專利名稱：殺菌通透性增強(qiáng)蛋白基因作為豬一般抗病力遺傳標(biāo)記的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于豬遺傳育種及分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及豬一般抗病力遺傳標(biāo)記的篩選和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
隨著集約化飼養(yǎng)管理方式的普及，在養(yǎng)豬業(yè)生產(chǎn)中，疾病的危害極易給畜牧業(yè)生產(chǎn)帶來重大損失。在美國，每年由于豬病而付出的費(fèi)用超出15億美元。這一巨大的經(jīng)濟(jì)損失主要是由于豬只死亡、生產(chǎn)效率降低、醫(yī)藥費(fèi)用增加以及產(chǎn)品損失造成的。在應(yīng)激的生產(chǎn)條件下，對重要經(jīng)濟(jì)性狀施加的選擇壓，也會導(dǎo)致疾病發(fā)生率的增加。疾病會使選擇的效率降低，影響生產(chǎn)性狀的遺傳改進(jìn)。目前，對畜禽疾病的控制措施，主要是采用疫苗接種和抗菌素類藥物治療，然而，由于病菌類型繁多且變化快，疫苗的使用并不總是有效，同時濫用抗菌素會導(dǎo)致畜產(chǎn)品攜帶大量殘留藥物，成為藥物食品(Drug-food)，對人類的健康產(chǎn)生不良影響，現(xiàn)在許多國家紛紛開始禁止進(jìn)口藥物食品和限制抗菌素在畜禽治療中的應(yīng)用，因此在培育高產(chǎn)品種的同時，尋找一條安全可靠且經(jīng)濟(jì)可行的畜禽疾病防治途徑，己是科學(xué)家和畜牧生產(chǎn)者共同 關(guān)心的緊迫問題。為了獲得更多的疾病防治方法，必須清楚地了解動物的免疫抗病系統(tǒng)及致病機(jī)理。疾病的發(fā)生一般是動物的遺傳背景與其所處環(huán)境之間相互作用的結(jié)果。若某一動物在遺傳上對一種疾病易感，則環(huán)境條件(包括常規(guī)疾病防治方法)可能僅對疾病的防治部分有效。一個可取代疾病常規(guī)防治法是針對提高家畜抗病力進(jìn)行選擇性育種。遺傳性抗病力包括了機(jī)體免疫抗病系統(tǒng)及其相互作用的許多方面，因而極為復(fù)雜。目前從根本上開展豬的抗性遺傳機(jī)制研究，進(jìn)行抗病育種，已引起了國內(nèi)外學(xué)者的高度重視。病原體在傳染過程中，會遇到3道防御機(jī)制，即上皮防御機(jī)制、非特異性防御機(jī)制和特異性防御機(jī)制。當(dāng)個體受到病原體侵染時，會調(diào)動這3方面的防御機(jī)制加以抵抗。豬是否發(fā)病取決于侵染和防御機(jī)能相互作用的結(jié)果，防御機(jī)能加強(qiáng)的豬便表現(xiàn)出自然抗病力。抗病力按遺傳基礎(chǔ)的不同可分為特殊抗病力和一般抗病力。特殊抗病力是指豬對某種特定疾病或病原體的抗性，這種抗性主要受一個主基因位點(diǎn)控制，同時也可不同程度地受其它位點(diǎn)(包括調(diào)控子)及環(huán)境因素影響?，F(xiàn)有的研究結(jié)果表明，特殊抗病力的內(nèi)在機(jī)理在于宿主體內(nèi)存在或缺少某種分子或其變體，這不僅能決定異體識別及特異性異體反應(yīng)，還能決定病原體的特殊附著力，病原體進(jìn)入體內(nèi)后在體內(nèi)增殖，能否導(dǎo)致宿主發(fā)病。一般抗病力不限于抗某一種病原體，它受多基因和環(huán)境的綜合影響，病原體的抗原性差異對一般抗病力影響極小，甚至根本沒有影響，這種抗病力體現(xiàn)了機(jī)體對疾病的整體防御功能。研究發(fā)現(xiàn)，不少豬病的發(fā)病機(jī)制與豬本身的遺傳背景有關(guān)，即豬可能對一些疾病存在完全或部分抗性。廣義上講，任何疾病的發(fā)生都是遺傳與環(huán)境因素共同作用的結(jié)果，幾乎所有疾病都與遺傳有關(guān)。狹義上講，遺傳病是由于生殖細(xì)胞或受精卵中遺傳物質(zhì)發(fā)生了結(jié)構(gòu)或功能上的變異所致。因此，從長遠(yuǎn)角度來看，采用遺傳學(xué)方法從遺傳基礎(chǔ)上提高豬對疾病的一般抗性具有治本的功效。而一般抗性是維持豬在不良環(huán)境中生存和生產(chǎn)的必要條件，因此培育具有一般抗性的豬種成為育種領(lǐng)域的主要課題之一，篩選和確定豬一般抗病力的遺傳標(biāo)記已成為培育具有一般抗性豬種的當(dāng)務(wù)之急和關(guān)鍵所在。細(xì)胞因子在機(jī)體免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮了重要的輔助性作用，IL-2能夠促進(jìn)T、B細(xì)胞的增殖，在抗腫瘤、抗毒素及免疫調(diào)節(jié)方面發(fā)揮了重要的作用；IL_4能夠誘導(dǎo)MHC-1I類抗原的表達(dá)，并增強(qiáng)其對腫瘤細(xì)胞和寄生蟲的殺傷性；IL-6能夠促進(jìn)IL-2及其受體的表達(dá)，在免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)及造血過程中起到重要作用；IL-10是一個抗炎性因子，參與機(jī)體天然免疫的調(diào)節(jié)；IL_12主要在細(xì)胞免疫和I型細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫中起作用；IFN-Beta能夠抑制病毒蛋白的合成，誘導(dǎo)MHC-1類抗原的增加，從而調(diào)劑機(jī)體的免疫功能。上述重要細(xì)胞因子的水平是機(jī)體免疫應(yīng)答能力和一般抗病力的重要標(biāo)志。殺菌通透性增強(qiáng)蛋白(bactericidal/permeability-1ncreasingprotein, BPI)是人和哺乳動物的內(nèi)源性陽離子蛋白質(zhì)，主要存在于多形核白細(xì)胞(Ploymorphneclearleukocytes, PMNs)的嗜苯胺藍(lán)顆粒中。BPI除了能殺滅G-菌，中和內(nèi)毒素或脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)的活性外，還有調(diào)理功能、促進(jìn)補(bǔ)體活化，增強(qiáng)吞卩遼的調(diào)理功能、抑制血管生成、抑制炎性介質(zhì)釋放、抗真菌和原蟲等一系列生物學(xué)功能，在動物機(jī)體天然防御中起到了很重要的作用。具有生物活性的BPI是LPS的天然抑制物，而LPS可以激活單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)釋放細(xì)胞因子(如TNFa、IL6、IL2等)，引起全身炎癥反應(yīng)，故BPI基因可以間接影響部分免疫指標(biāo)水平，是研究動物抗病育種的重要候選基因。國內(nèi)外關(guān)于豬BPI基因的多態(tài)性及其對疾病的抗性/易感性相關(guān)的研究鮮見報(bào)道，在美國專利網(wǎng)中有一段關(guān)于豬BPI基因的序列，長1452bp，沒有清楚的注釋，現(xiàn)將其命名為專利 BPI 序列(United States, Kind Code:Al, Patent Application:20040234980)。在此專利的公開信息中，Christopher等在約克、漢普夏、杜洛克、長白、大白、野豬和眉山豬中，檢測到BPI基因外顯子4和10分別存 在Ava II和HpaII酶切多態(tài)性，通過攻毒試驗(yàn)表明其基因型與豬沙門氏菌的易感性有關(guān)，并把BPI基因確立為抗沙門氏菌病育種候選基因。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是用BPI基因外顯子4和10多態(tài)位點(diǎn)組合基因型作為豬一般抗病力的分子標(biāo)記及其檢測方法與應(yīng)用。檢測該分子標(biāo)記的方法包括待測樣品的豬基因組DNA的提取及其PCR擴(kuò)增，外顯子4的PCR產(chǎn)物經(jīng)SSCP分析和外顯子10的PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶Hpa II的酶切，當(dāng)待測豬個體基因型為CDAB型(外顯子4的PCR產(chǎn)物經(jīng)SSCP分析出現(xiàn)4條帶且外顯子10的PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶Hpa II酶切出現(xiàn)445bp/304bp/ 142bp條帶)，則為一般抗病力強(qiáng)的個體。其中，外顯子4的引物A如SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示；外顯子10的引物B如 SEQ ID N0.3 和 SEQ ID N0.4 所示。本發(fā)明為從遺傳素質(zhì)上永久性地提高仔豬一般抗病力和免疫應(yīng)答能力提供了有效的分子標(biāo)記。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)體現(xiàn)在:I)本發(fā)明為豬抗病育種工作的分子標(biāo)記輔助選擇提供一個更加高效準(zhǔn)確的分子遺傳標(biāo)記，為提高仔豬一般抗病力提供了一種有效的分子標(biāo)記育種手段。用該遺傳標(biāo)記對豬一般抗病力進(jìn)行標(biāo)記輔助選擇，豬抗逆性入手開展抗病育種，提高豬的免疫應(yīng)答能力，可以更有效地解決豬很多疾病如呼吸道疾病與環(huán)境相互作用的問題，從根本上降低諸多疾病的發(fā)病率。2)使用2個變異位點(diǎn)的組合基因型作為標(biāo)記，基因聚合效應(yīng)并不是各個位點(diǎn)效應(yīng)的簡單相加，合并基因型效應(yīng)高于單個基因型效應(yīng)，為加速改善仔豬抗病能力的分子育種奠定了基礎(chǔ)，將加快育種進(jìn)程。3)本發(fā)明的檢測方法操作簡單，費(fèi)用較為低廉，準(zhǔn)確度高，并可實(shí)現(xiàn)自動化的直接檢測，本發(fā)明將在豬的育種中發(fā)揮巨大作用。


圖1為BPI基因 第4外顯子PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的SSCP分析圖；其中第I泳道為DD基因型；2-3泳道為CC基因型；4-5泳道為⑶基因型。圖2為BPI基因第10外顯子酶切后3種基因型的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖；其中M為 pUC19DNA/MSp I (HapII)marker，第 2、6、8、11、12 泳道為 AA 基因型；第 4、10 泳道為 BB基因型，第1、3、5、7、10泳道為AB基因型。
具體實(shí)施例方式一、利用BPI基因第4外顯子和第10外顯子變異位點(diǎn)標(biāo)記對蘇太豬核心群全面檢測基因型。每個個體采耳組織塊約1.0g,放入1.5mL的Eppendoff管內(nèi)于冰盒中取回?fù)P州大學(xué)動物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)學(xué)科實(shí)驗(yàn)室備用。按常規(guī)酚-氯仿法提取DNA。提取的DNA用核酸蛋白測定儀測定其含量和純度，-20°C保存?zhèn)溆谩Ｍㄟ^NCBI的 BLAST 找到豬的 21 條染色體的mapview,經(jīng)過blast search againstpig sequences,找一段refseq序列(非冗余的)BPI mRNA序列EF436278并選擇高通量測試數(shù)據(jù)庫(HTGS)，從而找到一條同源性達(dá)到99%的序列，這一段是包含BPI全序列的高通量測試序列，序列號為FP339579.2，但并未注釋。然后通過NCBI上的spidey進(jìn)行非冗余的mRNA與此高通量結(jié)果比對就可以得出BPI共有15個外顯子的全部信息，然后選取外顯子4和10等序列,利用Primer Premier5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)(表I)。表IBPI基因外顯子4和10引物設(shè)計(jì)
權(quán)利要求
1.殺菌通透性增強(qiáng)蛋白基因作為豬一般抗病力遺傳標(biāo)記的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于具體包括以下步驟: (I)提取待測樣本的耳組織DNA，備用； (2 ) PCR擴(kuò)增:以步驟(I)的DNA為模板，用下述引物A和引物B分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 引物A: 上游引物為:5’ -TCAGGTTGGTTACCGCAGAG -3’ 下游引物為:5’ -ACCCTGTTGATGTGGCTTCT -3’ 引物B: 上游引物為:5、CCCAACATGGAGATGCAGTTC -3^ 下游引物為:5'CAATGAATCAATGAGCACACC -3λ ； (3)引物A的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用SSCP方法進(jìn)行分析，引物B的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶//酶切后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳銀染分析，選擇引物A擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)4條帶且同時引物B擴(kuò)增產(chǎn)物出 現(xiàn)445 bp/304 bp/142 bp條帶的樣本為一般抗病力強(qiáng)的個體。
全文摘要
本發(fā)明涉及篩選一種豬一般抗病力BPI基因第4和10外顯子變異位點(diǎn)組合基因型的遺傳標(biāo)記，屬于豬遺傳育種及分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明方法包括待測樣品的豬基因組DNA的提取及其PCR擴(kuò)增，外顯子4的PCR產(chǎn)物經(jīng)SSCP分析和外顯子10的PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶HpaII的酶切，當(dāng)待測豬個體基因型為CDAB型，則為一般抗病力強(qiáng)的個體。本發(fā)明為豬抗病育種工作的分子標(biāo)記輔助選擇提供一個更加高效準(zhǔn)確的分子遺傳標(biāo)記，為提高仔豬一般抗病力和免疫應(yīng)答能力提供了一種有效的分子標(biāo)記育種手段，本發(fā)明的檢測方法操作簡單，費(fèi)用較為低廉，準(zhǔn)確度高，并可實(shí)現(xiàn)自動化的直接檢測，本發(fā)明將在豬的育種中發(fā)揮巨大作用。
文檔編號C12Q1/68GK103173531SQ20121036986
公開日2013年6月26日 申請日期2012年9月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月27日
發(fā)明者包文斌, 吳圣龍, 潘章源, 吳正常, 霍永久, 朱國強(qiáng), 黃小國, 黃雪根, 陳洪青, 孫壽永 申請人:揚(yáng)州大學(xué)