專利名稱：一種鑒定大蔥中與cms相關(guān)的線粒體基因的分子標(biāo)記的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子標(biāo)記技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種鑒定大蔥中與細(xì)胞質(zhì)雄性不育(CMS)相關(guān)的線粒體基因的分子標(biāo)記，及該分子標(biāo)記的制備方法和使用方法。
背景技術(shù)：
細(xì)胞質(zhì)雄性不育(Cytoplasmic male sterility，CMS)屬于母系遺傳，不能產(chǎn)生可育花粉。目前已經(jīng)在300多種植物中發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞質(zhì)雄性不育現(xiàn)象，并且廣泛用于雜交制種。迄今為止，所報道的與CMS相關(guān)的基因大多數(shù)都位于線粒體基因組中，而且這些基因通常是發(fā)生重排，包括移位、插入與缺失。大蔥(Allium fistulosum L.)是亞洲東部廣泛栽培的重要蔬菜作物之一。張啟沛等最早報道了國內(nèi)大蔥雄性不育(Zhang Q P, Wei YYj Zhang Q. 1987. Male sterility of welsh onion (Allium fistulosum L) in a natural population. Journal of ShandongAgricultural University，18，1-10. (in Chinese))。相關(guān)研究表明大蔥雄性不育是由細(xì)胞質(zhì)和核基因共同控制的(Mouse Tj Uehara T. 1985b. Inheritance of cytoplasmic malesterility in Allium fistulosum L. Journal of Japanese Society for HorticulturalScience，53:423-437)。由于大蔥是兩年生植物以及傳統(tǒng)育種方法的復(fù)雜性，所以發(fā)展分子標(biāo)記來輔助育種至關(guān)重要。目前，分子標(biāo)記在蔥屬植物(如洋蔥A.cepa，·、細(xì)香蔥A. schoenoprasum、韭蔥A. ampeloprasum)中已經(jīng)取得較大進(jìn)展。最初，育種工作者以線粒體基因作為探針，利用RFLP(restriction fragment length polymorphism)技術(shù)來鑒定細(xì)胞質(zhì)類型(de Courcelet al. 1989;Holford et al. 1991;Havey 1993;Havey and Leite 1999;Engelka andTatlioglu2000)o雖然RFLP方法明顯快于雜交育種，但是它仍然需要很長的時間來完成育種，這主要是因為從植株中分離出大量完整的DNA、用限制性內(nèi)切酶消化DNA以及雜交都比較困難。因此，PCR (polymerase chain reaction)成為一個很好的選擇，可以方便快速地區(qū)分單株植物的細(xì)胞質(zhì)類型。Havey于1995年提出N型細(xì)胞質(zhì)的葉綠體基因間隔區(qū)中存在IOObp的插入，因此在該類型的細(xì)胞質(zhì)中擴增出了較大的片段(Havey MJ 1995Identification of cytoplasms using the polymerase chain reaction to aid inthe extraction of maintainer lines from open-pollinated populations of onion.Theor Appl Genet，90:263 - 268) ; 1998 年 Sato Y 揭示了在 S 型細(xì)胞質(zhì) cob 基因的上游區(qū)域插入了一段葉綠體 DNA 序列(Sato Y. (1998). PCR amplification of CMS-specificmitochondrial nucleotide sequences to identify cytoplasmic genotypes ofonion(Allium cepa L.). Theoretical and Applied Genetics，96，367-370);緊接著
Engelke等人于2002、2003年從細(xì)香蔥中提出了一個新的PCR標(biāo)記-orfA501 (Engelke
T，Tatlioglu T (2002)A PCR-marker for the CMSl inducing cytoplasm in chivesderived from recombination events affecting the mitochondrial gene atp9. TheorAppl Genet, 104:698 - 702 ；Engelke Tj Terefe D，Tatlioglu T. (2003)A PCR-basedmarker system monitoring CMS-(S), CMS-(T) and (N)-cytoplasm in the onion (Alliumcepa L. ). Theoretical and Applied Genetics, 107, 162-167) ；2009 年，Sunggil Kim等設(shè)計了一個依賴于ofr725及coxl的PCR分子標(biāo)記，從而區(qū)分洋蔥的三種細(xì)胞質(zhì)類型(Sunggil Kim, Eul-Tai Lee, Dong Youn Cho, et al(2009)Identi Wcation of a novelchimeric gene, orf725, and its use in development of a molecular marker fordistinguishing among three cytoplasm types in onion (Allium cepa L.)Theor ApplGenet, 118:433 - 441)。然而，迄今為止國內(nèi)外有關(guān)大蔥雄性不育分子標(biāo)記的研究報道還很少，蓋樹鵬等發(fā)展了一個SCAR標(biāo)記和一個RAPD標(biāo)記，用來區(qū)分大蔥N型和S型細(xì)胞質(zhì)(Gai S P, Meng X D(2010). Application of Molecular Markers Linking to CytoplasmicMale Sterile Loci to Assist Maintainer Line Selection and Their SelectionEfficiency in Welsh Onion(Allium fistulosum L.). Agricultural Sciences inChina, 9 (11) :1571-1576)。在該報道中，雖然RAH)標(biāo)記可以鑒定多個品種的細(xì)胞質(zhì)類型，但是由于其引物為隨機引物，結(jié)果具有不穩(wěn)定性d_SCAR標(biāo)記SCS13雖然穩(wěn)定可靠，但是只能鑒定4個大蔥品種，具有一定的局限性。 AFLP (Amplified fragment length polymorphism)是近年來發(fā)展起來的最有效的分子標(biāo)記之一，它結(jié)合了 RFLP和RAPD技術(shù)并且克服了二者的不足之處(VosP, Hoigers R, Bleeker M, Reijans M, Van De Lee T, Hornes M, Frijters A, Pot J, PelemanJ,Kuiper M(1995)AFLP: a new concept for DNA fingerprinting. Nucleic AcidsRes23:4407-4414)。然而，AFLP也存在著一些局限性，這主要是因為它費時費力，成本高，顯性遺傳。因此，育種工作者迫切地將AFLP標(biāo)記轉(zhuǎn)化成簡單的PCR分子標(biāo)記。序列特異性擴增區(qū)(Sequence-characterizedAmplified Region, SCAR)標(biāo)記是在RAPD技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。SCAR標(biāo)記是將目標(biāo)RAPD片段進(jìn)行克隆并對其末端測序，根據(jù)RAPD片段兩端序列設(shè)計特異引物，對基因DNA片段再進(jìn)行PCR特異擴增，把與原RAPD片段相對應(yīng)的單一位點鑒別出來。SCAR標(biāo)記是共顯性遺傳，待檢DNA間的差異可直接通過有無擴增產(chǎn)物來顯示。SCAR標(biāo)記方便、快捷、可靠，可以快速檢測大量個體，結(jié)果穩(wěn)定性好，重現(xiàn)性高。已經(jīng)報道的鑒定大蔥細(xì)胞質(zhì)類型的SCAR分子標(biāo)記只有一個，即上文中的SCS13，但該標(biāo)記檢測的大蔥品種有限，不能廣泛地應(yīng)用于多個品種大蔥細(xì)胞質(zhì)類型的檢測中。因此，在科研和實踐中，故需要一種適用品種廣泛、檢測結(jié)果穩(wěn)定、操作簡便易行的鑒定大蔥中與CMS相關(guān)的線粒體基因的分子標(biāo)記，用于輔助分子育種。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種鑒定大蔥中與細(xì)胞質(zhì)雄性不育(CMS)相關(guān)的線粒體基因的分子標(biāo)記，及該分子標(biāo)記的制備方法和使用方法；所述的與細(xì)胞質(zhì)雄性不育(CMS)相關(guān)的線粒體基因的分子標(biāo)記的核昔酸序列如序列表中SEQNo I所不。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的一種鑒定大蔥中與細(xì)胞質(zhì)雄性不育相關(guān)的線粒體基因的分子標(biāo)記，所述分子標(biāo)記的核苷酸序列如序列表中SEQ No 1所示。進(jìn)一步地，用于擴增所述分子標(biāo)記的引物的核苷酸序列如序列表中SEQ No 2和SEQ No 3 所示。
一種重組表達(dá)載體、一種轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、一種宿主菌，均含所述的與細(xì)胞質(zhì)雄性不育(CMS)相關(guān)的線粒體基因的分子標(biāo)記。本發(fā)明的目的是通過以下另一技術(shù)方案實現(xiàn)的一種鑒定大蔥中與細(xì)胞質(zhì)雄性不育相關(guān)的線粒體基因的分子標(biāo)記的制備方法，所述的的分子標(biāo)記的核苷酸序列如序列表中SEQ No 1所示；該制備方法的步驟包括A、進(jìn)行大蔥線粒體基因組提取，得到大蔥雄性不育系線粒體DNA CmtDNA)和大蔥保持系線粒體DNA CmtDNA)；B、將所述的大蔥雄性不育系線粒體DNA (mtDNA)和大蔥保持系線粒體DNA(mtDNA)進(jìn)行AFLP分析，得到與細(xì)胞質(zhì)雄性不育相關(guān)的AFLP條帶； C、將所述的與細(xì)胞質(zhì)雄性不育相關(guān)的AFLP條帶進(jìn)行分離、回收、克隆、測序、分析，得到與細(xì)胞質(zhì)雄性不育相關(guān)的AFLP標(biāo)記；D、將所述的細(xì)胞質(zhì)雄性不育相關(guān)的AFLP標(biāo)記進(jìn)行轉(zhuǎn)化處理，得到細(xì)胞質(zhì)雄性不育相關(guān)的SCAR分子標(biāo)記，即為所述的與細(xì)胞質(zhì)雄性不育(CMS)相關(guān)的線粒體基因(mtDNA)的分子標(biāo)記。本發(fā)明的目的是通過以下又一技術(shù)方案實現(xiàn)的一種鑒定大蔥中與細(xì)胞質(zhì)雄性不育相關(guān)的線粒體基因的分子標(biāo)記的檢測方法，所述的與細(xì)胞質(zhì)雄性不育相關(guān)的線粒體基因的分子標(biāo)記的核苷酸序列如序列表中SEQ No 1所示；該檢測方法的步驟包括A、提取被檢測的大蔥的總DNA ；B、以所述的被檢測的大蔥的總DNA作為模板進(jìn)行PCR擴增反應(yīng)，得到擴增產(chǎn)物；C、判斷所述的擴增產(chǎn)物中是否存在所述的與細(xì)胞質(zhì)雄性不育相關(guān)的線粒體基因的分子標(biāo)記。進(jìn)一步地，B步驟中PCR擴增反應(yīng)的引物的核苷酸序列如序列表中SEQ No 2和SEQ No 3 所示。進(jìn)一步地，B步驟中PCR擴增反應(yīng)的體系為20 μ 1，包括有10 XBuffer(含有Mg2+):
2μ I ；dNTPs 1. 6μ I ；核苷酸序列如序列表中SEQ No 1所示的分子標(biāo)記的上游引物，其核苷酸序列如序列表中SEQ No 2所不I U I ；核苷酸序列如SEQ No 1所示的分子標(biāo)記的下游引物，其核苷酸序列如序列表中SEQ No 3 所示1μ I ；Taq 酶0. 2 μ I ;模板2 μ I ；ddH20 :補至 20 μ I。進(jìn)一步地，B步驟中PCR擴增反應(yīng)的程序為第一步94°C,預(yù)變性5min ;第二步94°C，變性30s ;第三步50°C，退火45s ;第四步72°C延伸90s，第二步至第四步共40個循環(huán)；第五步，72°C，最后延伸IOmin ;第六步4°C保存。本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)具有以下有益效果I、本發(fā)明將大蔥中與細(xì)胞質(zhì)雄性不育(CMS)相關(guān)的線粒體基因的AFLP分子標(biāo)記轉(zhuǎn)化為SCAR分子標(biāo)記，所以可以快速檢測大量樣品，結(jié)果穩(wěn)定性好，重現(xiàn)性高，操作簡便。
2、本發(fā)明中的SCAR標(biāo)記可以檢測該實驗的所有品種，即8個不育系品種、8保持系品種以及4個雜交品種，該標(biāo)記適用范圍廣泛，可以方便地鑒定大蔥細(xì)胞質(zhì)類型，輔助分子育種的發(fā)展。


圖I為實施例I中大蔥樣本AFLP分析聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。圖2為實施例I中片段kl與k2的核苷酸序列比對圖。圖3為實施例I中大蔥樣本的SCAR標(biāo)記檢測電泳圖。圖4為實施例2中被檢測大蔥的SCAR標(biāo)記檢測電泳圖。
具體實施例方式實施例I :本實施例為一種鑒定大蔥中與細(xì)胞質(zhì)雄性不育(CMS)相關(guān)的線粒體基因的分子標(biāo)記及其制備方法。一種鑒定大蔥中與CMS相關(guān)的線粒體基因的分子標(biāo)記，所述的與CMS相關(guān)的線粒體基因的分子標(biāo)記的核昔酸序列如序列表中SEQ No 1所不。用于擴增所述的與CMS相關(guān)的線粒體基因分子標(biāo)記的引物的核苷酸序列如序列表中SEQ No 2和SEQ No 3所示?！N重組表達(dá)載體、一種轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、一種宿主菌，均含所述的與CMS相關(guān)的線粒體基因的分子標(biāo)記。一種鑒定大蔥中與CMS相關(guān)的線粒體基因的分子標(biāo)記的制備方法，所述的與CMS相關(guān)的線粒體基因的分子標(biāo)記的核苷酸序列如SEQ No 1所示；該制備方法的步驟包括A、大蔥線粒體基因組提取選取大蔥不育系和大蔥保持系，采用蔗糖沉淀差速離心法分別進(jìn)行mtDNA提取處理，得到大蔥雄性不育系mtDNA和大蔥保持系mtDNA ；所述的mtDNA提取處理的步驟為a.從上述品種的大蔥中取新鮮的蔥白30_80g，優(yōu)選為50g ；b.向上述的蔥白中加入五倍的預(yù)冷的緩沖液A (O. 5mol/L鹿糖、50mmol/LTris-Cl、20mmol/L EDTA.O. I % BSAUOmmo 1/L巰基乙醇，pH 8. O)，再用榨汁機破碎組織，紗布過濾，得到濾液，再分裝到50ml的離心管中；c.將所述的濾液進(jìn)行離心處理，離心力為1500g，時間為lOmin，取上清液a ；d.將所述的上清液a進(jìn)行離心處理，離心力為2600g，時間為lOmin，取上清b ；e.將所述的上清液b進(jìn)行離心處理，離心力為13000g，時間為15min，棄上清，得到粗線粒體沉淀；f.向所述的粗線粒體沉淀中加入預(yù)冷的IOml緩沖液B(0. 5mol/L鹿糖、50mmol/LTris-Cl, pH7. 5)，懸浮沉淀后進(jìn)行離心處理，離心力為800g，時間為lOmin，得到上清c ；g.在所述的上清c中加入500 μ I IM的MgCl和I. 5 μ I DNaseI，冰浴2h，EDTA終
止反應(yīng)，得到反應(yīng)液；h.將所述的反應(yīng)液小心地轉(zhuǎn)入盛有25ml緩沖液C(0. 6mol/L鹿糖、10mmol/LTris-Cl>20mmol/LEDTA)的離心管中，進(jìn)行離心處理,離心力為13000g,時間為20min,收集沉淀即為較純的線粒體；i.將所述的較純的線粒體進(jìn)行裂解處理，DNA提取處理，得到大蔥mtDNA ；所述的大蔥mtDNA分為大蔥雄性不育系mtDNA和大蔥保持系mtDNA。本實施例的大蔥樣本為所述的大蔥雄性不育系(4-6Α、64Α、58Α1、58Α2、23-24Α)及相應(yīng)的大蔥保持系(1_3B、63B、57B、19-22B)，由北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心提供。B、將所述的大蔥雄性不育系mtDNA和大蔥保持系mtDNA進(jìn)行AFLP分析，得到與CMS相關(guān)的AFLP條帶；a.將所述的不育系mtDNA和大蔥保持系mtDNA選用EcoRI/Msel進(jìn)行酶切處理，得到酶切產(chǎn)物，然后與相應(yīng)的接頭進(jìn)行連接處理，得到連接產(chǎn)物；
所述的酶切處理和連接處理在同一反應(yīng)體系中進(jìn)行；該反應(yīng)體系為20 μ 1，包括有11 μ I ddH20, 2 μ I IOxNBE Buffer2, 0. 4 μ I ATP (IOmM) , 0. 4 μ I EcoRI 接頭，O. 4 μ IMseI 接頭，O.25 μ I EcoRI(10U/μ I), O. 25 μ I MseI(10U/μ I), O. 2 μ 1T4DNA Iigase(400υ/μ 1)，0· 1μ I IOOxBSA, 5 μ I DNA模版(5μ I總共達(dá)到250ng);該反應(yīng)體系的反應(yīng)程序為先于37°C進(jìn)行酶切處理5h，再于16°C進(jìn)行連接6h，得到連接產(chǎn)物；b.將所述的連接產(chǎn)物進(jìn)行預(yù)擴增反應(yīng)，得到預(yù)擴增產(chǎn)物；所述的預(yù)擴增選用的引物為兩條末端各有I個選擇性核苷酸，上游引物3-GTAGACTGCGTACCAATTCA-5，下游引物3-GACGATGAGTCCTGAGTAAC-5；該預(yù)擴增反應(yīng)體系為20 μ 1，包括有5 μ I連接產(chǎn)物，2 μ I IOxBufer,I. 6 μ ldNTPs, I. 2μ I Mg2+, 0. 6 μ I ΕΑ00, 0. 6 μ I MC00,0. 2μ I Taq 酶，8·8μ1 ddH20 ；所述的預(yù)擴增反應(yīng)的程序為72°C預(yù)變性2min ;94°C變性30s，56°C退火30s，72°C延伸lmin，共29個循環(huán)；72°C最后延伸IOmin ;4°C保存；c.將所述的預(yù)擴增產(chǎn)物進(jìn)行擴增反應(yīng)，得到擴增產(chǎn)物；所述的擴增反應(yīng)選用的引物為兩個末端各含有3個選擇性核苷酸(EANN和MCNN)，共有256對；以上的256對引物由以下A組、B組各16條核苷酸序列全排列而成
權(quán)利要求
1.一種鑒定大蔥中與細(xì)胞質(zhì)雄性不育相關(guān)的線粒體基因的分子標(biāo)記，其特征在于所述分子標(biāo)記的核苷酸序列如序列表中SEQ No 1所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的分子標(biāo)記，其特征在于用于擴增所述分子標(biāo)記的引物的核苷酸序列如序列表中SEQ No 2和SEQ No 3所示。
3.—種重組表達(dá)載體，其特征在于含有權(quán)利要求I中所述的分子標(biāo)記。
4.ー種轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系，其特征在于含有權(quán)利要求I中所述的分子標(biāo)記。
5.一種鑒定大蔥中與細(xì)胞質(zhì)雄性不育相關(guān)的線粒體基因的分子標(biāo)記的制備方法，其特征在于所述的的分子標(biāo)記的核苷酸序列如序列表中SEQ No 1所示； 該制備方法的步驟包括 A、進(jìn)行大蔥線粒體基因組提取，得到大蔥雄性不育系線粒體DNA和大蔥保持系線粒體DNA ； B、將所述的大蔥雄性不育系線粒體DNA和大蔥保持系線粒體DNA進(jìn)行AFLP分析，得到與細(xì)胞質(zhì)雄性不育相關(guān)的AFLP條帶； C、將所述的與細(xì)胞質(zhì)雄性不育相關(guān)的AFLP條帶進(jìn)行分離、回收、克隆、測序、分析，得到與細(xì)胞質(zhì)雄性不育相關(guān)的AFLP標(biāo)記； D、將所述的細(xì)胞質(zhì)雄性不育相關(guān)的AFLP標(biāo)記進(jìn)行轉(zhuǎn)化處理，得到細(xì)胞質(zhì)雄性不育相關(guān)的SCAR分子標(biāo)記，即為所述的與細(xì)胞質(zhì)雄性不育相關(guān)的線粒體基因的分子標(biāo)記。
6.一種鑒定大蔥中與細(xì)胞質(zhì)雄性不育相關(guān)的線粒體基因的分子標(biāo)記的檢測方法，其特征在于所述的與細(xì)胞質(zhì)雄性不育相關(guān)的線粒體基因的分子標(biāo)記的核苷酸序列如序列表中SEQ No I 所示； 該檢測方法的步驟包括 A、提取被檢測的大蔥的總DNA； B、以所述的被檢測的大蔥的總DNA作為模板進(jìn)行PCR擴增反應(yīng)，得到擴增產(chǎn)物； C、判斷所述的擴增產(chǎn)物中是否存在所述的與細(xì)胞質(zhì)雄性不育相關(guān)的線粒體基因的分子標(biāo)記。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的分子標(biāo)記的檢測方法，其特征在于 B步驟中PCR擴增反應(yīng)的引物的核苷酸序列如序列表中SEQ No 2和SEQ No 3所示。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的分子標(biāo)記的檢測方法，其特征在于 B步驟中PCR擴增反應(yīng)的體系為20 μ 1，包括有IOXBuffer (含有 Mg2+) 2μ I ；dNTPs 1. 6μ I ； 核苷酸序列如序列表中SEQ No 1所示的分子標(biāo)記的上游引物，其核苷酸序列如序列表中SEQ No :2所示1μ I ； 核苷酸序列如序列表中SEQ No 1所示的分子標(biāo)記的下游引物，其核苷酸序列如序列表中SEQ No :2所示1μ I ；Taq 酶0· 2 μ I ; 模板2μ I ; ddH20 :補至 20 μ I0
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的分子標(biāo)記的檢測方法，其特征在于B步驟中PCR擴增反應(yīng)的程序為第一歩94°C，預(yù)變性5min ;第ニ步94°C，變性30s ；第三步50°C，退火45s ;第四步72°C延伸90s，第二步至第四步共40個循環(huán)；第五歩，72°C，最后延伸IOmin ;第 六步4°C保存。
全文摘要
本發(fā)明提供一種鑒定大蔥中與細(xì)胞質(zhì)雄性不育(CMS)相關(guān)的線粒體基因的分子標(biāo)記，及該分子標(biāo)記的制備方法和使用方法；所述的與細(xì)胞質(zhì)雄性不育(CMS)相關(guān)的線粒體基因的分子標(biāo)記的核苷酸序列如序列表中SEQNo1所示；用于擴增所述分子標(biāo)記的引物的核苷酸序列如序列表中SEQNo2和SEQ No3所示。本發(fā)明將大蔥中與細(xì)胞質(zhì)雄性不育(CMS)相關(guān)的線粒體基因的AFLP分子標(biāo)記轉(zhuǎn)化為SCAR分子標(biāo)記，所以可以快速檢測大量樣品，結(jié)果穩(wěn)定性好，重現(xiàn)性高，操作簡便；本發(fā)明中的SCAR標(biāo)記可以檢測該實驗的所有品種，即8個不育系品種、8保持系品種以及4個雜交品種，該標(biāo)記適用范圍廣泛，可以方便地鑒定大蔥細(xì)胞質(zhì)類型，輔助分子育種的發(fā)展。
文檔編號C12N1/15GK102839220SQ201210365130
公開日2012年12月26日 申請日期2012年9月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月27日
發(fā)明者王永勤, 王嬋, 李洪有 申請人:北京市農(nóng)林科學(xué)院