專利名稱：以海水為介質(zhì)生產(chǎn)燃料用碳?xì)浠衔锏姆椒皩Ｓ镁甑闹谱鞣椒?br> 技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種以海水為介質(zhì)生產(chǎn)燃料用碳?xì)浠衔锏姆椒皩Ｓ镁辍?br> 背景技術(shù)：
幾個世紀(jì)以來，常規(guī)的化石能源一直支撐著工業(yè)文明的發(fā)展。但是由于化石能源的不可再生性，地球億萬年積存下的寶貴資源在人類高強度開采與消費下最終會消耗殆盡。同時過度使用化石資源所帶來的氣候變化、環(huán)境污染等問題也將使人類付出巨大的代價。能源供應(yīng)問題將成為制約我國未來社會經(jīng)濟(jì)可持續(xù)發(fā)展的重要因素。為保證能源供應(yīng)的獨立性和可持續(xù)性，目前各國掀起了一場能源和化工領(lǐng)域新技術(shù)浪潮，即用“細(xì)胞工廠與生物合成”逐步替代傳統(tǒng)的化工工藝。利用生物技術(shù)以可再生生 物資源為原料生產(chǎn)生物燃料和各種化工原料和產(chǎn)品更是其中的熱點。與傳統(tǒng)的化石燃料相比，生物燃料具有可再生、無毒、可降解的特點，并能有效減少有害氣體和顆粒物的排放，是優(yōu)質(zhì)的化石燃料替代品，故又稱其為“綠色燃料”。但目前上市的生物燃料主要來源于玉米淀粉的發(fā)酵反應(yīng)以及大豆、油菜籽、棕櫚油中三酰甘油的體外轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)，其成分為乙醇、脂肪酸甲酯或乙酯等。這種利用糧食作物為原料生產(chǎn)生物燃料的方法已經(jīng)產(chǎn)生了與人爭糧、占用大量的耕地的情況；傳統(tǒng)的發(fā)酵工藝需要消耗大量的淡水作為介質(zhì)，反應(yīng)后產(chǎn)生大量不易處理的廢水，既消耗了資源又污染了環(huán)境。為了提高生物燃料的實用性和應(yīng)用范圍，著力于開發(fā)新的催化方法和工藝流程，尋找更高效的轉(zhuǎn)化酶以及優(yōu)化酶的使用方法，擴展可利用的原料以及發(fā)酵介質(zhì)范圍成為必須。在此基礎(chǔ)上，通過改造微生物的代謝途徑，使其能利用廉價的非糧油類原料如纖維素等，直接在生物體內(nèi)生產(chǎn)生物燃料，從而擺脫一系列的高能耗生產(chǎn)過程，降低成本。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一株鹽單胞菌(Halomonas sp.)。本發(fā)明提供的鹽單胞菌(Halomonas sp. ) LS 21，其保藏編號為CGMCC No. 6593。上述的鹽單胞菌(Halomonas sp. ) LS 21在制備聚羥基脂肪酸酯/3-羥基丁酸和/或脂肪酸中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；上述應(yīng)用中，所述脂肪酸具體為C16脂肪酸，也稱為棕櫚酸?？梢岳煤铣缮飳W(xué)的方法對上述的鹽單胞菌(Halomonas sp. ) LS 21進(jìn)行基因重組，修飾其代謝通路，使該基因工程菌株在能夠利用多種碳、氮源的基礎(chǔ)上，表達(dá)編碼催化生產(chǎn)碳?xì)浠衔锏拿傅南嚓P(guān)基因。因此，本發(fā)明另一個目的是提供一種重組菌。本發(fā)明提供的重組菌，為將酰基?；d體蛋白還原酶的編碼基因和乙醛脫羧酶的編碼基因均導(dǎo)入宿主菌中，得到重組菌。上述重組菌中,宿主菌為鹽單胞菌(Halomonas sp.);本發(fā)明的實施例中具體采用鹽單胞菌(Halomonas sp. ) LS 21 ；上述酰基?；d體蛋白還原酶和上述乙醛脫羧酶具體均來自藍(lán)細(xì)菌；本發(fā)明的實施例中藍(lán)細(xì)菌具體為集胞藍(lán)細(xì)菌(Synechocystis sp.)或念珠藍(lán)細(xì)菌(Nostoc sp.)。上述重組菌中，將?；；d體蛋白還原酶的編碼基因和乙醛脫羧酶的編碼基因均導(dǎo)入宿主菌為將含有?；；d體蛋白還原酶的編碼基因和乙醛脫羧酶的編碼基因的片段導(dǎo)入宿主菌；所述含有酰基?；d體蛋白還原酶的編碼基因和乙醛脫羧酶的編碼基因的片段的核苷酸序列為序列表中的序列I或序列表中的序列4。上述重組菌為如下重組菌A或重組菌B
重組菌A為將來自集胞藍(lán)細(xì)菌(Synechocystis sp.)的含有?；；d體蛋白還原酶的編碼基因和乙醛脫羧酶的編碼基因的片段(序列I)導(dǎo)入鹽單胞菌(Halomonas sp.)LS 21中；具體本發(fā)明中導(dǎo)入來自集胞藍(lán)細(xì)菌(Synechocystis sp.)的含有酰基?；d體蛋白還原酶的編碼基因和乙醛脫羧酶的編碼基因的片段通過重組載體A導(dǎo)入鹽單胞菌(Halomonas sp. ) LS 21中，該重組載體A為將序列表中的序列I插入載體pBBRlMCSl的XbaI和BamH I位點間得到表達(dá)?；；d體蛋白還原酶和乙醛脫羧酶。集胞藍(lán)細(xì)菌(Synechocystis sp.)中的?；；d體蛋白還原酶的氨基酸序列為序列表中的序列2 ;所述酸基酸基載體蛋白還原酶的基因的核昔酸序列為序列表中序列I自5’末端第I位-1023位核苷酸；乙醛脫羧酶的氨基酸序列為序列表中的序列3 ;所述?；；d體蛋白還原酶的基因的核苷酸序列為序列表中序列I自5’末端第1242位-1937位核苷酸。重組菌B為將來自念珠藍(lán)細(xì)菌(Nostoc sp.)的含有酰基?；d體蛋白還原酶的編碼基因和乙醛脫羧酶的編碼基因的片段(序列4)導(dǎo)入鹽單胞菌(Halomonas sp. ) LS21中；具體本發(fā)明中導(dǎo)入來自念珠藍(lán)細(xì)菌(Nostoc sp.)的含有?；；d體蛋白還原酶的編碼基因和乙醛脫羧酶的編碼基因的片段通過重組載體B導(dǎo)入鹽單胞菌(Halomonas sp.)LS 21中，該重組載體B為將序列表中的序列4插入載體pBBRlMCSl的XbaI和BamH I位點間得到表達(dá)酰基?；d體蛋白還原酶和乙醛脫羧酶。念珠藍(lán)細(xì)菌(Nostoc sp.)中的?；；d體蛋白還原酶的氨基酸序列為序列表中的序列5 ;所述酰基?；d體蛋白還原酶的基因的核苷酸序列為序列表中序列4自5’末端第938位-1958位核苷酸；乙醛脫羧酶的氨基酸序列為序列表中的序列6 ;所述?；；d體蛋白還原酶的基因的核苷酸序列為序列表中序列4自5’末端第I位-696位核苷酸。上述重組載體還包含可操作地連接到所述核苷酸序列的啟動子。所述啟動子是具有調(diào)節(jié)細(xì)胞器特異性、組織特異性、誘導(dǎo)型、組成型或細(xì)胞特異性表達(dá)的啟動子。在具體實施方案中，所述重組載體包含具有以下特征的序列(I)可操作地連接到所述核苷酸序列的調(diào)節(jié)序列；(2)可操作地連接到所述核苷酸序列的選擇標(biāo)記；(3)可操作地連接到所述核苷酸序列的標(biāo)記序列；(4)可操作地連接到所述核苷酸序列的純化部分；(5)可操作地連接到所述核苷酸序列的目的基因表達(dá)序列。在某些實施方案中，所述核苷酸序列被穩(wěn)定整合到所述宿主細(xì)胞的基因組中，并且該核苷酸序列的表達(dá)受可調(diào)節(jié)啟動子的控制。上述的重組菌在制備烷烴中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。上述應(yīng)用中，所述烷烴具體為十三烷、十五烷和/或十七烷；本發(fā)明的第三個目的是提供一種發(fā)酵培養(yǎng)基，該發(fā)酵培養(yǎng)基可用來培養(yǎng)鹽單胞菌(Halomonas sp. ) LS 21 或上述重組菌。本發(fā)明提供的發(fā)酵培養(yǎng)基，由C源、N源和海水組成；所述C源為秸桿纖維素浸提液、油酸、動物脂肪和可溶性淀粉中的至少一種；所述N源為大豆蛋白和乳清蛋白中的至少一種；所述海水為天然海水或人工海水；所述秸桿纖維素浸泡液按照如下方法制備將秸桿在NaOH水溶液浸泡，收集液體即為秸桿纖維素浸泡液。具體按照如下方法制備將秸桿在濃度為lg/L、pH值為14的NaOH水溶液4°C浸泡48h，收集液體即為秸桿纖維素浸泡液；其中秸桿為氣爆處理后的秸桿；在本發(fā)明的實施例中采用氣爆處理后的玉米秸桿，具體方法為將含水量10-35%的玉米秸桿在蒸汽壓力I. 0-1. 5MPa的條件下進(jìn)行蒸汽爆破處理O. 5h，烘干得到氣爆處理后的秸桿。上述發(fā)酵培養(yǎng)基由所述秸桿纖維素浸提液、所述油酸、所述動物脂肪、所述可溶性淀粉、所述大豆蛋白、所述乳清蛋白和所述海水組成；所述秸桿纖維素浸提液、所述油酸、所述動物脂肪、所述可溶性淀粉、所述大豆蛋白和所述乳清蛋白的配比為 150-400mL 5-20mL :3_10g :5_20g :l_4g 2g ；其中，所述動物脂肪具體為家禽脂肪；所述家禽脂肪進(jìn)一步具體為豬肉脂肪；所述發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值為5. 0-11. O，具體為5. O或9. O或11.0 ;所述天然海水中NaCl的終濃度為20g/L至50g/L。上述培養(yǎng)基中，大豆蛋白為大豆蛋白粉，乳清蛋白為乳清蛋白粉。上述發(fā)酵培養(yǎng)基中，人工海水的配方為Mocledon配方，與天然海水的成分基本一致，廣泛用于海產(chǎn)品養(yǎng)殖，其用來配置發(fā)酵培養(yǎng)基后NaCl的終濃度具體為26. 726g/L ；上述發(fā)酵培養(yǎng)基中，天然海水(NaCl含量約為26g/L)，用來配置發(fā)酵培養(yǎng)基后發(fā)酵培養(yǎng)基中所含主要離子含量如下Na+3537. 73mg/L、Mg2+543. 97mg/L、Ca2+210. 33mg/L ；K+105. 84mg/L ；0Γ7559. 70mg/L、S02_591. 75mg/L、Li + 193. 0 μ g/L、Al2+3. 788 μ g/L、Br_37. 93 μ g/L;天然海水于2012年8月2日采集于天津港碼頭近岸海邊，海水置于聚四氟乙烯塑料瓶內(nèi)密封保存。本發(fā)明發(fā)酵培養(yǎng)基中的C源和N源，包括但不僅限于經(jīng)預(yù)處理的纖維素、半纖維素、飽和及不飽和長鏈脂肪酸(油脂)、淀粉等農(nóng)業(yè)、林業(yè)、城市餐廚垃圾等廢棄物。這些廢棄物經(jīng)不同方法的預(yù)處理后，構(gòu)成了除必要微量元素外的主要發(fā)酵用碳、氮源。本發(fā)明的第四個目的是提供一種制備聚羥基脂肪酸酯/3-羥基丁酸和/或脂肪酸的方法。本發(fā)明提供的方法，為發(fā)酵上述的鹽單胞菌(Halomonas sp. ) LS 21，即得到聚羥基脂肪酸酯/3-羥基丁酸和/或脂肪酸。上述方法中，所述脂肪酸為C16脂肪酸。上述方法中，在發(fā)酵后還包括將發(fā)酵產(chǎn)物收集菌體、酯化，獲得聚羥基脂肪酸酯/3-羥基丁酸和/或脂肪酸。本發(fā)明的第五個目的是提供一種制備烷烴的方法。本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟發(fā)酵上述的重組菌，即得到烷烴；所述烷烴具體為十二燒、十五燒和/或十七燒。在上述制備烷烴的方法中，在發(fā)酵后包括如下步驟收集發(fā)酵產(chǎn)物用甲醇或環(huán)己烷萃取，收集有機相得到烷烴。
在上述制備聚羥基脂肪酸酯/3-羥基丁酸和/或脂肪酸的方法或制備烷烴的方法中，發(fā)酵采用的培養(yǎng)基為上述發(fā)酵培養(yǎng)基。上述方法中，所述發(fā)酵的溫度為20°C -45°C，具體為20°C或42°C或45°C ;所述發(fā)酵的轉(zhuǎn)速為IOOrpm (旋轉(zhuǎn)半徑15mm);所述發(fā)酵時間為24至96小時。在上述發(fā)酵過程中，對于鹽單胞菌(Halomonas sp. ) LS 21而言，包括野生菌株及基因重組菌株，高鹽濃度及堿性PH環(huán)境是其生長所必須的，本發(fā)明中應(yīng)用的人工海水提供了平均35g/L的鹽分濃度，對廢棄物的前處理所用的堿處理方法使培養(yǎng)基的pH值維持在11左右，這樣的高鹽高堿的生產(chǎn)生長條件能抑制其他非嗜鹽菌的生長，使無滅菌生產(chǎn)工藝成為可能，極大的降低了滅菌過程所需的能耗，從而降低了成本。本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明自主篩選的一株野生鹽單胞菌(Halomonas sp. ) LS21，并以其為基礎(chǔ)，通過基因工程改造構(gòu)建重組菌，該野生菌和重組菌均可以在以天然海水或人工海水配置的發(fā)酵培養(yǎng)基中，生產(chǎn)以主要組成為烷烴、烯烴及長鏈脂肪酸的碳?xì)浠?物，此類碳?xì)浠衔锝?jīng)分離后可作為生物燃料使用；且發(fā)酵過程可以實現(xiàn)不滅菌連續(xù)發(fā)酵。本發(fā)明中的鹽單胞菌及其重組菌株營養(yǎng)要求簡單、發(fā)酵過程無需滅菌且可連續(xù)進(jìn)行，簡單易控、低成本、具有良好的工業(yè)應(yīng)用前景。在本說明書中，使用了縮寫基因名稱或多肽名稱引用，該縮寫基因或多肽名稱表示基因或多肽的種類。這些基因包括編碼相同多肽和具有相同生理功能同源多肽的部分基因。多肽包括具有相同活性(同工酶)的所有多肽。本文引用的登錄號來自美國國立衛(wèi)生研究院(National Institute ofHealth, U. S. A)所維護(hù)的NCBI數(shù)據(jù)庫(國家生物技術(shù)信息中心(National Center forBiotechnologyInformation))。除非另作說明，登錄號按照截止到2012年五月的數(shù)據(jù)庫中提供的。本文所述的碳?xì)浠衔?，包括但不僅限于烷烴、烯烴、脂肪酸、酯、醛及脂肪醇等。其中烷烴表示僅含有單一碳-碳鍵的碳?xì)浠衔?，其碳原子?shù)至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9、
10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 或 20 個碳。上述菌株LS21已于2012年9月20日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號)，保藏號為CGMCCNo. 6593,分類命名為鹽單胞菌(Halomonas sp.)。


圖I為野生型LS21在海水配制的多碳源培養(yǎng)基中的生長情況(框內(nèi))圖2為LS21在秸桿纖維素為唯一碳源的培養(yǎng)基中積累PHA的GC分析圖(框內(nèi))圖3為LS21在人工海水配制的培養(yǎng)基中積累PHA (實線框內(nèi))和C16的脂肪酸的GC分析圖(虛線框內(nèi))圖4為含有表達(dá)來源于集胞藍(lán)細(xì)菌的?；；d體蛋白還原酶和乙醛脫羧酶的重組LS21產(chǎn)生烷烴的GC圖譜圖5為含有表達(dá)來源于念珠藍(lán)細(xì)菌的酰基?；d體蛋白還原酶和乙醛脫羧酶的重組LS21產(chǎn)生烷烴的GC圖譜
圖6為C11、C13、C15、C17烷烴標(biāo)準(zhǔn)品GC圖譜圖7為重組LS21B產(chǎn)生烷烴和烷烴標(biāo)準(zhǔn)品的復(fù)合比較的GC圖譜
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實施例I、鹽單胞菌(Halomonas sp. ) LS 21的分離鑒定及生長特性一、菌株LS 21分離從新疆達(dá)坂城鹽湖中取得土樣和水樣，以纖維素為唯一碳源從中分離菌株。得到 5株可產(chǎn)利用纖維素為唯一碳源生長的菌種，選擇其中一株生長良好并可積累的PHA菌株命名為LS 21。纖維素培養(yǎng)基的制作將秸桿纖維素浸泡液用紗布過濾，濾去殘留秸桿，按比例加入NaCl (40g/L)及組分I及微量元素混合溶液，用NaOH溶液調(diào)pH值至10，待沉淀析出后，在5000rpm下離心5min，保留上清液作為秸桿纖維素培養(yǎng)基。稻桿纖維素浸泡液稱取氣爆處理后的稻桿(將含水量10 35%玉米稻桿在蒸汽壓力I. O I. 5MPa的條件下進(jìn)行蒸汽爆破處理O. 5h烘干獲得)6g，加入500mL用去離子水配置的NaOH水溶液(lg/L, pH=14),置于4°C下浸泡48h,收集液體得到稻桿纖維素浸泡液。組分I :1. 5g/L磷酸二氫鉀、9. 65g/L十二水合磷酸氫二鈉，配制成50倍母液，121°C滅菌20分鐘；微量元素混合溶液微量元素I 10mL/L、微量元素II lmL/L，配制成50倍母液，母液pH值調(diào)節(jié)至4. 0-5. 0,121。。滅菌20分鐘；微量元素I和微量元素II配制同下；I升所述微量元素I按照如下方法制備將檸檬酸鐵銨5g、二水合氯化鈣2g和O. 5mol/L鹽酸水溶液混合，用O. 5mol/L鹽酸水溶液補足至I升，得到所述微量元素I ;I升微量元素II按照如下方法制備將七水合硫酸鋅lOOmg、四水合氯化錳30mg、硼酸300mg、六水合氯化鈷200mg、五水合硫酸銅10mg、六水合氯化鎳20mg、二水合鑰酸鈉30mg和0. 5mol/L鹽酸水溶液混合，用0. 5mol/L鹽酸水溶液補足至I升，得到所述微量元素II?；?、組分I、組分II、微量元素分別單獨滅菌，冷卻后，分別取20mL組分I母液、20mL組分II母液和20mL微量元素母液加入基底。在實際培養(yǎng)過程中，可向上述培養(yǎng)基中再添加一定濃度的抗生素以維持質(zhì)粒的穩(wěn)定性，如100 μ g/mL氨節(jié)青霉素，50 μ g/mL硫酸卡那霉素和34 μ g/mL的氯霉素等。分離培養(yǎng)基氯化鈉60g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉lg/L，其余組分為水，pH值約為
8.O。二、菌株鑒定I、形態(tài)鑒定取15%甘油管冷凍保藏的的LS21菌液，將菌液濃度稀釋至104cfu/mL，取100 μ L涂布于LB平板(組分同分離培養(yǎng)基)，37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)48小時，觀察菌落形態(tài)菌落呈圓形，直徑約I 一 2_，邊緣光滑，濕潤，灰白色半透明，顯微鏡下觀察菌體呈短桿狀。2、生理生化鑒定對LS21菌株進(jìn)行革蘭氏染色鑒定，結(jié)果為革蘭氏陰性菌。3、分子鑒定檢測LS21菌株的16S rDNA序列，擴增16S rDNA序列的引物為通用引物16F5’ -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，16R 5’ -ACGGCTACCTTGTTACGACT-3’。測得的序列如序列表中的序列 所示。將該序列在NCBI中比對，結(jié)果該菌株與Halomonas sp.相似度達(dá)99%。綜合以上鑒定結(jié)果,將LS21菌株鑒定為鹽單胞菌(Halomonas sp.)。上述菌株LS21已于2012年9月20日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號)，保藏號為CGMCCNo. 6593,分類命名為鹽單胞菌(Halomonas sp.)。實施例2、鹽單胞菌(Halomonas sp. ) LS 21CGMCC No. 6593利用海水為介質(zhì)發(fā)酵中的應(yīng)用I、海水配制發(fā)酵培養(yǎng)基利用海水和餐廚垃圾即節(jié)約成本又節(jié)能環(huán)保，因此可以采用其作為培養(yǎng)基原料，基于上述目的，開發(fā)研究利用海水為介質(zhì)的發(fā)酵培養(yǎng)基可以采用天然海水，也可以采用與其組分相同或非常近似的人工海水配方(Mocledon配方)配置模擬；餐廚業(yè)有機垃圾中水分約占79%、干物料中粗脂肪約為29%、粗蛋白約占20%、淀粉占31%，可以采用混合C源、N源及相應(yīng)的配比模擬?！?br> 天然海水(NaCl含量約為26g/L)，用來配置發(fā)酵培養(yǎng)基后發(fā)酵培養(yǎng)基中所含主要離子含量如下Na+3537. 73mg/L、Mg2+543. 97mg/L、Ca2+210. 33mg/L ；K+105. 84mg/L ；0Γ7559. 70mg/L、S02_591. 75mg/L、Li+193. 0 μ g/L、Al2+3. 788 μ g/L、Br_37. 93 μ g/L ;天然海水于2012年8月2日采集于天津港碼頭近岸海邊，海水置于聚四氟乙烯塑料瓶內(nèi)密封保存。與下面人工海水相比，主要元素含量無顯著差異。人工海水的配方為Mocledon配方，每升去離子水中加入以下組分(為在發(fā)酵培養(yǎng)基A中的終濃度)氯化鈉(NaCl) 26. 726g/L，氯化鎂(MgCl2) 2. 26g/L,硫酸鎂(MgSO4) 3. 248g/L，氯化鈣(CaCl2) I. 153g/L,碳酸氫鈉(NaHCO3) O. 198g/L,氯化鉀(KCl)O. 721g/L，溴化鈉(NaBr)O. 058g/L，硼酸(H3BO3)O. 058g/L，硅酸鈉(Na2SiO3)O. 0024g/L，硅酸鈉(Na2Si4O9) 0.0015g/L，磷酸(H3PO4) 0. 002g/L，六氯化二鋁(Al2Cl6) 0. 013g/L,氨(NH3) 0. 002g/L，硝酸鋰(LiNO3)O. 0013g/L。每IL發(fā)酵培養(yǎng)基A (利用人工海水為介質(zhì))按照如下方法制備將200mL實施例I得到的秸桿纖維素浸提液、IOmL油酸、5g豬肉脂肪(市售的豬肉，取脂肪組織，將該脂肪勻漿成糊狀)、IOg可溶性淀粉、2g大豆蛋白粉和2g乳清蛋白粉混合，用人工海水補齊體積，用5M的NaOH溶液調(diào)節(jié)體系的pH值至11。每IL發(fā)酵培養(yǎng)基B (利用天然海水為介質(zhì))按照如下方法制備僅將發(fā)酵培養(yǎng)基A中的人工海水替換為天然海水。每IL含有微量元素發(fā)酵培養(yǎng)基按照如下方法制備將200mL實施例I得到的秸桿纖維素浸提液、IOmL油酸、5g豬肉脂肪、IOg可溶性淀粉、2g大豆蛋白粉、2g乳清蛋白粉和20mL由實施例I制備的微量元素混合溶液混合，用人工海水補齊體積，pH值為11。2、發(fā)酵I)細(xì)胞干重檢測3組發(fā)酵A組(LS 21 seawater):每個500mL的三角瓶裝入60mL發(fā)酵培養(yǎng)基A,接入鹽單胞菌(Halomonas sp. )LS 21CGMCC No. 6593,42°C, IOOrpm (旋轉(zhuǎn)半徑 15mm)下發(fā)酵培養(yǎng) 3 天，得到發(fā)酵液。
D組每個500mL的三角瓶裝入60mL發(fā)酵培養(yǎng)基B,接入鹽單胞菌(Halomonassp. ) LS 21CGMCC No. 6593,42°C, IOOrpm (旋轉(zhuǎn)半徑15mm)下發(fā)酵培養(yǎng)3天，得到發(fā)酵液。B組(加微量元素，LS 21seawater+MM):每個500mL的三角瓶裝入60mL含有微量元素發(fā)酵培養(yǎng)基，接入鹽單胞菌(Halomonas sp. )LS 21CGMCC No. 6593，42°C，IOOrpm (旋轉(zhuǎn)半徑為15mm)下發(fā)酵培養(yǎng)3天，得到發(fā)酵液。取各組25mL發(fā)酵液10000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘收集菌體，用去離子水洗滌兩次，冷凍冰干。冰干后菌體稱重計算細(xì)胞干重(CDW)。每個處理設(shè)3個平行。部分結(jié)果如圖I所示，A組(LS 21seawater)在不添加微量元素的發(fā)酵培養(yǎng)基A中生長，CDW可達(dá)到4. 06g/L ；B組(加微量元素，LS 21seawater+MM)在添加微量元素的發(fā)酵培養(yǎng)基中生長，CDW可達(dá)到4. 65g/L。而D組在發(fā)酵培養(yǎng)基B中生長，CDff結(jié)果與A組無顯著差異。從上述結(jié)果可以看出，微量元素不會顯著影響LS21生長，在不添加微量元素的發(fā)酵培養(yǎng)基A和發(fā)酵培養(yǎng)基B仍可以很好生長，另外，天然海水和人工海水不會顯著影響LS21生長。因此，處于成本考慮，采用發(fā)酵培養(yǎng)基A或發(fā)酵培養(yǎng)基B進(jìn)行下述研究。2) LS 21在唯一碳源的培養(yǎng)基中可產(chǎn)生PHA (聚羥基脂肪酸酯)3-輕基丁酸(3-hydroxybutyric acid, 3HB)為PHA中的單體,可以用來檢測是否產(chǎn)生PHA。每IL對照培養(yǎng)基(秸桿纖維素為唯一碳源的培養(yǎng)基):將由實施例I得到的秸桿纖維素浸泡液按比例加入NaCl (40g/L)及由實施例I中的組分I及由實施例I中的微量元素混合溶液，用5M的NaOH溶液將pH值調(diào)至10，待沉淀析出后，在5000rpm下離心5min，保留上清液作為秸桿纖維素培養(yǎng)基。C組(稻桿纖維素為唯一碳源)每個500mL的三角瓶裝入60mL對照培養(yǎng)基,接入鹽單胞菌(Halomonas sp. ) LS 21CGMCC No. 6593，42°C，IOOrpm 下發(fā)酵培養(yǎng) 3 天。取 25mL發(fā)酵液10000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘收集菌體，用去離子水洗滌兩次，冷凍冰干，C組CDW為3. 17g0取C組獲得的30mg冰干后菌體進(jìn)行酯化，氣相色譜(GC)檢測PHA含量，每個處理設(shè)3個平行。酯化方法為取30mg冰干菌體于酯化管中，加入2mL氯仿、2mL酯化液混勻，加蓋密閉，100°C烘箱中酯化4小時。冷卻至室溫后，加入ImL蒸餾水，充分振蕩混勻，靜置分層。待氯仿相與水完全分離后，取氯仿相進(jìn)行氣相色譜分析。IL酯化液配置方法Ig苯甲酸、30mL濃硫酸溶于970mL甲醇,得到酯化液。同時取IOmg的標(biāo)樣物質(zhì)進(jìn)行酯化。標(biāo)準(zhǔn)品為3-輕基丁酸(3-hydroxybutyric acid, 3HB),內(nèi)標(biāo)為苯甲酸Benzoic Acid (購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司；產(chǎn)品目錄號30018760)。氣相色譜(GC)分析依照島津公司GC-2014 (SHIMADZU, Japan)氣相色譜儀的說明書操作氣相色譜儀。設(shè)定柱頭溫度為80°C，進(jìn)樣器溫度為240°C，檢測器溫度為250°C，柱頭壓力為O. 25MPa，程序升溫條件為80°C I. 5分鐘，以35°C /分的速度升溫至140°C，再由40°C /分的速度升溫至280°C并在此溫度保持2分鐘。使用自動進(jìn)樣器進(jìn)樣，樣品進(jìn)樣量為I μ I。結(jié)果圖2所示,在如上氣相色譜條件下,標(biāo)準(zhǔn)品3-輕基丁酸(3-hydroxybutyricacid, 3HB)的保留時間2. 5±0. Imin，內(nèi)標(biāo)苯甲酸的保留時間為3. 7±0. Imin。樣品中3HB的保留時間2. 4min,內(nèi)標(biāo)苯甲酸的保留時間為3. 7min ;可以看出，發(fā)酵培養(yǎng)LS21產(chǎn)生了 3HB，C組產(chǎn)生3HB的含量為菌體干重的27. 19±6. 07%，從而證明其可積累PHA。可以看出，LS 21在秸桿纖維素為唯一碳源的培養(yǎng)基中可產(chǎn)生3HB和PHA。3)在混合碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵產(chǎn)生PHA和C16脂肪酸··分別取上述A組(發(fā)酵培養(yǎng)基A)、B組(含有微量元素發(fā)酵培養(yǎng)基)和D組(發(fā)酵培養(yǎng)基B)的30mg冰干后菌體進(jìn)行酯化，氣相色譜(GC)檢測3HB含量，每個處理設(shè)3個平行。氣相色譜(GC)分析依照島津公司GC-2014 (SHIMADZU, Japan)氣相色譜儀的說明書操作氣相色譜儀。設(shè)定柱頭溫度為80°C，進(jìn)樣器溫度為240°C，檢測器溫度為280°C，柱頭壓力為
O.25MPa，程序升溫條件為80°C 2. 5分鐘，以35°C /分的速度升溫至140°C，再由30°C /分的速度升溫至280°C并在此溫度保持2分鐘。使用自動進(jìn)樣器進(jìn)樣，樣品進(jìn)樣量為I μ I。標(biāo)準(zhǔn)品為標(biāo)準(zhǔn)品為3-輕基丁酸(3-hydroxybutyric acid, 3HB),內(nèi)標(biāo)為苯甲酸Benzoic Acid (購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司；產(chǎn)品目錄號30018760);棕櫚酸(又稱為C16的脂肪酸)購自東京化學(xué)試劑公司(TCI TOKYO CHEMICAL INDUSTRY Co. LTD)。部分結(jié)果如圖3所示，A為LS21在發(fā)酵培養(yǎng)基A (不加微量元素的人工海水培養(yǎng)基)中可以積累3HB和C16的脂肪酸(A組)，B為LS21在含有微量元素發(fā)酵培養(yǎng)基中可以積累3HB和C16的脂肪酸(B組)；在如上氣相色譜條件下，標(biāo)準(zhǔn)品中3-羥基丁酸(3-hydroxybutyric acid, 3HB)的保留時間2. 299min,內(nèi)標(biāo)苯甲酸的保留時間為3. 915min ；樣品中3HB的保留時間2. 300min,內(nèi)標(biāo)苯甲酸的保留時間為3. 908min ;可以看出，在發(fā)酵培養(yǎng)基A中發(fā)酵LS21可積累少量3HB，并能積累占菌體干重27. 37%的C16的脂肪酸(虛線框中色譜峰)。A組產(chǎn)生3HB的含量為菌體干重的9. 17± I. 01% ;B組產(chǎn)生3HB的含量為菌體干重的 4. 34 ± O. 42%ο檢測D組的結(jié)果為LS21在發(fā)酵培養(yǎng)基B (天然海水配制培養(yǎng)基)中也可以積累3HB.PHA和C16的脂肪酸，產(chǎn)生3HB的含量與A組無顯著差異。實施例2、利用LS21制備產(chǎn)生烷烴的重組菌一、利用LS21和集胞藍(lán)細(xì)菌相關(guān)基因制備產(chǎn)生烷烴的重組菌A通過導(dǎo)入集胞藍(lán)細(xì)菌(Synechocystissp. )PCC6803 (記載在 Accumulation ofpoly-β -hydroxybutyrate in cyanobacterium Synechocystissp. PCC6803,吳慶余等，Bioresource Technology, 76卷,第2期,2001, P85-90,公眾可從清華大學(xué)獲得)。菌株編碼的?；；d體蛋白還原酶(acyl-acyl carrier protein reductase)和乙醒脫羧酶(aldehyde decarbonylase)的基因在LS21中異源產(chǎn)生烷烴。集胞藍(lán)細(xì)菌PCC6803的?；；d體蛋白還原酶(sll0208 ;NP442147)，其編碼基因的核苷酸序列為序列表中序列I自5’末端第I位-1023位核苷酸，其氨基酸序列為序列表中的序列2 ;集胞藍(lán)細(xì)菌PCC6803的乙醛脫羧酶(sll0209 ；NC_000911. I)，其編碼基因的核苷酸序列為序列表中序列I自5’末端第1242位-1937位核苷酸，其氨基酸序列為序列表中的序列3。I、構(gòu)建重組菌LS21A以提取的集胞藍(lán)細(xì)菌PCC6803總DNA為模板，分別使用引物6803-F gtggTCTAGAcctcccccccagcaacttagactag (酶切位點為XbaI酶切位點(大寫部分))與引物6803-R ccggGGATCCccagcagcattgagctttgataatt (酶切位點為BamH I酶切位點(大寫部分))擴增，得到約2kb的PCR產(chǎn)物，經(jīng)過測序，該PCR產(chǎn)物為含有?；；d體蛋白還原酶和乙醛脫羧酶的片段，具有序列表中序列I所示的核苷酸，其中序列表中序列I自5’末端第I位-1023位核苷酸為酰基?；d體蛋白還原酶編碼基因，序列I自5’末端第1242位-1937位核苷酸為乙醛脫羧酶編碼基因。PCR擴增結(jié)束后，使用溶液回收純化的方法，純化PCR產(chǎn)物。將純化PCR產(chǎn)物經(jīng)XbaI和Bam I酶切后，與經(jīng)過同樣酶切的載體pBBRlMCSl (記載在 Kovach, Μ. E. Four new derivatives of the broad-host-range cloning vectorpBBRlMCS, earring different antibiotic-resistant cecassettes. Genel66(1995)175 -176，公眾可從清華大學(xué)獲得)連接，得到重組質(zhì)粒命名為pBBRlMCSl-A，經(jīng)過測序，該重組質(zhì)粒為將序列表中序列I插入pBBRlMCSl的XbaI和BamH I酶切位點間得到的載體。將重組質(zhì)粒pBBRlMCSl-A轉(zhuǎn)化到大腸桿菌S17-1 (記載在Plasmid cloningvectors for the conjugal transfer of DNA from Escherichia coli to Streptomycesspp. M. Bierman et al.，GENE, 116卷,第I期，1992, P43-49,公眾可從清華大學(xué)獲得)感受態(tài)細(xì)胞中，在含有25 μ g/mL氯霉素的LB平板上篩選得到陽性克隆。提取陽性克隆的質(zhì)粒，為pBBRlMCSl-A，將含有該質(zhì)粒的陽性克隆命名為S17-l/pBBRlMCSl_A。挑取S17-l/pBBRlMCSl_A菌落，在液體Lb培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)期，將S17-1/pBBRlMCSl-A和野生型鹽單胞菌(Halomonas sp. )LS 21 (實施例I得到)共培養(yǎng)，進(jìn)行接合轉(zhuǎn)化，得到重組菌LS21A。具體如下分別取供體菌S17-1/PBBR1MCS1-A和受體菌野生型鹽單胞菌(Halomonas sp. ) LS 21菌液各ImL, 6000rpm, I. 5min離心,去上清；再分別用普通LB和加鹽LB (NaCl 35g/L，pHIO)分別清洗供體菌和受體菌一次，重懸浮；取400ul供體菌和受體菌混合，6000rpm，I. 5min離心，去上清；用lOOulLB液體將混合物重懸浮，將所得菌液滴在LB (NaCl 20g/L不調(diào)pH不加抗生素)平板上，待菌液吹干后在37°C恒溫培養(yǎng)箱中正向靜置培養(yǎng)6h;用ImL液體LB (NaCl 35g/L，pHIO)將平板上的菌液沖洗下來，混勻，6000rpm，
I.5min離心，取上清；用500ul LB (NaCl 35g/L，pHIO)將菌體重懸浮，稀釋10倍、100倍后，分別取原液、10—1倍液和10_2倍液各200ul均勻涂布于LB (NaCl 35g/L，pHIO，加氨芐抗生素)平板上，37°C培養(yǎng)24h。接合轉(zhuǎn)化完成后，選取獲得氯霉抗性且經(jīng)PCR鑒定正確(弓丨物為6803-F和6803-R，得到2Kb的產(chǎn)物為正確轉(zhuǎn)化子)的轉(zhuǎn)化子，命名為重組菌LS21A。2、發(fā)酵重組菌LS21A產(chǎn)生烷烴將重組LS21A接種到實施例2制備的發(fā)酵培養(yǎng)基A (利用人工海水為介質(zhì))中，42°C、IOOrpm (旋轉(zhuǎn)半徑15mm)培養(yǎng)3天。取15mL培養(yǎng)物，離心10分鐘、lOOOOrpm，分別將上清液和菌體用甲醇進(jìn)行萃取，其中菌體細(xì)胞團(tuán)在甲醇中重懸，渦漩后超聲處理，破碎菌體后在進(jìn)行萃取，以IOOOOrpm離心I分鐘后，收集上清液。將上清液轉(zhuǎn)移到新的GC樣品瓶并通過GC進(jìn)行分析。色譜柱為HP-5毛細(xì)柱(柱長30m，內(nèi)徑O. 25mm)。I μ I無分流進(jìn)樣(入口溫度保持在300°C到GC/MS柱后，柱溫保持在100°C，持續(xù)3分鐘。以20°C /分鐘的速率將溫度升至320°C。柱溫保持在320°C柱溫5分鐘。運載氣體氦的流速是I. 5mL/分鐘。標(biāo)準(zhǔn)品為十一烷(CAS:1120-21-4),十三烷(CAS =629-50-5),十五烷(CAS 629-62-9)、十七烷(CAS :629-78-7)購自東京化學(xué)試劑公司(TCI TOKYO CHEMICALINDUSTRY Co. LTD)，內(nèi)標(biāo)為苯甲酸Benzoic Acid(購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司；產(chǎn)品目錄號:30018760)；結(jié)果如圖4和圖6所示，圖4為含有表達(dá)來源于集胞藍(lán)細(xì)菌的?；；d體蛋白還原酶和乙醛脫羧酶的重組LS21產(chǎn)生烷烴的GC圖譜；圖6為C11、C13、C15、C17烷烴標(biāo)準(zhǔn) 品GC圖譜；在如上氣相色譜條件下，標(biāo)準(zhǔn)品中i^一烷、十三烷、十五烷、十七烷的保留時間分別為4. 660min、6. 895min、
9.065min、ll. 456min和13. 188min，樣品中十三烷、十五烷和十七烷的保留時間分別為6. 891min、9. 053min和11. 442min,可以看出，產(chǎn)物峰的保留時間和與標(biāo)準(zhǔn)品一致，說明重組LS21A產(chǎn)生了十三烷、十五烷和十七烷，且產(chǎn)生量為I. 48 μ 1/mL的十三烷、O. 87 μ 1/mL的十五燒和O. 66 μ 1/mL的十七燒。采用同樣的方法將重組LS21A接種到實施例2制備的發(fā)酵培養(yǎng)基B (利用天然海水為介質(zhì))中，結(jié)果也產(chǎn)生了十三烷、十五烷和十七烷，且產(chǎn)生的量與在發(fā)酵培養(yǎng)基A中發(fā)酵結(jié)果無顯著差異。二、利用LS21和念珠藍(lán)細(xì)菌相關(guān)基因制備產(chǎn)生烷烴的重組菌B通過導(dǎo)入念珠藍(lán)細(xì)菌(Nostocsp. ) PCC 7120 (記載在 Characterizationof phytochelatin synthase-1 ike protein encoded by alr0975from aprokaryote, Nostocsp. PCC7120, Naoki Tsuji et al. , Biochemical and BiophysicalResearch Communications, 315卷,第3期,2004, P751-755,公眾可從清華大學(xué)獲得)。菌株編碼酰基?；d體蛋白還原酶(acyl - acyl carrier protein reductase)和乙醒脫羧酶(aldehyde decarbonylase)的基因在LS21中異源產(chǎn)生烷烴。念珠藍(lán)細(xì)菌PCC7210的?；；d體蛋白還原酶(alr5283;NP 489323. I，其編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列4自5’末端第938-1958位核苷酸，其氨基酸序列為序列表中的序列5 ;念珠藍(lán)細(xì)菌PCC7210乙醛脫羧酶(alr5284;NP-489324)，其編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列4自5’末端第1-696位核苷酸，其氨基酸序列為序列表中的序列6。I、構(gòu)建重組菌LS21B以提取的念珠藍(lán)細(xì)菌PCC7210總DNA為模板，分別使用引物7120-F (cgTCTAgagttagatcgccaagcacttgttt,酶切位點為 XbaI)與引物 7120_R(ccccGGATCCagttagggattaggtattgggtatt，酶切位點為BamH I )擴增，得到約2kb的PCR產(chǎn)物，經(jīng)過測序，該PCR產(chǎn)物為含有?；；d體蛋白還原酶和乙醛脫羧酶的片段，具有序列表中序列4所示的核苷酸，其中序列表中序列4自5’末端第938位-1958位核苷酸為酰基?；d體蛋白還原酶編碼基因，序列4自5’末端第I位-696位核苷酸為乙醛脫羧酶編碼基因。PCR擴增結(jié)束后，使用溶液回收純化的方法，純化PCR產(chǎn)物。將純化PCR產(chǎn)物經(jīng)XbaI和BamH I酶切后，與經(jīng)過同樣酶切的載體pBBRlMCSl連接，得到重組質(zhì)粒命名為pBBRlMCSl-B，經(jīng)過測序，該重組質(zhì)粒為將序列表中序列4插入pBBRlMCSl的XbaI和BamH I酶切位點間得到的載體。將重組質(zhì)粒pBBRlMCSl-B轉(zhuǎn)化到大腸桿菌S17-1感受態(tài)細(xì)胞中，在含有25 μ g/mL氯霉素的LB平板上篩選得到陽性克隆。提取陽性克隆的質(zhì)粒，為pBBRlMCSl-B，將含有該質(zhì)粒的陽性克隆命名為S17-l/pBBRlMCSl-B。挑取S17-l/pBBRlMCSl-B菌落，在液體Lb培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)期，將S17-1/pBBRlMCSl-B和野生型鹽單胞菌(Halomonas sp. )LS 21 (實施例I得到)共培養(yǎng)，進(jìn)行接合轉(zhuǎn)化，得到重組菌LS21B，方法同上。接合轉(zhuǎn)化完成后，選取獲得氯霉抗性且經(jīng)PCR鑒定正確 (引物為7120-F和7120-R，得到2Kb的產(chǎn)物為正確轉(zhuǎn)化子)的轉(zhuǎn)化子，為重組LS21B。2、發(fā)酵重組菌LS21B產(chǎn)生烷烴將重組LS21B接種到實施例2制備的發(fā)酵培養(yǎng)基A (利用人工海水為介質(zhì))中，42°C、IOOrpm (旋轉(zhuǎn)半徑15mm)培養(yǎng)3天。取15mL培養(yǎng)物，離心10分鐘、lOOOOrpm，分別將上清和菌體用甲醇進(jìn)行萃取，其中菌體細(xì)胞團(tuán)在甲醇中重懸，渦漩后超聲處理，破碎菌體后在進(jìn)行萃取，以IOOOOrpm離心I分鐘后。將上清液轉(zhuǎn)移到新的GC樣品瓶并通過GC進(jìn)行分析。色譜柱為HP-5毛細(xì)柱(柱長30m，內(nèi)徑0. 25mm)。I μ I無分流進(jìn)樣(入口溫度保持在300°C到GC/MS柱后，柱溫保持在100°C，持續(xù)3分鐘。以20°C /分鐘的速率將溫度升至300°C。柱溫保持在300°C柱溫5分鐘。運載氣體氦的流速是I. 5mL/分鐘。產(chǎn)物峰的保留時間和與標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比較以確認(rèn)
一致性。標(biāo)準(zhǔn)品為十一烷(CAS:1120-21-4),十三烷(CAS =629-50-5),十五烷(CAS 629-62-9)、十七烷(CAS :629-78-7)購自東京化學(xué)試劑公司(TCI TOKYO CHEMICALINDUSTRY Co. LTD)，內(nèi)標(biāo)為苯甲酸Benzoic Acid(購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司；產(chǎn)品目錄號:30018760)；結(jié)果如圖5-圖7所示，圖5為含有表達(dá)來源于念珠藍(lán)細(xì)菌的?；；d體蛋白還原酶和乙醛脫羧酶的重組LS21B產(chǎn)生烷烴的GC圖譜；圖6為C11、C13、C15、C17烷烴標(biāo)準(zhǔn)品GC圖譜；圖7為重組LS21B產(chǎn)生烷烴和烷烴標(biāo)準(zhǔn)品的復(fù)合比較的GC圖譜；在如上氣相色譜條件下，標(biāo)準(zhǔn)品中i^一烷、十三烷、十五烷、十七烷的保留時間分別為 4. 660min、6. 895min、9. 065min、11. 456min 和 13. 188min ;樣品中十三烷、十五烷和十七烷的保留時間分別為6. 884min、9. 042min和11. 436min ;可以看出，產(chǎn)物峰的保留時間和與標(biāo)準(zhǔn)品一致，說明重組LS21B產(chǎn)生了十三烷、十五烷和十七烷，且產(chǎn)生量為I. 72 μ 1/mL的十三烷、0. 92 μ 1/mL的十五烷和0. 73 μ 1/mL的十七烷。采用同樣的方法將重組LS21A接種到實施例2制備的發(fā)酵培養(yǎng)基B (利用天然海水為介質(zhì))中，結(jié)果也產(chǎn)生了十三烷、十五烷和十七烷，且產(chǎn)生的量與在發(fā)酵培養(yǎng)基A中發(fā)酵結(jié)果無顯著差異。
權(quán)利要求
1.鹽單胞菌(Halomonassp. ) LS 21，其保藏編號為 CGMCC No. 6593。
2.權(quán)利要求I所述的鹽單胞菌(Halomonassp. )LS 21在制備聚輕基脂肪酸酯/3-輕基丁酸和/或脂肪酸中的應(yīng)用；所述脂肪酸具體為C16脂肪酸。
3.—種重組菌，為將?；；d體蛋白還原酶編碼基因和乙醛脫羧酶編碼基因均導(dǎo)入宿主菌中，得到重組菌。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組菌，其特征在于所述宿主菌為鹽單胞菌(Halomonassp.);所述鹽單胞菌(Halomonas sp.)具體為權(quán)利要求I所述的鹽單胞菌(Halomonas sp.)LS 21 ； 所述?；；d體蛋白還原酶和所述乙醛脫羧酶具體均來自藍(lán)細(xì)菌； 所述藍(lán)細(xì)菌進(jìn)一步具體為集胞藍(lán)細(xì)菌(Synechocystis sp.)或念珠藍(lán)細(xì)菌(Nostocsp.)。
5.權(quán)利要求3或4所述的重組菌在制備烷烴中的應(yīng)用；所述烷烴具體為十三烷、十五燒和/或十七燒。
6.一種發(fā)酵培養(yǎng)基，由C源、N源和海水組成； 所述C源為秸桿纖維素浸提液、油酸、動物脂肪和可溶性淀粉中的至少一種； 所述N源為大豆蛋白和乳清蛋白中的至少一種； 所述海水為天然海水或人工海水； 所述秸桿纖維素浸泡液按照如下方法制備將秸桿在NaOH水溶液浸泡，收集液體即為稻桿纖維素浸泡液。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于 所述發(fā)酵培養(yǎng)基由所述秸桿纖維素浸提液、所述油酸、所述動物脂肪、所述可溶性淀粉、所述大豆蛋白、所述乳清蛋白和所述海水組成； 所述秸桿纖維素浸提液、所述油酸、所述動物脂肪、所述可溶性淀粉、所述大豆蛋白和所述乳清蛋白的配比為 150-400ml 5-20ml :3_10g :5_20g :l_4g 2g ； 所述動物脂肪具體為家禽脂肪；所述家禽脂肪進(jìn)一步具體為豬肉脂肪； 所述發(fā)酵培養(yǎng)基的PH值為5. 0-11. O,具體為5. O或9. O或11. O ; 所述天然海水中NaCl的終濃度為20g/L至50g/L。
8.一種制備聚羥基脂肪酸酯/3-羥基丁酸和/或脂肪酸的方法，為發(fā)酵權(quán)利要求I所述的鹽單胞菌(Halomonas sp. )LS 21，即得到聚羥基脂肪酸酯/3-羥基丁酸和/或脂肪酸；所述脂肪酸具體為C16脂肪酸。
9.一種制備烷烴的方法，包括如下步驟發(fā)酵權(quán)利要求3或4所述的重組菌，即得到烷烴； 所述烷烴具體為十三烷、十五烷和/或十七烷。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的方法，其特征在于 所述發(fā)酵采用的培養(yǎng)基為權(quán)利要求6或7所述的發(fā)酵培養(yǎng)基； 所述發(fā)酵的溫度為20°C _45°C，所述發(fā)酵的溫度具體為20°C或42°C或45°C ； 所述發(fā)酵的轉(zhuǎn)速為IOOrpm (旋轉(zhuǎn)半徑15mm)； 所述發(fā)酵時間為24至96小時。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種以海水為介質(zhì)生產(chǎn)燃料用碳?xì)浠衔锏姆椒皩Ｓ镁?。該菌株為鹽單胞菌(Halomonas sp.)LS21，其保藏編號為CGMCC No.6593。本發(fā)明的實驗表明，Halomonas sp.LS21及其基因重組菌株可以在以天然海水為發(fā)酵介質(zhì)，利用多種廉價碳、氮源-包括經(jīng)預(yù)處理的纖維素、半纖維素、廢棄油脂及餐廚垃圾等為底物，生產(chǎn)以主要組成為烷烴、烯烴及長鏈脂肪酸的碳?xì)浠衔铩４祟愄細(xì)浠衔锝?jīng)分離后可作為生物燃料使用；且發(fā)酵過程可以實現(xiàn)不滅菌連續(xù)發(fā)酵。本發(fā)明中的鹽單胞菌及其重組菌株營養(yǎng)要求簡單、發(fā)酵過程無需滅菌且可連續(xù)進(jìn)行，簡單易控、低成本、具有良好的工業(yè)應(yīng)用前景。
文檔編號C12P7/62GK102925382SQ20121036962
公開日2013年2月13日 申請日期2012年9月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月27日
發(fā)明者陳國強, 岳海濤, 尹進(jìn) 申請人:清華大學(xué)