專利名稱：一種極耐熱木聚糖酶基因及其表達(dá)蛋白與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)及生物質(zhì)利用領(lǐng)域，具體涉及一種極耐熱木聚糖酶基因及其表達(dá)蛋白與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
木聚糖是植物細(xì)胞壁半纖維素的主要成分，是除纖維素之外自然界中最為豐富的可再生資源。木聚糖酶是木聚糖降解酶系中的最為關(guān)鍵的多糖水解酶，通過隨機(jī)切割木聚糖的β-1，4-糖苷鍵，將木聚糖水解為木寡糖、低聚木糖及少量的木糖和阿拉伯糖。由于木聚糖酶在造紙工業(yè)中紙漿的預(yù)漂白、作為添加劑動(dòng)物提高飼料及烘焙食品的質(zhì)量及以木聚糖為原料生產(chǎn)功能性低聚木糖等方面都體現(xiàn)出優(yōu)良特性，因此可作為一種高效的工業(yè)酶制 劑。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一種極耐熱木聚糖酶基因，以使其滿足使用要求。本發(fā)明的另一目的是提供一種上述極耐熱木聚糖酶基因的表達(dá)蛋白。本發(fā)明還有一目的是提供上述一種極耐熱木聚糖酶基因的應(yīng)用。技術(shù)方案為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下
一種極耐熱木聚糖酶基因，其DNA序列如SEQ NO 1所示。上述的極耐熱木聚糖酶基因表達(dá)的極耐熱木聚糖酶，其氨基酸序列如SEQ NO 2所示。一種極耐熱木聚糖酶，氨基酸序列為權(quán)利要求2所述的SEQ NO :2序列中的氨基酸經(jīng)過一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失及添加形成的具有木聚糖酶活性的衍生蛋白質(zhì)。一種重組體系，在所述的重組體系上克隆有如SEQ NO 1所示的DNA序列；所述的重組體系包括重組質(zhì)粒和重組菌。一種用于擴(kuò)增極耐熱木聚糖酶基因的引物，所使用的引物對為
Tth-I :5’ -GGAATTCCATATGGCAGTTGTGGCAAACTACGATTTTGAGAC-3’ ；
Tth-2 :5’ -CCGCTCGAGCTTAGTCAGGATCAGGTTG-3’ 。上述的極耐熱木聚糖酶在酶解木聚糖中的應(yīng)用。酶解反應(yīng)溫度為70-100°C，PH5. 5-8. 5。所述的木聚糖來源于纖維原料中的半纖維素，包括櫸木木聚糖、樺木木聚糖和燕麥木聚糖。上述的重組體系在酶解木聚糖中的應(yīng)用。上述的極耐熱木聚糖酶在酶解玉米秸桿中的應(yīng)用。有益效果與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明所提供的木聚糖酶具有極強(qiáng)的耐熱性能和中性pH條件下高活性的特性，在95°C、pH7. O的條件下酶活性最高，比酶活達(dá)到145. 8U/mg ；該蛋白酶在溫度為70°C -100°C、pH為5. 5-8. 5的范圍內(nèi)，均具有較高的酶活。該木聚糖酶的耐熱性能極高，在85°C、添加終濃度為5mM Ca2+的反應(yīng)體系中，保溫2h酶活性保持不變。上述特性使得本發(fā)明得到的木聚糖酶比現(xiàn)有木聚糖酶具有更大的優(yōu)越性，適用于80°C以上高溫、中性PH條件下半纖維素的降解，具有潛在的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。


圖I是木聚糖酶Tth xynlOA的SDS-PAGE蛋白電泳 圖2是Tth xynlOA的最適溫度結(jié)果 圖3是Tth xynlOA的最適pH結(jié)果 圖4是Tth xynlOA的熱穩(wěn)定性結(jié)果 圖5是Tth xynlOA降解玉米秸桿半纖維素TLC圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。以下實(shí)施例中所使用的材料、試劑等，若無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。實(shí)施例I木聚糖酶基因Tth xynlOA的制備
可采用如下人工合成的方式制備似基因，也可以以thermarum的總DNA為模版通過PCR的方式得到。本研究的木聚糖酶基因RA 似通過上海捷瑞生物工程有限公司合成，基因序列如SEQ NO 1所示
實(shí)施例2木聚糖酶基因Tth xynlOA的亞克隆 用下述引物對PCR擴(kuò)增實(shí)施例I中的木聚糖酶基因
Tth-I :5’ -GGAATTCCATATGGCAGTTGTGGCAAACTACGATTTTGAGAC-3’ ；
Tth-2 :5’ -CCGCTCGAGCTTAGTCAGGATCAGGTTG-3’ ；
上述引物合成時(shí)，Tth-I引入Nde I酶切位點(diǎn)，Tth-2引入Xho I酶切位點(diǎn)。PCR 反應(yīng)體系I μ L T. thermarum 基因組 DNA, 1μ L Tth-1, IuL Tth-2, 25 μ LPremix ExTaq, 22 μ L 超純水。PCR 反應(yīng)條件94°C變性 5min ;94°C變性 30sec，52°C退火 30sec，72°C延伸 3min，30Cycles ;72°C延伸 IOmin ;4°C保溫。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)量和特異性，并用PCR產(chǎn)物回收試劑盒進(jìn)行純化(BIOMIGA，上海)。實(shí)施例3重組克隆、表達(dá)載體pET-20b-7iA xynlOA的構(gòu)建與驗(yàn)證
將純化過的PCR產(chǎn)物(實(shí)施例2制備)、pET-20b (Novagen)用分別Nde I和Xho I雙酶切，瓊脂糖電泳回收酶切酶切PCR及載體大片段。割膠回收后的目的片段與載體，經(jīng)濃縮加入8yL無菌水重懸，加入IyL IOXLigase Buffei^PlyL Ligase，于16°C連接過夜。用連接反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌pET-20b，然后涂于含IOOy g/mL Amp (氨芐青霉素)的培養(yǎng)皿，37°C培養(yǎng) 10-12h。從轉(zhuǎn)化平板上挑取多個(gè)單菌落，采用BIOMIGA的質(zhì)粒小量提取試劑盒提取質(zhì)粒。對獲得的質(zhì)粒雙酶切驗(yàn)證并對獲得的重組質(zhì)粒進(jìn)行測序。測序結(jié)果顯示，pET-20b載體中插入了所克隆的目的片段(核苷酸長度為3474bp)，進(jìn)而得到重組克隆、表達(dá)載體pET-20b-RAxynlOAAth xynlOA的DNA序列如SEQ NO :1所示,其表達(dá)的蛋白(極耐熱木聚糖酶)的氨基酸序列如SEQ NO 2所示，將該蛋白命名為Tth XynlOA0實(shí)施例4重組木聚糖酶Tth xynlOA的表達(dá)與純化
將重組克隆、表達(dá)載體pET-20b-RA xynlOA (實(shí)施例3制備)電轉(zhuǎn)至宿主菌疋coliBL21(DE3) (Novagen)，獲得含有重組質(zhì)粒的重組菌。將單菌落的重組菌接種于5mL含有100 μ g/ml氨節(jié)青霉素的Luria-Bertani broth (LB)培養(yǎng)基,在37°C溫度下,200rpm震蕩培養(yǎng)8-12h。將上述4mL菌液接種于含400mL培養(yǎng)基的IOOOmL搖瓶中，37°C溫度下，200rpm震蕩培養(yǎng)，當(dāng)吸光度達(dá)到O. 6-0. 8時(shí)，加人200 μ L的IM IPTG，并在30°C溫度下，120rpm誘導(dǎo)表達(dá)10-12h。用高速冷凍離心機(jī)將培養(yǎng)液在4°C下一下以13000rpm離心15min，收集菌體。用50mL超純水洗漆并在4°C下一下以13000rpm離心15min,回收菌體,接著用20mLIXBinding Buffer 重懸(0.5M NaCl, 20mM Tris_HCl，5mM imidazole，ρΗ7· 9)，在冰水浴中，用超聲波破碎機(jī)破碎細(xì)菌細(xì)胞，并在4°C下13000rpm離心15min，得到含木聚糖酶TthxynlOA的粗提液。粗提液先經(jīng)70°C加熱處理30min的熱處理，除去不耐熱的雜蛋白，再用Ni-NTA親 和層析柱進(jìn)行純化(方法見His-Bind Kits,Novagen)。純化酶純度的鑒定和分子量的測定采用SDS-PAGE方法進(jìn)行，結(jié)果見圖1，SI表示pET_20b空質(zhì)粒表達(dá)出的蛋白，S2表示經(jīng)粗提液中的Tth xynlOA蛋白，S3表示純化過后的Tth xynlOA蛋白，分子量約為130kDa,與理論值相近。實(shí)施例5重組木聚糖酶Tth xynlOA的酶學(xué)性質(zhì)分析
酶活定義為lmin內(nèi)催化櫸木木聚糖(sigma)產(chǎn)生Iymol木糖所需的酶量。( I)最適溫度
用PH值為7. O的0. IM咪唑-鄰笨二甲酸氫鉀緩沖液稀釋實(shí)施4得到的純酶液，用稀釋后的酶液進(jìn)行酶活測定。酶活測定反應(yīng)體系為200 μ L，由1%櫸木木聚糖100 μ L，90 μ L
0.IM咪唑-鄰笨二甲酸氫鉀緩沖液和10 μ L稀釋酶液組成；反應(yīng)體系的pH為7. O。將反應(yīng)體系在60-100°C溫育IOmin后，加入300 μ L DNS試劑終止反應(yīng)，沸水浴5min后測定550nm的吸光值。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，取平均值作圖，結(jié)果如圖2所示，研究結(jié)果表明在95°C時(shí)，木聚糖具有最高的酶活性，為145. 8U/mg ;將此溫度下的酶活反應(yīng)體系的吸光值最為相對活性100%，其它溫度下酶活反應(yīng)體系的吸光值與此最高酶活性體系的吸光值作為相對活性。其中，在溫度80-100°C的反應(yīng)體系中酶活性較高。(2)最適 pH
酶活性測定體系為200 μ L，由1%櫸木木聚糖100 μ L，ρΗ4. 0-8. O的90 μ L 0. IM咪唑-鄰笨二甲酸氫鉀緩沖液和IOyL稀釋酶液組成。將反應(yīng)體系在95°C溫育IOmin后，力口Λ 300 μ L DNS試劑終止反應(yīng)，沸水浴5min后測定550nm的吸光值，實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，取平均值。結(jié)果如圖3所示，研究結(jié)果表明，在pH為7.0時(shí)，木聚糖酶具有最高的酶活性，為145. 8U/mg ;將此pH值下的酶活反應(yīng)體系的作為相對活性100%，其它pH值下酶活反應(yīng)體系的吸光值與此最高酶活性體系的吸光值的比值作為相對活性。在PH5. 5-8. 5的條件下，酶活較高。(3)重組酶熱穩(wěn)定性
用PH值為7. O的0. IM咪唑-鄰笨二甲酸氫鉀緩沖液稀釋實(shí)施例4得到的純酶液，用稀釋后的酶液進(jìn)行酶活測定。通過對此酶的結(jié)構(gòu)分析，該酶需要Ca2+維持其熱穩(wěn)定性，所以酶熱穩(wěn)定的反應(yīng)體系為200 μ L，由1%櫸木木聚糖100 μ L，88 μ L O. IM咪唑-鄰笨二甲酸氫鉀緩沖液，2yL IOOmM CaCl2和10 μ L稀釋酶液組成。將稀釋酶液在85°C、90°C和95°C水浴30min、60min、90min和120min，測定酶的殘存酶活。酶活測定反應(yīng)體系中pH為7.0，測定溫度為95°C。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，取平均值。結(jié)果如圖4所示，研究結(jié)果顯示，85°C處理2h未見酶活下降，可見該木聚糖在85 °C條件下熱穩(wěn)定非常好。實(shí)施例6重組木聚糖酶Tth xynlOA降解木聚糖的應(yīng)用研究
將重組木聚糖酶Tth xynlOA再分別作用于櫸木木聚糖、樺木木聚糖和燕麥木聚糖。分別在含有20g/L的上述3種木聚糖溶液中，加入5mg的純化酶(實(shí)施例4制備所得)，在85°C的溫度條件下水解lh，經(jīng)離子色譜檢測，木聚糖轉(zhuǎn)化生成木糖至木六糖的比率分別為98. 3%，85. 6%及42. 2%，如表I所示。以上研究結(jié)果表明該木聚糖酶對樺木木聚糖和櫸木木聚糖的降解性能要明顯強(qiáng)于燕麥木聚糖，因此，該酶特別適用于與樺木木聚糖、櫸木木聚糖結(jié)構(gòu)組成相似的半纖維素原料的降解。 表I重組木聚糖酶Tth xynlOA對櫸木、樺木和燕麥木聚糖的降解
I* 糖丨木二糖I木三丨木β叫木五糖I木A糖丨雛車
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_ 麥木 I， IOS 3151 39M 952 I OCl
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實(shí)施例7重組木聚糖酶Tth xynlOA降解玉米秸桿半纖維素的應(yīng)用研究 重組木聚糖酶Tth xynlOA對玉米稻桿半纖維的降解研究,具體步驟如下所述
(I)將玉米秸桿用粉碎機(jī)粉碎，殘?jiān)稍锖?，取IOg加入IOOmL的l%NaOH于85°C水浴震蕩lh。用水將處理后的纖維原料洗至中性，再放置干燥箱中干燥。(2)稱取O. 5g的干燥的纖維原料，加入上述的緩沖溶液20mL與Img的純化酶于20mL的反應(yīng)體系中，85 °C水浴震蕩lh、2h、3h和4h。(3)分別收集上述lh、2h、3h和4h水解液50yL，13000rpm，20°C條件下離心IOmin,收集上清并于_20°C的冰箱中保存。(4)配置上述水解液適宜的TLC的展層劑和顯色劑，展層劑中正丁醇乙酸水=2 I :1，顯色劑為將Ig的3，5-二羥基甲苯加入到IOOmL的硫酸/甲醇溶液(2 8)中配制而成。(5)用毛細(xì)吸管蘸取少量的1%的木I-木4糖的混合液及上述樣品，分別點(diǎn)至寬度為10cm、長度為20cm的玻璃娃膠板上，點(diǎn)完樣后用吹分機(jī)吹干并將娃膠板放置于上述展層劑的層析缸中。(6) 3h后取出玻璃板先風(fēng)干，再放置于100°C的干燥箱中烘干，在通風(fēng)櫥中用噴壺將硅膠板均勻噴灑，接著在再放置于100°c的干燥箱中烘干。結(jié)果如圖5所示，M為木I-木4的標(biāo)準(zhǔn)樣品，1、2、3和4分別為lh、2h、3h和4h的
水解液。研究結(jié)果表明，重組木聚糖酶Tth xynlOA可以快速有效地將玉米秸桿降解為低聚木糖，其中木二糖的含量超過50%。
權(quán)利要求
1.一種極耐熱木聚糖酶基因，其DNA序列如SEQ NO 1所示。
2.權(quán)利要求I所述的極耐熱木聚糖酶基因表達(dá)的極耐熱木聚糖酶，其氨基酸序列如SEQ NO 2 所示。
3.一種極耐熱木聚糖酶，其特征在于氨基酸序列為權(quán)利要求2所述的SEQ N0:2序列中的氨基酸經(jīng)過一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失及添加形成的具有木聚糖酶活性的衍生蛋白質(zhì)。
4.一種重組體系，其特征在于在所述的重組體系上克隆有如SEQ NO :1所示的DNA序列；所述的重組體系包括重組質(zhì)粒和重組菌。
5.一種用于擴(kuò)增權(quán)利要求I所述的極耐熱木聚糖酶基因的引物，其特征在于所使用的引物對為Tth-I :5’ -GGAATTCCATATGGCAGTTGTGGCAAACTACGATTTTGAGAC-3’ ；Tth-2 :5’ -CCGCTCGAGCTTAGTCAGGATCAGGTTG-3’ 。
6.權(quán)利要求2所述的極耐熱木聚糖酶在酶解木聚糖中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于酶解反應(yīng)溫度為70-100°C，pH5.5-8. 5。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述的木聚糖來源于纖維原料中的半纖維素，包括櫸木木聚糖、樺木木聚糖和燕麥木聚糖。
9.權(quán)利要求4所述的重組體系在酶解木聚糖中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求2所述的極耐熱木聚糖酶在酶解玉米秸桿中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種極耐熱木聚糖酶基因及其表達(dá)蛋白與應(yīng)用，該極耐熱木聚糖酶基因的DNA序列如SEQ NO1所示。極耐熱木聚糖酶基因表達(dá)的極耐熱木聚糖酶的氨基酸序列如SEQ NO2所示。該極耐熱木聚糖酶具有極強(qiáng)的耐熱性能和中性pH條件下高活性的特性，在95℃、pH7.0的條件下酶活性最高，比酶活達(dá)到145.8U/mg；該蛋白酶在溫度為70-100℃、pH為5.5-8.5的范圍內(nèi)，均具有較高的酶活。該木聚糖酶的耐熱性能極高，在85℃、添加終濃度為5mMCa2+的反應(yīng)體系中，保溫2h酶活性保持不變。上述特性使得本發(fā)明得到的木聚糖酶比現(xiàn)有木聚糖酶具有更大的優(yōu)越性，適用于80℃以上高溫、中性pH條件下半纖維素的降解，具有潛在的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號C12N1/15GK102864161SQ201210333819
公開日2013年1月9日 申請日期2012年9月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月11日
發(fā)明者王飛, 時(shí)號, 李迅 申請人:南京林業(yè)大學(xué)