導(dǎo)入sv40t基因構(gòu)建神經(jīng)管缺陷細(xì)胞模型及其細(xì)胞庫的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的導(dǎo)入SV40T基因構(gòu)建神經(jīng)管缺陷細(xì)胞模型及其細(xì)胞庫，其主要特征是按常規(guī)以T4DNA連接酶、BamHI、pcDNA3.1(-)DNA及SV40LTag DNA構(gòu)建SV40LTag-pcDNA3.1(-)重組子、以感受態(tài)大腸桿菌純化重組子、以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將其導(dǎo)入經(jīng)膠原酶II消化的離體傳代或呈對數(shù)生長的神經(jīng)管缺陷組織細(xì)胞，使重組子與細(xì)胞的DNA整合，并擴大培養(yǎng)經(jīng)G418篩選含陽性重組子的細(xì)胞克隆，篩選細(xì)胞形態(tài)、生長曲線、染色體核型、軟瓊脂集落生長、裸鼠致瘤試驗、轉(zhuǎn)染細(xì)胞DNA中SV40大T基因檢測、mRNA表達產(chǎn)物測定及DNA序列測定結(jié)果符合永生化細(xì)胞特性并與原代細(xì)胞相同或相近者作為SV40T基因介導(dǎo)神經(jīng)管缺陷體外研究細(xì)胞模型凍存于液氮中，為在體外從細(xì)胞水平長期研究其發(fā)病機制奠定基礎(chǔ)。
【專利說明】導(dǎo)入SV40T基因構(gòu)建神經(jīng)管缺陷細(xì)胞模型及其細(xì)胞庫

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及導(dǎo)入SV40T基因(猴腎病毒40大T抗原基因或SV40LT抗原基因)構(gòu)建神經(jīng)管缺陷細(xì)胞模型及其細(xì)胞庫，主要用于新生兒出生缺陷干預(yù)研究領(lǐng)域，為神經(jīng)管缺陷的研究提供細(xì)胞模型并保存其科研資源。

【背景技術(shù)】
[0002]神經(jīng)管缺陷又名神經(jīng)管畸形，是一種常見而嚴(yán)重的先天缺陷。神經(jīng)管是胎兒的中樞神經(jīng)系統(tǒng)，在胚胎的第15-17日開始，神經(jīng)系統(tǒng)開始發(fā)育，至胚胎22日左右，神經(jīng)褶的兩側(cè)開始互相靠攏，形成I個管道，稱為神經(jīng)管，它的前端稱為神經(jīng)管前孔，尾端稱為神經(jīng)管后孔，胚胎在24-25日及26日時，前孔及后孔相繼關(guān)閉。胎兒神經(jīng)管畸形主要表現(xiàn)為無腦兒、腦膨出、腦脊髓膜膨出、隱性脊柱裂、唇裂及腭裂、開放性脊柱裂、閉合性脊柱裂等。我國每年出生的2300萬新生兒中，有近40萬患有各種先天性疾病，其中神經(jīng)管畸形的發(fā)生率為0.2% -0.4%。
[0003]有研究表明，人類大腦是在神經(jīng)管上發(fā)育而形成的，如在妊娠3-4周起至4個月，孕婦缺乏葉酸，便可能導(dǎo)致胎兒出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)系統(tǒng)先天性畸形。許多種類基因的表達或突變與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、神經(jīng)管畸形有關(guān)，這些基因是轉(zhuǎn)錄因子，包括①發(fā)育調(diào)節(jié)基因及轉(zhuǎn)錄因子類基因。②原癌基因和抑癌基因。③生長因子及其受體基因。④蛋白激酶C相關(guān)基因。⑤同型半胱氨酸代謝相關(guān)基因。⑥其他基因:細(xì)胞骨架類、細(xì)胞連接類基因等。神經(jīng)管畸形發(fā)生的重要因素是妊娠期間孕婦體內(nèi)缺乏葉酸，因此孕婦在孕前I個月至孕后4個月內(nèi)，每日口服I次葉酸0.4毫克，就可使胎兒神經(jīng)管畸形發(fā)生率降低70%。盡管如此，神經(jīng)管畸形的發(fā)病機制、如何更好地預(yù)防、干預(yù)或治療，還有待于更進一步的研究。
[0004]但是，由于沒有可在體外長期培養(yǎng)的、可用于神經(jīng)管畸形發(fā)病機制研究的永生細(xì)胞模型及其細(xì)胞庫，就難以從細(xì)胞水平在體外研究神經(jīng)管缺陷細(xì)胞受物理、化學(xué)、生物、遺傳等影響的基因突變、基因表達、功能改變、生理特性、生物傳導(dǎo)等機制，從而較嚴(yán)重地限制了神經(jīng)管缺陷的進一步研究。
[0005]國外文獻報道，猴腎病毒40 (SV40)可以使某些人類細(xì)胞發(fā)生永生化。Poulin DL、Kung AL和Sullivan CS等研究表明，SV40T抗原基因的導(dǎo)入能加快轉(zhuǎn)化細(xì)胞的生長速率，永生化細(xì)胞在體外多次傳代后，仍具有相對穩(wěn)定的增殖特性和功能狀態(tài)，同時也能保留其原始細(xì)胞的許多分化表型，可以用于轉(zhuǎn)基因動物模型及人類和動物某些種類的細(xì)胞模型的建立，據(jù)此可以借助于研究轉(zhuǎn)基因永生化細(xì)胞及動物模型而在體外研究原始細(xì)胞的特性，從而研究其發(fā)病機制。
[0006]根據(jù)文獻報道，Reilly用猿猴病毒(SV40)大T抗原基因轉(zhuǎn)化來建立血管平滑肌細(xì)胞株，構(gòu)建細(xì)胞模型以研究肝素對血管平滑肌的抑制作用機制。Su等利用經(jīng)SV40轉(zhuǎn)化的角化上皮細(xì)胞株，構(gòu)建細(xì)胞模型來分析上皮細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成的調(diào)控作用。Miquel等用SV40轉(zhuǎn)化的角化上皮細(xì)胞株，作為細(xì)胞模型研究層粘連蛋白5介導(dǎo)的細(xì)胞粘附作用。Webber等用經(jīng)SV40轉(zhuǎn)化的前列腺上皮細(xì)胞株作為細(xì)胞模型來研究前列腺上皮細(xì)胞的生理功能和分泌功能。Racusen等用經(jīng)Adl2_SV40轉(zhuǎn)化腎小管上皮細(xì)胞模型來研究近曲小管的損傷和疾病。Hougton等用SV40轉(zhuǎn)化建立骨髓基質(zhì)細(xì)胞株作為細(xì)胞模型以研究在一定培養(yǎng)條件下，細(xì)胞具有向脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞的雙向分化的潛能，進一步研究骨質(zhì)疏松的機制。
[0007]因研究工作的需要，幾乎每種疾病都建立了各自的細(xì)胞模型。如糖尿病細(xì)胞模型、癌細(xì)胞細(xì)胞模型、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞模型、絕經(jīng)期綜合癥細(xì)胞模型、子宮內(nèi)膜細(xì)胞模型、癲癇細(xì)胞模型、電子細(xì)胞模型、酒精性癡呆細(xì)胞模型、腦水腫細(xì)胞模型。等等。
[0008]但是，至今尚未見有關(guān)構(gòu)建可用于在體外從細(xì)胞水平研究神經(jīng)管缺陷發(fā)病機制的永生細(xì)胞模型及其細(xì)胞庫的文獻報道，也無法開展相關(guān)的研究項目。為了解決上述問題，本發(fā)明人提出了本發(fā)明。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明的目的是要提供以SV40LT抗原基因介導(dǎo)(導(dǎo)入)神經(jīng)管缺陷細(xì)胞模型及其細(xì)胞庫的構(gòu)建方法，另一目的是為在體外從細(xì)胞水平研究神經(jīng)管缺陷的發(fā)病機制提供SV40LT抗原基因介導(dǎo)神經(jīng)管缺陷細(xì)胞模型及其細(xì)胞庫。
[0010]本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的:以T4DNA連接酶連接同時經(jīng)BamHI酶切的pcDNA3.1 (-)DNA和PCR擴增、瓊脂糖凝膠電泳分離的SV40LTag DNA,構(gòu)建SV40LTag-pcDNA3.1 (-)重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化DH5a大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞以擴增、純化并挑取耐氨芐青霉素的菌落抽提質(zhì)粒，以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法導(dǎo)入經(jīng)膠原酶II消化的離體傳代神經(jīng)管缺陷羊水組織細(xì)胞或在含20%胎牛血清、5?lOnmol/L胰島素的培養(yǎng)液中處于將進入或剛進入對數(shù)生長期、梭形細(xì)胞占90%以上、匯合率達55%?65%的貼壁生長神經(jīng)管缺陷組織細(xì)胞，使重組子與細(xì)胞的DNA整合，以G418篩選的含陽性重組子的細(xì)胞，作傳代、擴大培養(yǎng)，篩選細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞生長曲線、染色體核型、軟瓊脂集落生長試驗、裸鼠致瘤試驗、轉(zhuǎn)染細(xì)胞DNA中SV40大T基因檢測、mRNA表達產(chǎn)物測定及DNA序列測定結(jié)果符合永生化細(xì)胞特性并與原代細(xì)胞相同或相近者作為細(xì)胞模型凍存于液氮中，以此構(gòu)建SV40LT抗原基因介導(dǎo)神經(jīng)管缺陷細(xì)胞模型及其細(xì)胞庫。
[0011]本發(fā)明以PCR擴增、瓊脂糖凝膠電泳提純的SV40大T抗原基因經(jīng)基因載體PCDNA3.1和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法導(dǎo)入神經(jīng)管缺陷羊水組織細(xì)胞而構(gòu)建其細(xì)胞模型，其組織細(xì)胞用0.01%膠原酶II消化而不用常規(guī)的胰蛋白酶消化，以僅使引起細(xì)胞粘連的膠原被消化或使細(xì)胞懸浮，減少了細(xì)胞壁的蛋白質(zhì)被消化而傷及細(xì)胞，使細(xì)胞培養(yǎng)的成功率由一般的約85%提高到95%以上；選用了含20mL/L胎牛血清、5?lOnmol/L胰島素的特定培養(yǎng)基，使細(xì)胞不會生長過快而影響SV40大T抗原基因的整合，也不會因缺少營養(yǎng)或細(xì)胞生長刺激因子而使細(xì)胞在未達到要求的匯合率、未進入對數(shù)生長期前就過早死亡，或?qū)?shù)生長期縮短；制備的細(xì)胞系在_196°C液氮中凍存I個月后復(fù)蘇培養(yǎng)，均能生長出貼壁細(xì)胞；在作細(xì)胞系染色體鑒定時，秋水仙素的用量及作用時間是常規(guī)的5?10倍，使染色體分裂相增加，足以計數(shù)和分析；由此建成的神經(jīng)管缺陷細(xì)胞模型及其細(xì)胞庫，為從細(xì)胞水平在體外研究神經(jīng)管缺陷的發(fā)病機制奠定基礎(chǔ)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1是本發(fā)明制備的神經(jīng)管缺陷細(xì)胞模型(貼壁生長)圖。
[0013]如圖1，細(xì)胞傳代至第78代、培養(yǎng)至第11天時，呈對數(shù)生長、圓形、梭形、鋪滿瓶底，其細(xì)胞生長匯合率達85%以上，此后隨著傳代次數(shù)的增加，細(xì)胞生長變慢、變稀疏。

【具體實施方式】
[0014]1、SV40大T抗原DNA的提取:①SV40DNA酶切:從市售購買含有大T抗原基因的SV40冰凍干粉或SV40質(zhì)粒，溶解于適量的H2O或TE緩沖液中，加2uL10X酶切緩沖液和18uL H20，加限制性內(nèi)切酶BamH I (l_5U/ugDNA)，37°C溫育lh，75°C加熱15min，滅活酶，力口入5uL電泳加樣緩沖液(也可通過加入0.5mol/L EDTA)終止反應(yīng)以備電泳。②SV40DNA電泳:取電泳級瓊脂糖以電泳緩沖液配成10%瓊脂糖凝膠，倒入已封好的凝膠灌制平臺上，插上樣品梳，待膠凝固后從制膠平臺上除去封帶，拔出梳子，放入加有足夠電泳緩沖液的電泳槽中，緩沖液高出凝膠表面約1mm，用適量的1X加樣緩沖液制備DNA樣品，然后用移液器將樣品加入樣品孔中，并同時做合適的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)對照物，接通電極，使DNA向陽極移動，在1-lOV/cm凝膠的電壓下電泳至足夠分離DNA片段的距離時，關(guān)閉電源。③從瓊脂糖中分離約2600bp SV40大T抗原DNA:在300-360nm長波紫外光源下(使用長波紫外光源以防止DNA損傷)將含目標(biāo)DNA片段的凝膠條帶切下裝入透析袋中，向透析袋內(nèi)加入2ml電泳緩沖液，使之浸沒凝膠，并排空汽泡，將透析袋水平放入電泳槽(長度方向與電泳平行)，加入適量緩沖液將透析袋浸沒(約6-7mm)，接通電源，150伏電洗，在紫外燈下觀察待DNA全部移出凝膠，改變電場方向繼續(xù)通電I分鐘，從透析袋中吸出緩沖液于l_5ml Eppendorf管中，加入1.5倍體積正丁醇，混勻抽提去EB，在臺式離心機上最高速2分鐘，吸去上層正丁醇溶液，如此重復(fù)二次，自下層言DNA的溶液中加入等體積酚氯仿(2個)抽提2次，上清轉(zhuǎn)入另一 Eppendorf管中加入1/10倍體積3M NaAc>2倍體積預(yù)冷無水乙醇,于2(TC過夜，12000g，4°C下離心10分鐘，得DNA沉淀，棄上清，加入70%乙醇洗滌2次后棄干乙醇，加入50 μ I TE溶解DNA。此外，還可用低熔點瓊脂糖凝膠法、DNA濾膜插片法等將目的DNA片段從凝膠中分離、純化出來。
[0015]2、SV40大T抗原DNA與pcDNA3.1基因載體的連接:取9 μ I上述DNA成份(0.l_5yg)、10y 12Χ 連接緩沖液、1μ 110mmol/L ATP、T4DNA連接酶(20 ?500 粘性末端單位)或大腸桿菌DNA連接酶、pcDNA3.1空載體混合，15°C溫育24h，構(gòu)建成SV40T/pcDNA3.1
重組子。
[0016]3、SV40T/pcDNA3.1重組子的擴增、分離與鑒定:①大腸桿菌感受態(tài)的制備:其基本方法是用冰預(yù)冷的CaCl2或多種2價陽離子等處理細(xì)菌，使之進入感受態(tài)得以轉(zhuǎn)化，用CaCl2制備新鮮或冷凍的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，常用于成批制備感受態(tài)細(xì)菌，本法適用于大多數(shù)大腸桿菌菌株，操作過程簡述如下:從37°C培養(yǎng)16?20h的新鮮平板中挑取一個單菌落(如大腸桿菌DH52)，或Iml新鮮的16?20h過夜培養(yǎng)物，轉(zhuǎn)到一個含有10mlLB培養(yǎng)基的IL或500ml燒瓶中，于37°C劇烈振搖培養(yǎng)約2?3h (旋轉(zhuǎn)搖床200?300r/min)，每隔20?30min測量0D600值?0.4，在無菌條件下將細(xì)菌轉(zhuǎn)移到一個，用冰預(yù)冷的50ml聚丙烯離心管中，在冰上放置10?20min，于4°C用SorvallGS2轉(zhuǎn)頭(或與其離心管相配的轉(zhuǎn)頭)以4000r/min離心lOmin，以回收細(xì)胞，倒數(shù)培養(yǎng)液，將管倒置Imin以使最后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡，以1ml用冰預(yù)冷的0.1mMCaCl2重懸每份沉淀,放于冰上,于4°C用SorvallGS3轉(zhuǎn)頭(或與其相應(yīng)的轉(zhuǎn)頭)以4000r/min離心lOmin，以回收細(xì)胞，倒出培養(yǎng)液，將管倒置Imin以使最后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡，每50ml初始培養(yǎng)物用2ml冰預(yù)冷的0.1M CaCl2重懸每份沉定，此時，可以迅速將細(xì)胞分裝成小份，液氮中冰凍，-70°C貯存?zhèn)溆?，用冷卻的無菌吸頭從每種感受態(tài)細(xì)胞懸液中各取200 μ I轉(zhuǎn)移到無菌的微量離心管中，每管應(yīng)該加DNA或連接反應(yīng)混合物(體積彡10μ 1，DNA彡50ng)，輕輕旋轉(zhuǎn)以混勻內(nèi)容物，在冰中放置30min，將離心管放到預(yù)加溫到40°C的循環(huán)水浴中的試管架上，放置90s?2min，不要搖動試管，快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細(xì)胞冷卻I?2min，每離心管加800 μ ISOC培養(yǎng)基，用水浴將培養(yǎng)基加溫到37°C，然后將管轉(zhuǎn)移到37°C搖床上，溫育45min使細(xì)菌復(fù)蘇，并且表達質(zhì)粒編碼的抗生素抗性標(biāo)記基因，將適當(dāng)體積(每個90mm平板可達200 μ I)已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含200mmol/LMgS04和相應(yīng)抗生素的SOB培養(yǎng)基上，將平板置于室溫至液體被吸收，倒置平皿，于37°C培養(yǎng)，12?16h后可出現(xiàn)菌落。②重組子的篩選、擴增與提取:用無菌牙簽或滅菌接種針挑選單個菌落接種于5mL無菌的LB培養(yǎng)基或豐富培養(yǎng)基(如超級肉湯或TB超級肉湯培養(yǎng)基)中，培養(yǎng)過夜后，再加入到500mL含LB培養(yǎng)基(含有適當(dāng)抗生素)的2L燒瓶中，再于37°C培養(yǎng)至飽和狀態(tài)(0D_ ^ 4，為提高產(chǎn)量，應(yīng)采用表面積較大及帶折流板的燒瓶以盡量增大通氣度，振搖速度應(yīng)大于400r/min)，于4°C，6000g離心lOmin，用4mL GTL溶液重懸沉淀，并轉(zhuǎn)移到一個容積彡20mL的高速離心管中(細(xì)菌沉淀可以在_20°C或_70°C無限期保存)，加入ImL新配的含25mg/mL溶菌酶的GTE溶液，重懸沉淀，于室溫放置lOmin，加入1mL新配NaOH/SDS溶液，并且輕輕混勻直至液體變得均一、清亮而粘稠，于冰上放置10min，WA 7.5mL乙酸溶液，用吸管輕輕攪拌直至粘稠度下降并形成大的沉淀，于冰上放置lOmin，于4°C，20000g離心lOmin，將上清輕輕倒入至另一個干凈的離心管中，如果有可見的飄浮物可用數(shù)層紗布過濾，加入0.6倍體積的異丙醇，顛倒混勻，室溫放置5?lOmin，于室溫，I 500g離心lOmin，加入2mL70%乙醇輕輕洗滌沉淀，然后短暫快速離心，吸去乙醇，并真空干燥(沉淀可在4°C長期保存)。③重組子的鑒定:上述從感受態(tài)大腸桿菌中提取的DNA (含重組子SV40T/pcDNA3.1)，同上法用限制性內(nèi)切酶BamH I進行酶切，10g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定，獲得大小約2600bp及5600bp的2條帶，前者符合GenBank中SV40T片段的大小。
[0017]4、SV40T/pcDNA3.1重組子導(dǎo)入神經(jīng)管缺陷細(xì)胞及其陽性克隆的篩選與擴增:①神經(jīng)管缺陷細(xì)胞的收集與培養(yǎng):以無菌操作提取在作其他實驗或其他檢查后多余、廢棄的神經(jīng)管缺陷患兒的羊水脫落組織細(xì)胞，以細(xì)胞終濃度為I X 1VmL備用，取上述呈單個分散的細(xì)胞或經(jīng)處理后成為單個分散的細(xì)胞接種于含5?lOnmol/L胰島素、20%胎牛血清的RPMI1640液中或接種于含20%胎牛血清、5?lOnmol/L胰島素的低糖DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基中，置于37°C，體積分?jǐn)?shù)5% C02培養(yǎng)箱內(nèi)，細(xì)胞貼壁培養(yǎng)約3?4天、細(xì)胞形態(tài)為梭形、小園形細(xì)胞不到10%、貼壁細(xì)胞的匯合率達75%?85%、處于剛進入對數(shù)生長期時，即考慮收集培養(yǎng)細(xì)胞，先吸干凈培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，加入l-2ml0.01%的膠原酶II液(以消化液能覆蓋整個瓶底為準(zhǔn))，靜置2-10min (顯微鏡下動態(tài)監(jiān)測)，吸去膠原酶II液，加入低糖DMEM或RPMI1640培養(yǎng)液，用吸管吸取瓶內(nèi)培養(yǎng)液，反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞，形成細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)入離心管離心沉淀，去上清液，細(xì)胞沉淀用上述培養(yǎng)液清洗2次后，制成懸液，用作重組子導(dǎo)入。②SV40T/pcDNA3.1的導(dǎo)入:方法1:在上法分離所得細(xì)胞中，選用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將上述2 X 15個細(xì)胞接種于35mm培養(yǎng)皿中，在37°C CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24?36h，使細(xì)胞生成單層、細(xì)胞形態(tài)為梭形、尚未見或僅見少于10%小園形細(xì)胞、貼壁細(xì)胞的匯合率達55%?65%、處于將進入或剛進入對數(shù)生長期時，即考慮轉(zhuǎn)染重組子SV40T/pcDNA3.1，在1.5ml微量離心管中制備下列溶液:管A，將SV40T/pcDNA3.1溶于100 μ I無血清培養(yǎng)液中；管匕將20 μ ILipofectamine溶于80 μ I無血清培養(yǎng)液中，將管A和管B混勻，室溫下置45min,吸去細(xì)胞培養(yǎng)液后，用無血清培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞2次，在LipOfectamine-SV40T/pcDNA3.1混合物中加入Iml無血清培養(yǎng)液，輕輕混勻，再滴加至細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)，然后加入Iml無血清培養(yǎng)液，在CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)10h，吸出轉(zhuǎn)染液，加4ml完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)16h，棄去培養(yǎng)液，更換濃度為400mg° Γ1的G418培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，8?10天后選擇單個細(xì)胞集落進行亞克隆，擴大培養(yǎng)后再加大G418濃度到800mg° L—1，將能在高濃度的G418環(huán)境中穩(wěn)定生長的克隆進行傳代擴增，另外神經(jīng)管缺陷細(xì)胞與SV40或EB病毒共同培養(yǎng)后，感染了病毒DNA并發(fā)生整合的神經(jīng)管缺陷細(xì)胞進行傳代擴增。方法2:吸取1/10-1/40細(xì)胞懸液，配制成終濃度為IXlO5/mL細(xì)胞懸液，接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)，選擇低糖DMEM或RPMI1640培養(yǎng)基，其中含20mL/L胎牛血清、lOnmol/L胰島素，培養(yǎng)48h后，使細(xì)胞生成單層、細(xì)胞形態(tài)為梭形、尚未見或僅見少于10 %小園形細(xì)胞、貼壁細(xì)胞匯合率達55 %?65 %、處于將進入或剛進入對數(shù)生長期時，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法，將重組子SV40T/pcDNA3.1轉(zhuǎn)染至神經(jīng)管缺陷細(xì)胞內(nèi)，或?qū)V40直接感染至神經(jīng)管缺陷細(xì)胞內(nèi)，用含700mg/LG418的培養(yǎng)液篩選IwkJf G418濃度改為300mg/L，至出現(xiàn)陽性克隆，將其轉(zhuǎn)移至新培養(yǎng)瓶進行擴大、傳代培養(yǎng)；方法3:將上述的細(xì)胞懸液以低糖DMEM或RPMI1640培養(yǎng)液配成5X 108/L終濃度的細(xì)胞懸液接種于24孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞長至90%左右融合時用于轉(zhuǎn)染，將0.2 μ g含量的重組子SV40T/pcDNA3.1，用DMEM或RPMI1640調(diào)整體積為50 μ 1，室溫放置5min ;脂質(zhì)體6 μ 1，用DMEM調(diào)整體積為50 μ 1，室溫放置5min，兩種試劑輕輕混勻，室溫放置20min，同時將24孔板內(nèi)的細(xì)胞用DMEM洗3次后，再在每孔加培養(yǎng)液100μ 1，加脂質(zhì)體-SV40T/pcDNA3.1混合液，輕輕在細(xì)胞表面鋪均勻，于370C C02培養(yǎng)箱放置6h，隨后用0.01g/L膠原酶將細(xì)胞消化，轉(zhuǎn)入6孔板內(nèi)，加入完全培養(yǎng)基，次日加G418抗生素使終濃度為500mg/L，直到有單克隆細(xì)胞長出。約1d后有單克隆細(xì)胞集落長出，挑出置于24孔板內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，以300mg/L的6418維持并穩(wěn)定傳代擴增培養(yǎng)。以此構(gòu)建神經(jīng)管缺陷細(xì)胞模型(細(xì)胞系)。
[0018]5、神經(jīng)管缺陷細(xì)胞模型(細(xì)胞系)的傳代、擴增:收集上述經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法導(dǎo)入SV40大T抗原基因的陽性單克隆細(xì)胞集落，以低糖DMEM或RPMI1640培養(yǎng)基配成約IXlO5/mL的細(xì)胞懸液，接種于數(shù)瓶20?50cm2培養(yǎng)瓶中，加入5mL含20mL/L胎牛血清、lOnmol/L胰島素的低糖DMEM或RPMI1640培養(yǎng)基，至細(xì)胞貼壁生長、匯合率達80?85%、處于對數(shù)生長期的前期時收集細(xì)胞，再按上述步驟傳代培養(yǎng)，如此反復(fù)傳代接種、培養(yǎng)，記錄代數(shù)并觀察細(xì)胞生長特點。如圖1，細(xì)胞傳代至第78代、培養(yǎng)至第11天時，呈對數(shù)生長、圓形、梭形、鋪滿瓶底，其細(xì)胞生長匯合率達85%以上，此后隨著傳代次數(shù)的增加，細(xì)胞生長變慢、變稀疏。其中對數(shù)生長是指細(xì)胞生長速度快，細(xì)胞數(shù)量的增加與培養(yǎng)時間呈倍增關(guān)系，通常按常規(guī)按種細(xì)胞進行培養(yǎng)時，培養(yǎng)I?2天便可在顯微鏡下找到生長的單個細(xì)胞；4?5天時可見細(xì)胞集落，貼壁生長細(xì)胞鋪蓋培養(yǎng)瓶底的1/3，培養(yǎng)7?13天時可見貼壁生長細(xì)胞鋪蓋培養(yǎng)瓶底的2/3以上，甚至細(xì)胞重疊、幾乎不留空隙(匯合率達95?100% )，細(xì)胞光亮，無顆粒、無粗糙感等老化現(xiàn)象，也可據(jù)細(xì)胞計數(shù)與培養(yǎng)時間的關(guān)系來判斷；死亡的細(xì)胞少，每周因死亡而漂浮的細(xì)胞少于10% [通過臺盼藍染色法鑒別死細(xì)胞和活細(xì)胞，因為正常的活細(xì)胞，胞膜結(jié)構(gòu)完整，能夠排斥，使臺盼藍不能夠進入胞內(nèi)；而喪失活性的細(xì)胞，胞膜的通透性增加，可被臺盼藍染成藍色，可判斷為細(xì)胞已經(jīng)死亡，方法是每周吸取一定量的細(xì)胞培養(yǎng)懸液，與臺盼藍染色劑混合后置室溫5?10分鐘，然后制成細(xì)胞薄片，在顯微鏡下計數(shù)1000個細(xì)胞總數(shù)，計算著色的死細(xì)胞和不著色的活細(xì)胞的百分比]。
[0019]6、神經(jīng)管缺陷細(xì)胞模型生物學(xué)特性的鑒定:使用SV40建立細(xì)胞模型(細(xì)胞系)后，鑒定的關(guān)鍵問題有:一是要求該細(xì)胞具有持續(xù)的增殖能力，即T抗原在細(xì)胞系中穩(wěn)定表達；二是要求其形態(tài)、基本生理功能等表型保持不變。①觀察細(xì)胞形態(tài):在倒置光學(xué)顯微鏡下每日觀察細(xì)胞是否呈典型的上皮細(xì)胞樣貼壁生長，是否呈梭形、或小園形生長；②觀察細(xì)胞生長曲線:取生長較好的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，采用0.25胰蛋白酶液消化，制成細(xì)胞懸液，經(jīng)計數(shù)，分別取1.4X 14細(xì)胞接種于30個含15FBS低糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)瓶。每天取2瓶細(xì)胞進行計數(shù)，計算均值，連續(xù)觀察直至細(xì)胞數(shù)量明顯下降，培養(yǎng)3天后每隔2天給未計數(shù)的細(xì)胞換液，采用同樣方法觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞在h印ato ZYME-SFM無血清培養(yǎng)基中的生長情況。結(jié)果以培養(yǎng)時間為橫軸，細(xì)胞數(shù)量為縱軸(對數(shù))，描繪在半對數(shù)座標(biāo)上制成曲線后即成該細(xì)胞的生長曲線，永生化細(xì)胞系呈典型的“S”特征或“穹隆”形成；③檢查染色體:通過分析染色體核型，如果染色體核型為二倍體“46，XX”或“46，XY”，則說明該細(xì)胞系沒有發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化(同時可用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞系中是否出現(xiàn)異常的DNA群體，如果沒有，也說明細(xì)胞系未出現(xiàn)瘤性特征)。染色體核型分析方法是:在細(xì)胞生長密度達85-95% (其中小園形細(xì)胞占10% )、處于對數(shù)生長期的培養(yǎng)物中按5mL培養(yǎng)液中加入預(yù)熱的250ug/ml秋水仙素lOOul，混勻后置37°C培養(yǎng)箱4小時，吸干培養(yǎng)液，加入預(yù)熱的2-3mL EDTA-胰酶消化液，37°C作用5分鐘，終止消化，洗下貼壁細(xì)胞，經(jīng)離心、低滲、固定、制片、G顯帶后分析染色體核型軟瓊脂集落生長試驗:將SV40T轉(zhuǎn)染后永生化的細(xì)胞以5X104/ml接種于直徑為35mm軟瓊脂平皿內(nèi)，觀察三周后，未發(fā)現(xiàn)克隆形成，說明本實驗的SV40T永生化染色體異常羊水細(xì)胞不能在軟瓊脂內(nèi)形成克隆，符合永生化特點裸鼠致瘤試驗:將SV40T永生化的細(xì)胞以3X 17接種裸鼠背部皮下，2個月后，4只裸鼠均未見腫瘤形成，證明此細(xì)胞為非惡化細(xì)胞；⑥轉(zhuǎn)染細(xì)胞DNA中SV40大T基因檢測:如以免疫組織化學(xué)檢測，SV40轉(zhuǎn)染的細(xì)胞核內(nèi)染色可見大量棕色顆粒，表明SV40T抗原已整合入細(xì)胞內(nèi)；也可用RT-PCR法檢測T抗原在細(xì)胞中的表達，其中T抗原的引物:上游引物(A4239)5，-GTT ATG ATT ATA ACT GTTATG-3’，下游引物(S4496)5’-GM ATG CCA TCT AGT GAT-3’;擴增產(chǎn)物長度為 268bp，擴增條件為 940C，5min,即:(94°C，Imin ；55°C，lmin, -0.5°C / 循環(huán)；72°C, lmin) X 30、(94°C，30S ；40°C，30S，72°C，30S) X 15，擴增體系為 50 μ 1: [Mg2+] 2mmol/L、dNTPs200 μ mol/L、引物濃度
0.4 μ mol/L、TaqlU、模板5 μ I ;實驗組以第19代細(xì)胞的cDNA為模板(參照市售cDNA第一鏈合成試劑盒進行cDNA第一鏈合成，產(chǎn)物_20°C保存)；陰性對照設(shè)兩個，分別以無菌水、原代細(xì)胞的cDNA做模板，陽性對照以SV40DNA為模板(參照SDS-蛋白酶K法提取SV40DNA，因為SV40病毒無包膜，不使用SDS破膜，取5 μ I進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，其余_20°C保存?zhèn)溆?mRNA表達產(chǎn)物測定:T抗原mRNA RT-PCR產(chǎn)物測序:取100 μ I體系的擴增產(chǎn)物，用凝膠回收試劑盒(Takara，日本)回收產(chǎn)物，取2μ I DNA溶液稀釋100倍，測濃度，余下的DNA及上、下游引物各10 μ I進行測序。④流式細(xì)胞術(shù)檢測:檢測第19代細(xì)胞系中合成、分裂的細(xì)胞比例，如果其增殖能力明顯比未建系的正常細(xì)胞增強，說明是SV40大T抗原整合、表達的結(jié)果DNA序列測定:按常規(guī)測序儀檢測，顯示SV40大T抗原DNA序列。
[0020]所以，本發(fā)明的細(xì)胞模型為①細(xì)胞在倒置光學(xué)顯微鏡下呈梭形或小園形的上皮細(xì)胞樣貼壁生長；②細(xì)胞的生長曲線如以培養(yǎng)時間為橫軸，細(xì)胞數(shù)量為縱軸，在hepatoZYME-SFM無血清培養(yǎng)基中呈“S”特征或“穹隆”形成；③為神經(jīng)管缺陷細(xì)胞，染色體核型為二倍體“46，XX”或“46，XY”，或相同于本發(fā)明采集的原代細(xì)胞；④細(xì)胞不能在軟瓊脂內(nèi)生長(形成克隆)；⑤細(xì)胞為非惡化細(xì)胞，裸鼠致瘤試驗陰性細(xì)胞的DNA中整合了 SV40大T抗原基因，表達SV40大T抗原mRNA產(chǎn)物；?細(xì)胞傳代至第78代、培養(yǎng)至第11天時，呈圓形、梭形、鋪滿瓶底，其細(xì)胞生長匯合率達85%以上，此后隨著傳代次數(shù)的增加，細(xì)胞生長變慢、變疏；⑧用于保存遺傳資源，并從細(xì)胞水平在體外研究神經(jīng)管缺陷細(xì)胞受物理、化學(xué)、生物、遺傳等影響的基因突變、基因表達、功能改變、生理特性、生物傳導(dǎo)等機制。
[0021]7、SV40LT抗原基因介導(dǎo)神經(jīng)管缺陷細(xì)胞模型及其細(xì)胞庫:篩選并繼續(xù)傳代、擴大培養(yǎng)經(jīng)上述鑒定后符合永生化細(xì)胞特性并與原代細(xì)胞相同或相近的細(xì)胞，取生長狀態(tài)良好、處于對數(shù)生長期的不同世代的貼壁細(xì)胞，經(jīng)過消化、終止和離心分離(1200r/min，6min)，用含二甲亞砜的凍存液0.5?Iml重懸細(xì)胞，細(xì)胞密度為5X 15個/ml，加入凍存管，經(jīng)4°C，0.5h ；-20°C，2h ；-70°C，過夜，Λ _196°C液氮凍存，以此法構(gòu)建生物學(xué)特性穩(wěn)定的永生化神經(jīng)管缺陷細(xì)胞模型及其細(xì)胞庫，以集中保存遺傳資源，為其他研究提供科研材料，又可直接作為神經(jīng)管缺陷發(fā)病機制體外研究的細(xì)胞模型，以加速拓展神經(jīng)管缺陷研究的新途徑，從細(xì)胞水平在體外研究神經(jīng)管缺陷細(xì)胞受物理、化學(xué)、生物、遺傳等影響的基因突變、基因表達、功能改變、生理特性、生物傳導(dǎo)等機制。
[0022]8、細(xì)胞模型應(yīng)用:神經(jīng)管缺陷細(xì)胞模型作為科研細(xì)胞:使神經(jīng)管缺陷細(xì)胞模型處于人為制造的具有不同含量或濃度的有害物如物理(如X射線)、化學(xué)(如甲醒、汽油、鉛、汞)、生物(如風(fēng)疹病毒，巨細(xì)胞病毒，皰疹病毒)的條件下培養(yǎng)，然后取體外長期傳代的不同周期的活細(xì)胞、傳代過程的凋亡細(xì)胞、含有傳代培養(yǎng)中所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物的培養(yǎng)液從不同角度和水平，對比研究神經(jīng)管缺陷細(xì)胞模型、正常對照細(xì)胞模型對有害物的耐受性的差異、有害物致神經(jīng)管缺陷的機制。例如應(yīng)用常規(guī)方法如基因芯片、miRNA芯片、比較基因組雜交芯片(CGH)、差異甲基化雜交芯片(DMH)和SNPs等篩選差異的基因及其多態(tài)性、甲基化水平；運用原位雜交(FISH)、Northern blot、Real-time PCR、CHIP、EMSA等技術(shù)檢測基因所在研究細(xì)胞模型中的基因轉(zhuǎn)率表達、定位及調(diào)控；利用酶反應(yīng)學(xué)、代謝組學(xué)技術(shù)鑒定細(xì)胞模型長期傳代中蛋白質(zhì)代謝過程和關(guān)鍵的代謝產(chǎn)物；應(yīng)用雙向電泳、MALD1-T0F質(zhì)譜鑒定、酵母雙雜交和免疫共沉淀等技術(shù)研究細(xì)胞模型在長期傳代中的蛋白質(zhì)功能及蛋白質(zhì)間的相互作用，從活細(xì)胞培養(yǎng)過程動態(tài)、長期研究神經(jīng)管缺陷細(xì)胞對環(huán)境有害因素的耐受性和適應(yīng)性，例如:①環(huán)境中常見的毒性物質(zhì)苯并芘致神經(jīng)管缺陷的研究:使神經(jīng)管缺陷細(xì)胞模型和對照細(xì)胞分別在含有0.1、1.0,5.0、10.0,20.0pmoI/L苯并芘的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，檢測在培養(yǎng)2周、4周、6周、8周、16周等不同培養(yǎng)時間的可作為細(xì)胞毒性指標(biāo)的細(xì)胞凋亡、壞死、雙核細(xì)胞率和可作為遺傳毒性指標(biāo)的微核率、核質(zhì)橋率、核芽率，即在光學(xué)顯微鏡下計數(shù)10000個雙核細(xì)胞中的微核數(shù)、核質(zhì)橋數(shù)和核芽數(shù)；500個活細(xì)胞中的凋亡和壞死細(xì)胞數(shù)、雙核細(xì)胞數(shù)，以及檢測細(xì)胞存活率，即應(yīng)用四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT法)，在吸去原培養(yǎng)液后，在96孔板上加入20%的5mg/mlMTT的無血清培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)4h，小心吸棄孔內(nèi)上清液，每孔加入150 μ L 二甲亞砜,振蕩1min,使紫色結(jié)晶物充分溶解,本酶標(biāo)儀以490nm測定各孔的吸光度值，計算出細(xì)胞存活率。還可以其他常規(guī)實驗方法檢測不同培養(yǎng)時間的含毒性物與不含毒性物、神經(jīng)管缺陷細(xì)胞模型與正常細(xì)胞中各組細(xì)胞的基因突變、蛋白質(zhì)組學(xué)、細(xì)胞分泌功能、染色體畸變、細(xì)胞存活率(壽命)等，以從活細(xì)胞培養(yǎng)過程中從細(xì)胞水平動態(tài)、長期研究環(huán)境有害因素對神經(jīng)管缺陷的作用機制。②以某種病源微生物替換毒性物質(zhì)苯并芘做同樣的研究，即可從活細(xì)胞培養(yǎng)過程中從細(xì)胞水平動態(tài)、長期研究神經(jīng)管缺陷細(xì)胞對生物因素的耐受性和適應(yīng)性及作用機制。③將配成濃度梯度的治療藥物與配成濃度梯度的病源微生物或毒性化學(xué)物質(zhì)以及細(xì)胞模型共同培養(yǎng)，檢測細(xì)胞培養(yǎng)過程壽命、基因突變、各種分子變化等，即可從活細(xì)胞培養(yǎng)過程中從細(xì)胞水平動態(tài)、長期研究藥物對神經(jīng)管缺陷的治療效果及干預(yù)效果。④同樣可用神經(jīng)管缺陷細(xì)胞模型研究基因治療的方法，替代某些以人體直接做試驗。⑤以細(xì)胞模型的形式保存神經(jīng)管缺陷者的遺傳資源。
【權(quán)利要求】
1.一種用于醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的導(dǎo)入SV40T基因構(gòu)建神經(jīng)管缺陷細(xì)胞模型及其細(xì)胞庫，其主要特征是按常規(guī)以T4DNA連接酶、BamH1、pcDNA3.1㈠DNA及SV40LTag DNA構(gòu)建SV40LTag-pcDNA3.1 (-)重組子、以感受態(tài)大腸桿菌純化重組子、以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將其導(dǎo)入經(jīng)膠原酶II消化的離體傳代或呈對數(shù)生長的神經(jīng)管畸形組織細(xì)胞，使重組子與細(xì)胞的DNA整合，并擴大培養(yǎng)經(jīng)G418篩選含陽性重組子的細(xì)胞克隆，篩選細(xì)胞形態(tài)、生長曲線、染色體核型、軟瓊脂集落生長、裸鼠致瘤試驗、轉(zhuǎn)染細(xì)胞DNA中SV40大T基因檢測、mRNA表達產(chǎn)物測定及DNA序列測定結(jié)果符合永生化細(xì)胞特性并與原代細(xì)胞相同或相近者作為SV40LT抗原基因介導(dǎo)神經(jīng)管畸形體外研究細(xì)胞模型(替代人體或動物直接試驗)凍存于液氮中。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的導(dǎo)入SV40T基因構(gòu)建神經(jīng)管缺陷細(xì)胞模型及其細(xì)胞庫，其特征是所指細(xì)胞模型為(I)細(xì)胞在倒置光學(xué)顯微鏡下呈梭形或小園形的上皮細(xì)胞樣貼壁生長；(2)細(xì)胞的生長曲線如以培養(yǎng)時間為橫軸，細(xì)胞數(shù)量為縱軸，在h印ato ZYME-SFM無血清培養(yǎng)基中呈“S”特征或“穹隆”形成；(3)為神經(jīng)管缺陷細(xì)胞，染色體核型為二倍體“46，XX”或“46，XY”；(4)細(xì)胞不能在軟瓊脂內(nèi)生長(形成克隆)；(5)細(xì)胞為非惡化細(xì)胞，裸鼠致瘤試驗陰性；(6)細(xì)胞的DNA中整合了 SV40大T抗原基因，表達SV40大T抗原mRNA產(chǎn)物；(7)細(xì)胞傳代至第78代、培養(yǎng)至第11天時，呈對數(shù)生長、圓形、梭形、鋪滿瓶底，其細(xì)胞生長匯合率達85%以上，此后隨著傳代次數(shù)的增加，細(xì)胞生長變慢、變稀疏；(8)用于保存遺傳資源，并從細(xì)胞水平在體外研究神經(jīng)管缺陷細(xì)胞受物理、化學(xué)、生物、遺傳等影響的基因突變、基因表達、功能改變、生理特性、生物傳導(dǎo)等機制。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的導(dǎo)入SV40T基因構(gòu)建神經(jīng)管缺陷細(xì)胞模型及其細(xì)胞庫，其特征是取自因其他實驗所需而采集的、并在其他實驗后多余、廢棄的神經(jīng)管畸形患兒羊水脫落細(xì)胞構(gòu)建之。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的導(dǎo)入SV40T基因構(gòu)建神經(jīng)管缺陷細(xì)胞模型及其細(xì)胞庫，其特征是所用的培養(yǎng)液為含有20%胎牛血清、5?10nmol/L胰島素的RPMI1640或含有20mL/L胎牛血清、5?lOnmol/L胰島素的低糖DMEM培養(yǎng)液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的導(dǎo)入SV40T基因構(gòu)建神經(jīng)管缺陷細(xì)胞模型及其細(xì)胞庫，其特征是用作傳代培養(yǎng)以備脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法導(dǎo)入重組子的神經(jīng)管畸形組織細(xì)胞，在原代擴增培養(yǎng)中，其收集指標(biāo)是細(xì)胞貼壁培養(yǎng)約3?4天、細(xì)胞形態(tài)為梭形、小園形細(xì)胞不到10%、貼壁細(xì)胞的匯合率達75%?85%、處于剛進入對數(shù)生長期時收集細(xì)胞；用作脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法導(dǎo)入重組子的傳代神經(jīng)管畸形組織細(xì)胞，其時機選擇的指標(biāo)是細(xì)胞形態(tài)為梭形、尚未見或僅見少于10%小園形細(xì)胞、貼壁細(xì)胞的匯合率達55%?65%、處于將進入或剛進入對數(shù)生長期時的培養(yǎng)細(xì)胞；傳代細(xì)胞系收集的指標(biāo)是選擇細(xì)胞貼壁生長的匯合率達80?85%、處于對數(shù)生長期的前期時收集細(xì)胞；染色體核型分析的細(xì)胞收集指標(biāo)是細(xì)胞生長密度達85-95%、小園形細(xì)胞占10%以上、處于對數(shù)生長期的細(xì)胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的導(dǎo)入SV40T基因構(gòu)建神經(jīng)管缺陷細(xì)胞模型及其細(xì)胞庫，其特征是以0.01%膠原酶II消化貼壁生長的神經(jīng)管畸形組織細(xì)胞，作染色體核型分析時，每5mL培養(yǎng)液中加入250ug/ml秋水仙素lOOul，混勻后置37°C培養(yǎng)箱4小時。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的導(dǎo)入SV40T基因構(gòu)建神經(jīng)管缺陷細(xì)胞模型及其細(xì)胞庫，其特征是細(xì)胞庫的構(gòu)建包括(I)篩選經(jīng)鑒定后符合永生化細(xì)胞特性并與原代細(xì)胞相同或相近的SV40LT介導(dǎo)的神經(jīng)管畸形細(xì)胞；(2)作傳代、擴大培養(yǎng)，取生長狀態(tài)良好、處于對數(shù)生長期的不同世代的貼壁細(xì)胞；(3)經(jīng)消化、終止、離心(1200r/min，6min)步驟收獲細(xì)胞；(4)用含二甲亞砜的凍存液配制密度為5 X 15個/ml的細(xì)胞懸液；(5)按照4°C，0.5h ；~20V,2h ;-70°C，過夜；入_196°C液氮的程序凍存細(xì)胞；(6)可再生性地長期保存SV40LT介導(dǎo)神經(jīng)管畸形細(xì)胞模型，備作遺傳資源和科研材料。
【文檔編號】C12N15/85GK104419667SQ201310403946
【公開日】2015年3月18日 申請日期:2013年9月1日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月1日
【發(fā)明者】翁炳煥, 黃荷鳳, 徐晨明, 李曉, 張雪琴, 陳雁 申請人:翁炳煥