專利名稱：鑒別刺參優(yōu)良品種的分子標(biāo)記及快速鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物分子標(biāo)記，具體涉及鑒別刺參優(yōu)良品種的分子標(biāo)記及快速鑒定方 法。
背景技術(shù)：
刺參(Stichopus japonicus Selenka)隸屬于棘皮動(dòng)物門，刺參綱，楣手目，俗稱海老鼠和海黃瓜。主要分布在我國大連、北戴河、山東半島、江蘇連云港及平山島等沿海。2006年開始，我們將北方刺參引入在我市象山地區(qū)的蝦池進(jìn)行養(yǎng)殖，養(yǎng)殖6個(gè)月的左右的刺參可由3g/個(gè)參苗平均增重到50-60g，而且成活率較高。在南移刺參養(yǎng)殖過程中，我們發(fā)現(xiàn)刺參品種的生長速度差異明顯，有快速生長品種和緩慢生長品種，生長速度不同的刺參品種直接影響到最終的產(chǎn)量和效益，因此篩選快速生長刺參品種是提高產(chǎn)量和效益的前題。分子標(biāo)記輔助選育極大的提升和加速了育種的進(jìn)程，目前分子育種技術(shù)已廣泛應(yīng)用于農(nóng)作物育種之中，選育出一些新的優(yōu)良種質(zhì)，為農(nóng)業(yè)的大發(fā)展奠定了基礎(chǔ)；如授權(quán)公告號為CN101831498B的發(fā)明專利，就公開了篩選香型水稻的分子標(biāo)記及篩選方法，其分子標(biāo)記有與水稻badh2的第4內(nèi)含子反義鏈同源配對的香味等位基因正義引物，第7外顯子正義鏈同源配對的非香味等位基因反義引物等4種引物，其篩選方法有水稻總RNA提取、與4種引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后對擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳檢測若擴(kuò)增產(chǎn)物只有約780bp條帶，就為純合香型水稻。但對篩選刺參優(yōu)良品種還未有鑒別的分子標(biāo)記報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種鑒別刺參優(yōu)良品種的分子標(biāo)記，該分子標(biāo)記可以快速鑒定刺參的品種是否為快速生長的優(yōu)良品種。本發(fā)明還提供了利用分子標(biāo)記快速鑒定刺參優(yōu)良品種的方法。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為鑒別刺參優(yōu)良品種的分子標(biāo)記，所述分子標(biāo)記的引物如下擴(kuò)增ADP糖基化因子正向引物AACGAATCTAAAATCATTAGTCAGTG,反向引物CTACTATTGC TTGGAAAACG AGA ；擴(kuò)增精氨酸激酶正向引物CAGATGGGAGGAGACATGAA GGA，反向引物TGGATGGGCA AGTCAGAACA AATC ;擴(kuò)增細(xì)胞色素氧化酶c亞單位正向引物TCATGGTAGC TGCTGTGAAG TAGG，反向引物ACTTGTTCTG ATTCTTCGGA CACC ;擴(kuò)增熱休克蛋白70正向引物CCAAGAGAAC ATTGTCAAGC，反向引物ATTCGAGTCG AACCTCCG ;擴(kuò)增肌動(dòng)蛋白正向引物CCAAGAGAAC ATTGTCAAGC，反向引物ATTCGAGTCG AACCTCCG ;所述分子標(biāo)記的基因片段如下核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示的ADP糖基化因子，核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示的精氨酸激酶，核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示的細(xì)胞色素氧化酶c亞單位，核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示的熱休克蛋白70，核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示的肌動(dòng)蛋白。利用所述的鑒別刺參優(yōu)良品種的分子標(biāo)記快速鑒定刺參品種的方法，其特征在于步驟如下
a、總RNA的提取取刺參體腔液I. OmL, 2000g離心5min,收集血細(xì)胞,加入Trizol試劑(購于Clontech公司)1. OmL,震蕩混勻，室溫放置5min，再加入O. 2mL氯仿，震蕩混勻，室溫靜置lOmin，4°C，12000rpm,離心15min，吸取上清至PE管中，加入該上清等體積的異丙醇，混勻，室溫靜置5min，4°C，12000rpm，離心lOmin，去上清，在沉淀中加入質(zhì)量百分濃度75%的乙醇ImL, 4°C，12000rpm,離心5min,去上清，沉淀靜置5-lOmin,加20 μ L無RNA酶水，得到RNA提取液；b、cDNA合成上述RNA提取液用cDNA合成試劑 盒(購于Clontech公司)合成,得到cDNA，具體合成方法依cDNA合成試劑盒說明書進(jìn)行；c、PCR 擴(kuò)增25ul 擴(kuò)增體系10 XPCR 緩沖液 2. 5ul，濃度 IOuM 的 dNTPs 液 I. 5ul,濃度IOuM的Mgcl2液I. 5ul，濃度2U/ul的Taq酶液O. 5ul，正向引物和反向引物濃度都為IOuM的引物溶液lul, RNA提取液lul, ddH20補(bǔ)充至25ul ;擴(kuò)增反應(yīng)條件50°C 2min，95°C 10min,95°C 15s，60°C lmin，共40個(gè)循環(huán)，反應(yīng)完成后進(jìn)行熔解曲線分析95°C 15s，60°C20s，然后緩慢升溫至95°C;所述引物溶液含有擴(kuò)增ADP糖基化因子正向引物和反向引物，或含有擴(kuò)增精氨酸激酶正向引物和反向引物，或含有擴(kuò)增細(xì)胞色素氧化酶c亞單位正向引物和反向引物，或含有擴(kuò)增熱休克蛋白70正向引物和反向引物，或含有擴(kuò)增肌動(dòng)蛋白正向引物和反向引物；d、鑒定擴(kuò)增完成后，利用2_ΛΛετ方法分析基因表達(dá)量，若ADP糖基化因子、精氨酸激酶、細(xì)胞色素氧化酶c亞單位、熱休克蛋白70、肌動(dòng)蛋白的基因片段中至少其中三個(gè)基因片段的表達(dá)量不低于2. O，則該刺參為快速生長的刺參優(yōu)良品種。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于鑒別刺參優(yōu)良品種的分子標(biāo)記及快速鑒定方法，其中分子標(biāo)記的引物為擴(kuò)增ADP糖基化因子、擴(kuò)增精氨酸激酶、擴(kuò)增細(xì)胞色素氧化酶c亞單位、擴(kuò)增熱休克蛋白70和擴(kuò)增肌動(dòng)蛋白的引物，分子標(biāo)記的表達(dá)基因?yàn)锳DP糖基化因子、精氨酸激酶、細(xì)胞色素氧化酶c亞單位、熱休克蛋白70和肌動(dòng)蛋白的基因片段；鑒定刺參品種的方法為總RNA的提取、cDNA合成、PCR擴(kuò)增和鑒定，鑒定快速、簡便、特異和有效，若至少其中三個(gè)基因片段的表達(dá)量為2. O,則該刺參為快速生長的刺參優(yōu)良品種；這樣就可以篩選出快速生長的刺參，作為優(yōu)良品種的種質(zhì)培育和養(yǎng)殖，可以縮短刺參的養(yǎng)殖時(shí)間，提高刺參的養(yǎng)殖效益。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。實(shí)施例I2009年3月，從浙江省、寧波市象山港中采購3g/個(gè)左右的活體刺參20只，在實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)2周，每天換2/3體積海水，每只刺參分別依以下方法進(jìn)行刺參品種是否優(yōu)良進(jìn)行快速鑒定I、取刺參體腔液I. OmL, 2000g離心5min,收集血細(xì)胞,加入Trizol試劑(購于Clontech公司)I. OmL,震蕩混勻，室溫放置5min，再加入O. 2mL氯仿，震蕩混勻，室溫靜置lOmin, 4°C, 12000rpm,離心15min,吸取上清至PE管中，加入該上清等體積的異丙醇,混勻，室溫靜置5min，4°C，12000rpm，離心lOmin，去上清，在沉淀中加入質(zhì)量百分濃度75%的乙醇ImL, 40C，12000rpm,離心5min,去上清，沉淀靜置5-lOmin，加20 μ L無RNA酶水，得到RNA提取液；2、RNA提 取液用cDNA合成試劑盒(購于Clontech公司)合成,得到cDNA,具體合成方法依cDNA合成試劑盒說明書進(jìn)行；3、對上述cDNA分別用5個(gè)基因片段的引物進(jìn)行擴(kuò)增，25ul擴(kuò)增體系=IOXPCR緩沖液 2. 5ul，濃度 IOuM 的 dNTPs 液 I. 5ul，濃度 IOuM 的 Mgcl2 液 I. 5ul，濃度 2U/ul 的 Taq酶液O. 5ul，正向引物和反向引物濃度都為IOuM的引物溶液lul，RNA提取液lul，ddH20補(bǔ)充至 25ul ;擴(kuò)增反應(yīng)條件50°C 2min,95°C 10min,95°C 15s，60°C lmin，共 40 個(gè)循環(huán)，反應(yīng)完成后進(jìn)行熔解曲線分析95°C 15s,60°C 20s，然后緩慢升溫至95°C ;5個(gè)基因片段的引物分別為擴(kuò)增ADP糖基化因子正向引物AACGAATCTA AAATCATTAG TCAGTG和反向引物CTACTATTGC TTGGAAAACG AGA，擴(kuò)增精氨酸激酶正向引物CAGATGGGAG GAGACATGAAGGA和反向引物TGGATGGGCA AGTCAGAACA AATC，擴(kuò)增細(xì)胞色素氧化酶c亞單位正向引物TCATGGTAGC TGCTGTGAAG TAGG 和反向引物ACTTGTTCTG ATTCTTCGGA CACC，擴(kuò)增熱休克蛋白70正向引物CCAAGAGAAC ATTGTCAAGC和反向引物ATTCGAGTCG AACCTCCG，擴(kuò)增肌動(dòng)蛋白正向引物CCAAGAGAAC ATTGTCAAGC和反向引物ATTCGAGTCG AACCTCCG，擴(kuò)增是在自帶的SDS2. O軟件的ABI7300定量PCR儀進(jìn)行；引物篩選參照Clontech公司PCR-Select cDNASubtraction Kit構(gòu)建的消減文庫得出，引物由上海生工合成；4、擴(kuò)增完成后，分別計(jì)算Λ Ct值，然后依2_竭方法分析各擴(kuò)增產(chǎn)物的基因表達(dá)量，若ADP糖基化因子、精氨酸激酶、細(xì)胞色素氧化酶c亞單位、熱休克蛋白70、肌動(dòng)蛋白的基因片段中至少其中三個(gè)基因片段的表達(dá)量不低于2.0，則該刺參為快速生長的刺參優(yōu)良品種，上述20只刺參中，2只刺參的ADP糖基化因子、精氨酸激酶和熱休克蛋白70的基因片段的表達(dá)量不低于2. 0，I只刺參的精氨酸激酶、熱休克蛋白70和肌動(dòng)蛋白的基因片段的表達(dá)量不低于2. O, I只刺參的ADP糖基化因子、細(xì)胞色素氧化酶c亞單位和肌動(dòng)蛋白的基因片段的表達(dá)量不低于2. 0，2只刺參的細(xì)胞色素氧化酶c亞單位、熱休克蛋白70和肌動(dòng)蛋白的基因片段的表達(dá)量不低于2. 0，I只刺參的ADP糖基化因子、精氨酸激酶、細(xì)胞色素氧化酶c亞單位、熱休克蛋白70的基因片段的表達(dá)量不低于2. O, I只刺參的ADP糖基化因子、精氨酸激酶、熱休克蛋白70、肌動(dòng)蛋白的基因片段的表達(dá)量不低于2.0，I只刺參的ADP糖基化因子、精氨酸激酶、細(xì)胞色素氧化酶c亞單位、熱休克蛋白70、肌動(dòng)蛋白的基因片段的表達(dá)量不低于2. 0，這9只刺參就屬于快速生長的優(yōu)良品種。實(shí)施例2對上述ADP糖基化因子、精氨酸激酶、細(xì)胞色素氧化酶c亞單位、熱休克蛋白70、肌動(dòng)蛋白的基因片段分別測序，利用Blast軟件鑒定序列，得到ADP糖基化因子的基因片段核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示，精氨酸激酶的基因片段核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示，細(xì)胞色素氧化酶c亞單位的基因片段核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示，熱休克蛋白70的基因片段核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示，肌動(dòng)蛋白的基因片段核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示，證明本發(fā)明設(shè)計(jì)的各引物的特異性。實(shí)施例32009年3月，對上述20只刺參進(jìn)行養(yǎng)殖在同一養(yǎng)殖塘位置接近的地方養(yǎng)殖4個(gè)月，上述9只優(yōu)良品種的刺參增重45-55克，另外11只其中有三個(gè)基因片段表達(dá)量為2. O沒有達(dá)到2. O的刺參增重25-35克，以上述9只優(yōu)良品種的刺參為親本進(jìn)行育苗，第二年進(jìn)行子代養(yǎng)殖及再育苗，第三年養(yǎng)殖，第二年和第三年的子代養(yǎng)殖4個(gè)月后增重也達(dá)到45克以上，說明鑒定的優(yōu)良品種刺參生長快速，養(yǎng)殖效益好，可以 作為優(yōu)良品種選育和育種。
權(quán)利要求
1.鑒別刺參優(yōu)良品種的分子標(biāo)記，其特征在于所述分子標(biāo)記的引物如下擴(kuò)增ADP糖基化因子正向引物AACGAATCTA AAATCATTAG TCAGTG，反向引物CTACTATTGC TTGGAAAACGAGA ;擴(kuò)增精氨酸激酶正向引物CAGATGGGAG GAGACATGAA GGA，反向引物TGGATGGGCAAGTCAGAACA AATC ;擴(kuò)增細(xì)胞色素氧化酶c亞單位正向引物TCATGGTAGC TGCTGTGMG TAGG,反向引物ACTTGTTCTG ATTCTTCGGA CACC ;擴(kuò)增熱休克蛋白70正向引物CCAAGAGAACATTGTCAAGC,反向引物ATTCGAGTCG AACCTCCG ;擴(kuò)增肌動(dòng)蛋白正向引物CCAAGAGAACATTGTCAAGC，反向引物ATTCGAGTCG AACCTCCG ;所述分子標(biāo)記的基因片段如下核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示的ADP糖基化因子，核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示的精氨酸激酶，核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示的細(xì)胞色素氧化酶c亞單位，核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示的熱休克蛋白70，核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示的肌動(dòng)蛋白。
2.利用權(quán)利要求I所述的鑒別刺參優(yōu)良品種的分子標(biāo)記快速鑒定刺參品種的方法，其特征在于步驟如下 a、總RNA的提取取刺參體腔液I.0mL,2000g離心5min,收集血細(xì)胞,加入Trizol試劑I. OmL,震蕩混勻，室溫放置5min，再加入O. 2mL氯仿，震蕩混勻，室溫靜置10min，4°C，12000rpm,離心15min，吸取上清至PE管中，加入該上清等體積的異丙醇，混勻，室溫靜置5min，4°C，12000rpm,離心lOmin，去上清，在沉淀中加入質(zhì)量百分濃度75%的乙醇lmL，4°C，12000rpm,離心5min，去上清，沉淀靜置5_10min，加20 μ L無RNA酶水，得到RNA提取液； b、cDNA合成上述RNA提取液用cDNA合成試劑盒合成，得到cDNA，具體合成方法依cDNA合成試劑盒說明書進(jìn)行； c、PCR擴(kuò)增對上述cDNA分別用5個(gè)基因片段的引物進(jìn)行擴(kuò)增，25ul擴(kuò)增體系10 X PCR 緩沖液 2. 5ul，濃度 IOuM 的 dNTPs 液 I. 5ul，濃度 IOuM 的 Mgcl2 液 I. 5ul，濃度 2U/ul的Taq酶液O. 5ul，正向引物和反向引物濃度都為IOuM的引物溶液Iul，RNA提取液Iul，ddH20 補(bǔ)充至 25ul ;擴(kuò)增反應(yīng)條件50°C 2min,95°C 10min,95°C 15s，60°C lmin，共 40 個(gè)循環(huán)，反應(yīng)完成后進(jìn)行熔解曲線分析95°C 15s,60°C 20s，然后緩慢升溫至95°C;所述引物溶液含有擴(kuò)增ADP糖基化因子正向引物和反向引物，或含有擴(kuò)增精氨酸激酶正向引物和反向引物，或含有擴(kuò)增細(xì)胞色素氧化酶c亞單位正向引物和反向引物，或含有擴(kuò)增熱休克蛋白70正向引物和反向引物，或含有擴(kuò)增肌動(dòng)蛋白正向引物和反向引物； d、鑒定擴(kuò)增完成后，利用2_ΔΛετ方法分析基因表達(dá)量，若ADP糖基化因子、精氨酸激酶、細(xì)胞色素氧化酶c亞單位、熱休克蛋白70、肌動(dòng)蛋白的基因片段中至少其中三個(gè)基因片段的表達(dá)量不低于2. O，則該刺參為快速生長的刺參優(yōu)良品種。
全文摘要
本發(fā)明公開了鑒別刺參優(yōu)良品種的分子標(biāo)記及快速鑒定方法，其中分子標(biāo)記的引物為擴(kuò)增ADP糖基化因子、擴(kuò)增精氨酸激酶、擴(kuò)增細(xì)胞色素氧化酶c亞單位、擴(kuò)增熱休克蛋白70和擴(kuò)增肌動(dòng)蛋白的引物，分子標(biāo)記的表達(dá)基因?yàn)锳DP糖基化因子、精氨酸激酶、細(xì)胞色素氧化酶c亞單位、熱休克蛋白70和肌動(dòng)蛋白的基因片段；鑒定刺參品種的方法為總RNA的提取、cDNA合成、PCR擴(kuò)增和鑒定，鑒定快速、簡便、特異和有效，若至少其中三個(gè)基因片段的表達(dá)量為2.0，則該刺參為快速生長的刺參優(yōu)良品種；這樣就可以篩選出快速生長的刺參，作為優(yōu)良品種的種質(zhì)培育和養(yǎng)殖，可以縮短刺參的養(yǎng)殖時(shí)間，提高刺參的養(yǎng)殖效益。
文檔編號C12N15/11GK102912015SQ20121036122
公開日2013年2月6日 申請日期2012年9月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月25日
發(fā)明者李成華, 朱琳, 蘇秀榕, 金春華, 李太武 申請人:寧波大學(xué)