去除蛋白質(zhì)。(4)電泳分離用 TE 緩沖液(IOmM Tris-HCl, ImM EDTA, PH8. 0)洗滌上述經(jīng) ESP 緩沖液消化過(guò)夜的膠塊，最后膠塊上脈沖場(chǎng)凝膠電泳儀進(jìn)行電泳，電泳條件為電壓6V/ cm，角度120°，起始轉(zhuǎn)換時(shí)間范圍l_10s，最后轉(zhuǎn)換時(shí)間范圍為20_60s，電泳時(shí)間范圍為 6-24h,電泳液緩沖液為0. 5XTBE，溫度保持在14°C。電泳后經(jīng)EB染色以觀察大質(zhì)粒和染色體的分離情況。(5)切膠回收①用手術(shù)刀切取含目的大質(zhì)粒DNA的瓊脂糖凝膠塊并稱(chēng)重，先加入3倍膠重的溶膠液 QXl，再加入2倍膠重的雙蒸水。②振蕩30秒使QIAEX II顆粒重懸。如果膠塊中的DNA總量不超過(guò)2 μ g，則向樣品溶膠液中加入10μ 1的QIAEX II顆粒，然后50°C保溫lOmin，每?jī)煞昼娬袷幰淮问诡w粒重懸，讓膠塊充分熔化釋放出DNA結(jié)合到QIAEX II顆粒上。此時(shí)混合物的顏色應(yīng)為黃色，如果是橙色或紫色的話，應(yīng)加入PH 5.0 3M的乙酸鈉溶液調(diào)節(jié)其顏色至黃色，同時(shí)再繼續(xù)保溫至少5min。③13000rpm離心30秒，小心地吸取上清，棄之。④加入QXl緩沖液500 μ 1，振蕩重懸顆粒，洗滌顆粒，13000rpm離心30秒，小心地
吸取上清，棄之。此步以洗去殘留的凝膠。⑤加入500μ 1 緩沖液 TE (IOmM Tris-HCl, ImM EDTA，ΡΗ8. 0)，振蕩重懸顆粒，洗滌顆粒，13000rpm離心30秒，小心地吸取上清，棄之。此步以洗去殘留的鹽分。⑥室溫干燥10-15分鐘，直到顆粒變白，加入pH 8.5 IOmM Tris-HCl緩沖液 20μ1以溶解大質(zhì)粒DNA，取2μ1進(jìn)行普通瓊脂糖凝膠電泳以鑒定所提取的質(zhì)粒DNA的純度，其余于_20°C保存?zhèn)溆谩１景l(fā)明的有益效果本發(fā)明利用脈沖場(chǎng)凝膠電泳技術(shù)結(jié)合膠回收法能有效的分離純化細(xì)菌中的大質(zhì)粒DNA，克服了傳統(tǒng)的堿裂解法不能用于提取細(xì)菌大質(zhì)粒的弊端。本發(fā)明彌補(bǔ)了傳統(tǒng)堿裂解法在提取細(xì)菌質(zhì)粒上的不足，實(shí)現(xiàn)了細(xì)菌中大質(zhì)粒的有效提取。對(duì)研究細(xì)菌中大質(zhì)粒的生物學(xué)特性和功能，以及改造和開(kāi)發(fā)利用細(xì)菌中的大質(zhì)粒，都具有極其重要的作用。


圖1.脈沖場(chǎng)凝膠電泳分離傷寒沙門(mén)菌GIFU10007大質(zhì)粒pBSSBl的電泳圖譜； 圖2.從傷寒沙門(mén)菌GIFU10007中提取的大質(zhì)粒pBSSBl的電泳鑒定圖。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所涉及的線性質(zhì)粒pBSSBl (Baker S, Hardy J, Sanderson KE, Quail Μ, Goodhead I， Kingsley RA, Parkhill J, Stocker B, Dougan G (2007) A novel linear plasmid mediates flagellar variation in Salmonella Typhi. PLoS Pathog 3: e59.)、傷寒沙門(mén)菌GIFU10007(Zhang H, Sheng X，Xu S et al (2009) Global transcriptional response of Salmonella enterica serovar Typhi to anti-z66 antiserum. FEMS Microbiol Lett四8:51-55)保存于江蘇大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)研究所。實(shí)施例以分離純化傷寒沙門(mén)菌一線性質(zhì)粒pBSSBl (27kb)為例說(shuō)明 具體過(guò)程為
(1)培養(yǎng)細(xì)菌挑取傷寒沙門(mén)菌GIFU10007 (S. Typhi)的單個(gè)菌落接種于細(xì)1 LB液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩(250rpm)過(guò)夜培養(yǎng)后離心(4000rpm，lOmin, 4°C)，收集菌體。(2)制作膠塊用 PIV 緩沖液(IOmM Tris, IM NaCl, PH7. 6)洗滌后，取 Iml PIV 緩沖液重懸細(xì)菌，與Iml 2%的低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠混勻(溫度保持在50°C)，灌入膠塊澆制槽中制作傷寒沙門(mén)菌膠塊。(3)消化蛋白將傷寒沙門(mén)菌膠塊放入新鮮溶菌液Lysis buffer (6mM Tris, 0. IM EDTA , IM NaCl，0. 5% Brij_58，0. 2%脫氧膽酸鈉，0· 5% SDS，RNaseA 20yg/ml，溶菌酶lmg/ml)中37°C輕搖過(guò)夜，ES緩沖液(0. 5M EDTA ,1% SDS)洗滌模塊后用ESP緩沖液 (含蛋白酶1(10(^8/1111的ES) 50°C過(guò)夜消化已去除蛋白質(zhì)。(4)電泳分離用TE緩沖液洗滌上述經(jīng)ESP緩沖液消化過(guò)夜的膠塊，最后膠塊上脈沖場(chǎng)凝膠電泳儀進(jìn)行電泳，電泳條件為電壓6V/cm，角度120°，起始轉(zhuǎn)換時(shí)間ls，最后轉(zhuǎn)換時(shí)間35s，電泳時(shí)間18h，電泳液緩沖液為0. 5XTBE，溫度保持在14°C。電泳后經(jīng)EB染色， 大質(zhì)粒和染色體的分離情況如圖1所示，成功將傷寒沙門(mén)菌中的271Λ線性大質(zhì)粒pBSSBl 和細(xì)菌染色體實(shí)現(xiàn)了分離。(5)切膠回收
①用手術(shù)刀切取圖1中的大質(zhì)粒PBSSBl的瓊脂糖凝膠塊并稱(chēng)重得200mg，先加入 600mg的溶膠液QXl，再加入400mg的雙蒸水。②振蕩30秒使QIAEX II顆粒重懸，隨即向樣品溶膠液中加入10 μ 1的QIAEX II顆粒，然后50°C保溫lOmin，每?jī)煞昼娬袷幰淮问诡w粒重懸，讓膠塊充分熔化釋放出DNA結(jié)合到QIAEX II顆粒上，此時(shí)混合物的顏色為黃色。③13000rpm離心30秒，小心地吸取上清，棄之。④加入QXl緩沖液500 μ 1，振蕩重懸顆粒，洗滌顆粒，13000rpm離心30秒，小心地
吸取上清，棄之。此步以洗去殘留的凝膠。⑤加入500μ 1 緩沖液 TE (IOmM Tris-HCl, ImM EDTA，ΡΗ8. 0)，振蕩重懸顆粒，洗滌顆粒，13000rpm離心30秒，小心地吸取上清，棄之。此步以洗去殘留的鹽分。⑥室溫干燥10分鐘，顆粒變白，然后加入pH 8.5 IOmM Tris-HCl緩沖液20μ1溶解大質(zhì)粒PBSSB1，取2μ1進(jìn)行普通瓊脂糖凝膠電泳，其余于-20°C保存?zhèn)溆谩Ｈ鐖D2所示， 本實(shí)施例成功提取了高純度的大小為27 kb的線性大質(zhì)粒pBSSBl。最后，需要指出的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的具體實(shí)施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實(shí)施例，還可以通過(guò)改變脈沖電泳的條件以分離純化細(xì)菌中各種大小不同的大質(zhì)粒。 依據(jù)本發(fā)明的構(gòu)想對(duì)上述實(shí)施方式進(jìn)行的各種有效的變形，均應(yīng)認(rèn)為在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1. 一種從細(xì)菌中分離純化大質(zhì)粒的方法，其特征在于步驟為(1)培養(yǎng)細(xì)菌挑取單個(gè)菌落接種于細(xì)1LB液體培養(yǎng)基，37°C振蕩過(guò)夜培養(yǎng)后離心，收集菌體；(2)制作膠塊用PIV緩沖液(IOmMTris, IM NaCl, PH7. 6)洗滌后，取Iml PIV緩沖液重懸細(xì)菌，與Iml 2%的低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠混勻，溫度保持在50°C，灌入膠塊澆制槽中制作細(xì)菌膠塊；(3)消化蛋白將膠塊放入新鮮溶菌液Lysisbuffer中37°C輕搖過(guò)夜，ES緩沖液洗滌模塊后用ESP緩沖液50°C過(guò)夜消化已去除蛋白質(zhì)；所述Lysis buffer的成分為6mM Tris, 0. IM EDTA，IM NaCl，0. 5% Brij_58，0. 2%脫氧膽酸鈉，0. 5% SDS，RNaseA 20yg/ml，溶菌酶lmg/ml ；所述ESP緩沖液是含蛋白酶KlOO μ g/ml的ES緩沖液；(4)電泳分離用TE緩沖液充分洗滌上述經(jīng)ESP緩沖液消化過(guò)夜的膠塊，最后膠塊上脈沖場(chǎng)凝膠電泳儀進(jìn)行電泳，電泳條件為電壓6V/cm，角度120°，起始轉(zhuǎn)換時(shí)間范圍 Ι-lOs，最后轉(zhuǎn)換時(shí)間范圍為20-60s，電泳時(shí)間范圍為6-Mh，電泳液緩沖液為0. 5XTBEJj^ 度保持在14°C ；電泳后經(jīng)EB染色以觀察大質(zhì)粒和染色體的分離情況；(5)切膠回收:①用手術(shù)刀切取含目的大質(zhì)粒DNA的瓊脂糖凝膠塊并稱(chēng)重，先加入3倍膠重的溶膠液 QXl，再加入2倍膠重的雙蒸水；②振蕩30秒使QIAEXII顆粒重懸，如果膠塊中的DNA總量不超過(guò)2 μ g，則向樣品溶膠液中加入10μ 1的QIAEX II顆粒，然后50°C保溫lOmin，每?jī)煞昼娬袷幰淮问诡w粒重懸，讓膠塊充分熔化釋放出DNA結(jié)合到QIAEX II顆粒上；此時(shí)混合物的顏色應(yīng)為黃色，如果是橙色或紫色的話，應(yīng)加入PH 5.0 3M的乙酸鈉溶液調(diào)節(jié)其顏色至黃色，同時(shí)再繼續(xù)保溫至少 5min ；③13000rpm離心30秒，小心地吸取上清，棄之；④加入QXl緩沖液500μ 1，振蕩重懸顆粒，洗滌顆粒，13000rpm離心30秒，小心地吸取上清，棄之，此步以洗去殘留的凝膠；⑤加入500μ 1緩沖液ΤΕ，振蕩重懸顆粒，洗滌顆粒，13000rpm離心30秒，小心地吸取上清，棄之，此步以洗去殘留的鹽分；⑥室溫干燥10-15分鐘，直到顆粒變白，加入pH8.5 IOmM Tris-HCl緩沖液20 μ 1以溶解大質(zhì)粒DNA，取2 μ 1進(jìn)行普通瓊脂糖凝膠電泳以鑒定所提取的質(zhì)粒DNA的純度，其余于-20°C保存?zhèn)溆谩?br> 全文摘要
一種從細(xì)菌中分離純化大質(zhì)粒的方法，屬于生物化學(xué)與分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明首先將細(xì)菌包埋在低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠中，然后在膠內(nèi)用溶菌酶對(duì)細(xì)菌進(jìn)行破菌，用蛋白酶消化膠內(nèi)細(xì)菌的蛋白，再利用脈沖場(chǎng)凝膠電泳對(duì)細(xì)菌的DNA進(jìn)行分離，最后通過(guò)膠回收獲得細(xì)菌中的大質(zhì)粒DNA。通過(guò)本發(fā)明分離純化獲得的大質(zhì)粒DNA具有純度高、結(jié)構(gòu)完整等特點(diǎn)。本發(fā)明對(duì)于研究細(xì)菌中大質(zhì)粒的生物學(xué)特性和功能，以及改造和開(kāi)發(fā)利用細(xì)菌中的大質(zhì)粒，都具有極其重要的作用。
文檔編號(hào)C12N15/10GK102533730SQ20121000677
公開(kāi)日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2012年1月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月11日
發(fā)明者倪斌, 張海方, 徐順高, 杜鴻, 生秀梅, 許化溪, 黃新祥 申請(qǐng)人:江蘇大學(xué)