專利名稱：一種極耐熱木糖苷酶及其編碼基因和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)及纖維原料水解領(lǐng)域，具體涉及一種極耐熱木糖苷酶及其編碼基因和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
木聚糖是植物細(xì)胞壁半纖維素的土要成分，是除纖維素之外自然界中最為豐富的可再生資源之一。木糖就存在于半纖維素多縮戊糖中，是亟待開發(fā)的重要可再生資源。如果將半纖維素生物降解為木糖和少量其它單糖，可以用作基本碳源生產(chǎn)各種發(fā)酵產(chǎn)品、工業(yè)酒精及糠醛制備等。同時(shí)，木糖的衍生物木糖醇還可作為食品添加劑，如用于口香糖、糖果及于尿病患者的甜味劑等。木糖苷酶是木聚糖降解酶系中的較為關(guān)鍵的多糖水解酶，通過隨機(jī)切割木寡糖的 β -I, 4-糖苷鍵，將木寡糖降解為木糖。由于木糖苷酶可以將寡糖降解為木糖，因此可作為一種高效的工業(yè)酶制劑用于木糖及木糖衍生物的生產(chǎn)，因此具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一種極耐熱木糖苷酶，以使其滿足使用要求。本發(fā)明的另一目的是提供一種編碼上述極耐熱木糖苷酶的核苷酸序列。本發(fā)明還有一目的是提供上述一種極耐熱木糖苷酶的應(yīng)用。技術(shù)方案為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下
一種極耐熱木糖苷酶，氨基酸序列如SEQ NO 1所示。一種極耐熱木糖苷酶，氨基酸序列為權(quán)利要求I所述的SEQ NO :1序列中的氨基酸經(jīng)過一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失及添加形成的具有木糖苷酶活性的衍生蛋白質(zhì)。一種編碼上述的極耐熱木糖苷酶的基因，DNA序列如SEQ NO 2所示。一種可表達(dá)上述的極耐熱木糖苷酶的重組體系，在所述的重組體系上克隆有如SEQ NO 2所示的DNA序列；所述的重組體系包括重組質(zhì)粒和重組菌。一種擴(kuò)增上述的編碼極耐熱木糖苷酶的基因的方法，所使用的引物對(duì)為
Xylo-I :5’ - GGAATTCCATATGGATCTTTACAAGAATCCAAATGTAC-3’ ；
Xylo-2 :5’ -CCGCTCGAGCTCGATCTTTGTATTTGTGAAGAAAAC-3’。上述的極耐熱木糖苷酶在酶解木寡糖中的應(yīng)用。酶解反應(yīng)溫度為75-100°C，PH5. 0-7. 5。所述的木寡糖來源于纖維原料中的半纖維素，包括木二糖、木三糖和木四糖。上述的重組體系在酶解木寡糖中的應(yīng)用。上述的極耐熱木糖苷酶在酶解玉米秸桿的木寡糖中的應(yīng)用。有益效果與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明所提供的木糖苷酶具有優(yōu)良的耐熱性能。在95°C、pH為6.0的條件下酶活性最高，比酶活達(dá)到117. 6U/mg ;該蛋白酶在溫度為75-100°C, pH為5. 0-7. 5的范圍內(nèi)，均具有較高的酶活。該木糖苷酶的耐熱性能極高，在85°C反應(yīng)體系中，保溫Ih酶活性基本保持不變。上述特性使得本發(fā)明得到的木糖苷酶比現(xiàn)有木糖苷酶具有更大的優(yōu)越性，適用于80°C以上高溫、偏中性的pH條件下木寡糖的降解，具有潛在的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。


圖I是木糖苷酶Tth xylo的SDS-PAGE蛋白電泳 圖2是Tth xylo的最適溫度結(jié)果 圖3是Tth xylo的最適pH結(jié)果 圖4是Tth xylo的熱穩(wěn)定性結(jié)果 圖5是Tth xylo降解玉米秸桿半纖維素TLC圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。以下實(shí)施例中所使用的材料、試劑等，若無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。實(shí)施例I嗜熱陸地?zé)崛邷厣衽劬蚪MDNA的提取
采用嗜熱陸地?zé)崛邷厣衽劬鶷hermo toga thermarum DSM5069 (購(gòu)自德國(guó)微生物菌種保藏中心)新鮮菌體10g，懸于5mL 50mM Tris緩沖溶液中(pH8. 0)，混勻后在37°C放置20min，然后加入2mL 10%SDS，55°C放置5min，用等體積的酚-氯仿(24:1)抽提一次，取上清液加入2倍體積的無水乙醇，于_20°C放置30min，4°C 13000rpm離心20min，收集沉淀。沉淀溶于 0. 5mL TE 緩沖液(ρΗ8· 0，IOmM Tris, ImM EDTA)，加入 10mg/mL RNase 3μ L,37°C保溫lh，用等體積的酚-氯仿(24:1)抽提一次，取上清加入2倍體積的無水乙醇，于_20°C放置30min，4°C 13000rpm離心20min，收集沉淀，真空冷凍干燥，用0. 5mL超純水溶解。實(shí)施例2木糖苷酶基因Tth xylo的制備
可采用如下方法制備Tth xylo基因，也可以采用人工合成的方式得到。認(rèn)Thermotoga thermarum DSM5069的總DNA (實(shí)施例I制備)為模版，用下述引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增
Xylo-I :5’ - GGAATTCCATATGGATCTTTACAAGAATCCAAATGTAC-3’ ；
Xylo-2 :5’ -CCGCTCGAGCTCGATCTTTGTATTTGTGAAGAAAAC-3’ ；
引物合成時(shí)，Tth-I引入Nde I酶切位點(diǎn)，Tth-2引入Xho I酶切位點(diǎn)。PCR 反應(yīng)體系I μ L T. thermarum 基因組 DNA, 1μ L Tth-1, IuL Tth-2, 25 μ LPremix ExTaq, 22 μ L 超純水。PCR 反應(yīng)條件94°C變性 5min ;94°C變性 30sec，52°C退火 30sec，72°C延伸 3min，30Cycles ;72°C延伸 IOmin ;4°C保溫。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)產(chǎn)量和特異性，并用PCR產(chǎn)物回收試劑盒進(jìn)行純化(BI0MIGA，上海)。實(shí)施例3重組克隆、表達(dá)載體pET-20b-7iA xylo的構(gòu)建與驗(yàn)證
將純化過的PCR產(chǎn)物(實(shí)施例2制備)、pET-20b (Novagen)用分別Nde I和Xho I雙酶切，瓊脂糖電泳回收酶切酶切PCR及載體大片段。割膠回收后的目的片段與載體，經(jīng)濃縮加入8yL無菌水重懸，加入IyL IOXLigase Buffei^PlyL Ligase，于16°C連接過夜。用連接反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌pET-20b，然后涂于含IOOy g/mL Amp (氨芐青霉素)的培養(yǎng)皿，37°C培養(yǎng) 10-12h。從轉(zhuǎn)化平板上挑取多個(gè)單菌落，采用BI0MIGA的質(zhì)粒小量提取試劑盒提取質(zhì)粒。對(duì)獲得的質(zhì)粒雙酶切驗(yàn)證并對(duì)獲得的重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果顯示，pET-20b載體中插入了所克隆的目的片段(核苷酸長(zhǎng)度為2322 bp)，進(jìn)而得到重組克隆、表達(dá)載體pET-20b-m xylo, Tth xylo的核苷酸如SEQ NO 2所示，其編碼的氨基酸序列如SEQ NO I所示，將該蛋白命名為Tth xylo。實(shí)施例4重組木糖苷酶Tth xylo的表達(dá)與純化 將重組克隆、表達(dá)載體pET-20b-Tth xylo (實(shí)施例3制備)電轉(zhuǎn)至宿主菌疋coliBL21(DE3) (Novagen)，獲得含有重組質(zhì)粒的重組菌。將單菌落的重組菌接種于5mL含有100 μ g/ml氨節(jié)青霉素的Luria-Bertani broth (LB)培養(yǎng)基,在37°C溫度下,200rpm震蕩培養(yǎng)8-12h。將上述4mL菌液接種于含400mL培養(yǎng)基的1000 mL搖瓶中，37°C溫度下，200rpm震蕩培養(yǎng)，當(dāng)吸光度達(dá)到0. 6-0. 8時(shí)，加人200 μ L的IM IPTG，并在30°C溫度下，120rpm誘導(dǎo)表達(dá)10-12h。用高速冷凍離心機(jī)將培養(yǎng)液在4°C下一下以13000rpm離心15min，收集菌體。用50mL超純水洗漆并在4°C下一下以13000rpm離心15min,回收菌體,接著用20mLIXBinding Buffer 重懸(0.5M NaCl, 20mM Tris_HCl，5mM imidazole，ρΗ7· 9)，在冰水浴中，用超聲波破碎機(jī)破碎細(xì)菌細(xì)胞，并在4°C下13000rpm離心15min，得到含木糖苷酶Tthxylo的粗提液。粗提液先經(jīng)70°C加熱處理30min的熱處理，除去不耐熱的雜蛋白，再用Ni-NTA親和層析柱進(jìn)行純化(方法見His-Bind Kits,Novagen)。純化酶純度的鑒定和分子量的測(cè)定采用SDS-PAGE方法進(jìn)行，結(jié)果見圖1，I即為化過后的Tth xylo蛋白，分子量約為85 kDa，與理論值相近。實(shí)施例5重組木糖苷酶Tth xylo的酶學(xué)性質(zhì)分析
酶活定義為1 min內(nèi)催化4-硝基苯基-β -D-吡喃木糖苷(ρΝΡΧ)產(chǎn)生I μ mo I對(duì)硝基苯酚(pNP)所需的酶量。( I)最適溫度
用PH值為6.0的0. IM咪唑-鄰笨二甲酸氫鉀緩沖液稀釋實(shí)施4制得的純酶液，用稀釋后的酶液進(jìn)行酶活測(cè)定。酶活測(cè)定反應(yīng)體系為200 μ L，20mM的4-硝基苯基-β -D-吡喃木糖苷(PNPX) 10 μ L，180 μ L 0. IM咪唑-鄰笨二甲酸氫鉀緩沖液和10 μ L稀釋酶液組成；反應(yīng)體系的pH為6. O。將反應(yīng)體系在60-1001溫育201^11后，加入60(^1^ IM Na2CO3試劑終止反應(yīng)，測(cè)定410nm的吸光值。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，取平均值作圖，結(jié)果如圖2所示，研究結(jié)果表明在95°C時(shí)，木糖苷酶具有最高的酶活性，為117. 6 U/mg ;將此溫度下的酶活反應(yīng)體系的吸光值最為相對(duì)活性100%，其它溫度下酶活反應(yīng)體系的吸光值與此最高酶活性體系的吸光值作為相對(duì)活性。其中，在溫度75-100°C的反應(yīng)體系中酶活性較高。(2)最適 pH
酶活測(cè)定反應(yīng)體系為200 μ L，20mM的4-硝基苯基-β -D-吡喃木糖苷(ρΝΡΧ) 10 μ L，180 μ L ρΗ4. 0-ρΗ8. 5的0. IM咪唑-鄰笨二甲酸氫鉀緩沖液和10 μ L稀釋酶液(同上)組成。將反應(yīng)體系在95°C溫育20 min后，加入600 μ L IM Na2CO3試劑終止反應(yīng)，測(cè)定410nm的吸光值，實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，取平均值。結(jié)果如圖3所示，研究結(jié)果表明，在pH為6. O時(shí)，木糖苷酶具有最高的酶活性，為117.6 U/mg;將此pH值下的酶活反應(yīng)體系的作為相對(duì)活性100%，其它pH值下酶活反應(yīng)體系的吸光值與此最高酶活性體系的吸光值的比值作為相對(duì)活性。在PH5. 0-7. 5的條件下，酶活較高。( 3 )重組酶熱穩(wěn)定性
用PH值為6. O的O. IM咪唑-鄰笨二甲酸氫鉀緩沖液稀釋實(shí)施例4制得的純酶液，用稀釋后的酶液進(jìn)行酶活測(cè)定。將稀釋酶液在75°C、80°C、85°C、90°C和95°C分別水浴30 min、60 min,90 min和120 min，測(cè)定酶的殘存酶活。酶活測(cè)定反應(yīng)體系中pH為6. 0，測(cè)定溫度為95°C。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，取平均值。結(jié)果如圖4所示，研究結(jié)果顯示，85 °C處理I h未見酶活下降，可見該木聚糖在85°C條件下熱穩(wěn)定非常好，該酶在75°C溫育2 h酶活未見下降。實(shí)施例6重組木糖苷酶Tth xylo的應(yīng)用研究
重組木糖苷酶Tth xylo對(duì)木寡糖的降解研究,具體步驟如下所述 (I)用pH6. O的上述緩沖液配制1%木二糖、木三糖及木四糖各lmL，混勻后形成1%的混合液。吸取100 μ L混合液，加入上述的緩沖溶液90 μ L與含10 μ L的純化酶于100 μ L的反應(yīng)體系中，75 °C水浴震蕩O. 5h、lh、2h和3h。(2)分別收集上述lh、2h、3h和4h水解液于_20°C的冰箱中保存。(3)配置上述水解液適宜的TLC的展層劑和顯色劑，展層劑中正丁醇乙酸水=2 I :1，顯色劑為將Ig的3，5-二羥基甲苯加入到IOOmL的硫酸/甲醇溶液(2 8)中配制而成。(4)用毛細(xì)吸管蘸取少量的1%的木I-木4糖的混合液及上述樣品，分別點(diǎn)至寬度為10cm、長(zhǎng)度為20cm的玻璃娃膠板上，點(diǎn)完樣后用吹分機(jī)吹干并將娃膠板放置于上述展層劑的層析缸中。(5) 3h后取出玻璃板先風(fēng)干，再放置于100°C的干燥箱中烘干，在通風(fēng)櫥中用噴壺將硅膠板均勻噴灑，接著在再放置于100°c的干燥箱中烘干。結(jié)果如圖5所示，M為木I-木4的標(biāo)準(zhǔn)樣品，1、2、3和4分別為O. 5h、lh、2h和3h
的水解液。研究結(jié)果表明，重組木糖苷酶Tth xylo可以快速有效地將木二糖、木三糖及木四糖降解為木糖。因此，此木糖苷酶Tth xylo適用于玉米秸桿等原料的木糖生產(chǎn)。
權(quán)利要求
1.一種極耐熱木糖苷酶，其特征在于氨基酸序列如SEQ NO 1所示。
2.一種極耐熱木糖苷酶，其特征在于氨基酸序列為權(quán)利要求I所述的SEQ NO 1序列中的氨基酸經(jīng)過一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失及添加形成的具有木糖苷酶活性的衍生蛋白質(zhì)。
3.一種編碼權(quán)利要求I所述的極耐熱木糖苷酶的基因，其特征在于DNA序列如SEQNO 2所示。
4.一種可表達(dá)權(quán)利要求I所述的極耐熱木糖苷酶的重組體系，其特征在于在所述的重組體系上克隆有如SEQ NO 2所示的DNA序列；所述的重組體系包括重組質(zhì)粒和重組菌。
5.一種擴(kuò)增權(quán)利要求3所述的編碼極耐熱木糖苷酶的基因的方法，其特征在于所使用的引物對(duì)為Xylo-I :5’ - GGAATTCCATATGGATCTTTACAAGAATCCAAATGTAC-3’ ；Xylo-2 :5’ -CCGCTCGAGCTCGATCTTTGTATTTGTGAAGAAAAC-3’。
6.權(quán)利要求I或2所述的極耐熱木糖苷酶在酶解木寡糖中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于酶解反應(yīng)溫度為75-100°C，pH5.0-7. 5。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述的木寡糖來源于纖維原料中的半纖維素，包括木二糖、木三糖和木四糖。
9.權(quán)利要求4所述的重組體系在酶解木寡糖中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求I所述的極耐熱木糖苷酶在酶解玉米秸桿的木寡糖中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種極耐熱木糖苷酶及其編碼基因和應(yīng)用，該極耐熱木糖苷酶的氨基酸序列如SEQNO1所示。該木糖苷酶具有優(yōu)良的耐熱性能。在95℃、pH為6.0的條件下酶活性最高，比酶活達(dá)到117.6U/mg；該蛋白酶在溫度為75-100℃、pH為5.0-7.5的范圍內(nèi)，均具有較高的酶活。該木糖苷酶的耐熱性能極高，在85℃反應(yīng)體系中，保溫1h酶活性基本保持不變。上述特性使得本發(fā)明得到的木糖苷酶比現(xiàn)有木糖苷酶具有更大的優(yōu)越性，適用于80℃以上高溫、偏中性的pH條件下木寡糖的降解，具有潛在的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12P19/14GK102864132SQ201210333818
公開日2013年1月9日 申請(qǐng)日期2012年9月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月11日
發(fā)明者王飛, 時(shí)號(hào), 李迅, 錢方軍 申請(qǐng)人:南京林業(yè)大學(xué), 沭陽祥泰生物能源科技有限公司