1.3拷貝c基因型hbv轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種1.3拷貝C基因型HBV轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建方法。所述方法是通過囊胚注射ES細胞制備定點整合1.3拷貝C基因型乙型肝炎病毒（HepatitisBvirus，HBV）轉(zhuǎn)基因小鼠。首先構(gòu)建定點整合1.3拷貝C型HBV的表達載體，然后采用電轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)化方法把重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到ES細胞中，經(jīng)過篩選和培養(yǎng)后獲得定點整合重組的ES細胞，再把定點整合重組的ES細胞經(jīng)消化成單個細胞后注射到囊胚中，然后把囊胚移植到假孕母鼠子宮中。該方法在國內(nèi)外率先建立了1.3拷貝C型HBV的轉(zhuǎn)基因小鼠，針對性的應(yīng)用于乙肝相關(guān)研究領(lǐng)域中，為我國乙型肝炎預(yù)防和治療研究更加理想的動物模型。
【專利說明】1.3拷貝C基因型HBV轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及動物模型構(gòu)建領(lǐng)域。更具體地，涉及一種1.3拷貝C基因型HBV轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002]乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染是全球范圍內(nèi)影響人類健康的重大問題。由HBV感染導(dǎo)致的慢性進行性肝臟炎癥病變，常常發(fā)展為肝硬化、肝癌并最終導(dǎo)致死亡。據(jù)世界衛(wèi)生組織報道，全球約20億人曾感染過HBV，其中3.5億人為慢性HBV感染者，每年因此死亡的人數(shù)約為100萬~200萬。我國一直是HBV感染的高發(fā)區(qū)，最新的資料表明:我國現(xiàn)有的慢性HBV感染者約為9300萬例，其中慢性乙型肝炎患者約2000萬例，占慢性HBV感染者的1/5強。慢性HBV感染者和慢性乙型肝炎患者由于攜帶有大量HBV，是HBV的最主要傳染源。我國每年都投入大量的經(jīng)費和人力物質(zhì)資源用于該類人群的治療和阻止HBV在人群中的進一步 傳播，給我國帶來了非常嚴(yán)重的經(jīng)濟和社會負擔(dān)，使本已十分有限的醫(yī)療資源更加緊張。為此，開展深入和多層次的HBV感染尤其是慢性HBV感染和慢性乙型肝炎的相關(guān)研究，對于攻克這一影響我國近I億人口身體健康的疾病，維護我國人口的身體健康具有重要意義。
[0003]在乙型肝炎的相關(guān)研究中，乙型肝炎動物模型具有舉足輕重的地位，乙型肝炎動物模型應(yīng)用于從HBV感染機制、被感染機體的免疫狀態(tài)改變、HBV在被感染機體內(nèi)的免疫逃逸機制、HBV的基因治療以及HBV治療藥物的療效評價等的各個層次和各個方面。因而合適的動物模型的建立與選擇往往成為HBV研究工作的關(guān)鍵，對研究工作起到事半功倍的作用。為此，許多學(xué)者都曾致力于建立各種類型的乙型肝炎動物模型。然而由于人類HBV屬于嗜肝DNA病毒科，有較強的種屬特異性，自然條件下只感染人和非人靈長類(如黑猩猩等)，建立起能廣泛應(yīng)用的動物模型并非易事。黑猩猩模型因其體積較大、成本高以及受倫理道德約束等限制了其應(yīng)用；而樹駒模型則由于其感染效率低，僅能導(dǎo)致短暫的輕度感染，病毒滴度很低，而難以推廣應(yīng)用；鴨乙型肝炎的動物模型，則存在其藥代動力學(xué)和免疫學(xué)遺傳背景與人類有很大的不同的缺陷、土撥鼠僅產(chǎn)于北美，運輸困難且價格昂貴，從而限制了這些動物模型的廣泛應(yīng)用，進而限制了對乙型肝炎發(fā)病機制、免疫病理、治療藥物以及免疫治療的相關(guān)研究。
[0004]近年來，由于遺傳和免疫背景清楚、易于飼養(yǎng)等優(yōu)點，小鼠逐漸受到研究人員的關(guān)注，成為構(gòu)建HBV動物模型的最佳選擇。研究人員建立了人-鼠肝嵌合體HBV小鼠模型、基因轉(zhuǎn)染HBV小鼠模型和HBV轉(zhuǎn)基因小鼠模型。
[0005]但是，盡管人-鼠肝嵌合體HBV小鼠模型可以說是目前最好的HBV感染復(fù)制模型，但是由于該模型沒有免疫機能，因而不能進行免疫介導(dǎo)的病毒清除和肝炎免疫致病機制的研究。基因轉(zhuǎn)染HBV小鼠模型由于是一過性的HBV復(fù)制模型，因而只能用于急性HBV感染的研究，不適用于慢性HBV感染和慢性乙型肝炎研究。此外，由于注射劑量太大(相當(dāng)于小鼠全身體液的總量)，對小鼠肝臟和其他器官造成的損傷也不能忽視。目前已有的HBV轉(zhuǎn)基因小鼠也存在著明顯的缺陷。首先，目前已有的HBV轉(zhuǎn)基因小鼠由于并非通過被HBV感染的途徑建立，因此無法用來進行HBV進入被感染機體和HBV在機體內(nèi)的散布研究；其次，目前已有的HBV轉(zhuǎn)基因小鼠對HBV病毒抗原處于免疫耐受狀態(tài)，機體不能產(chǎn)生對HBV的免疫反應(yīng)，也不產(chǎn)生乙型肝炎病變。以上原因?qū)е铝丝捎糜诼訦BV感染和慢性乙型肝炎非免疫耐受的動物模型的缺失，客觀上影響了相關(guān)研究的深入開展。因此建立可控、支持HBV體內(nèi)感染并能導(dǎo)致類似于臨床乙肝病變的，非免疫耐受的HBV小鼠模型成為深入了解乙肝發(fā)病機制，肝臟病變的發(fā)展和轉(zhuǎn)歸機制，抗乙肝藥物的研發(fā)及評價新的乙肝免疫療法的重要關(guān)鍵因素。
[0006]另外，由于目前臨床治療乙型肝炎廣泛使用的的HBV抗病毒療法存在很多不足，如干擾素會引起患者白細胞和血小板下降、可能會加重肝損害、有可能致畸或阻礙兒童發(fā)育、不能耐受藥 物的不良反應(yīng)等等；核苷類似物則由于導(dǎo)致宿主體內(nèi)的HBV基因發(fā)生突變而產(chǎn)生耐藥。這些因素導(dǎo)致臨床上HBV感染治療尤其是慢性HBV感染和慢性乙型肝炎的治療效果不甚理想，臨床上期待新的治療方法問世，以達到控制或逆轉(zhuǎn)乙型肝炎尤其是慢性HBV感染和慢性乙型肝炎致病的過程和進展，直至達到徹底治愈乙肝的目的。免疫調(diào)節(jié)治療有望成為治療慢性乙型肝炎的重要手段。研究表明，HBV慢性感染者體內(nèi)的T細胞被HBV觸發(fā)而自殺，這也許是決定HBV慢性感染者體內(nèi)HBV無法清除的關(guān)鍵。
[0007]另外，乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)是一種嗜肝DNA病毒,可引起各種急慢性肝炎、肝硬化等疾病，并與肝細胞癌的發(fā)生有非常密切的關(guān)系。根據(jù)HBV基因序列的差異，可將HBV毒株分為不同的基因型，目前已確定有A~H8個基因型。HBV基因型與其流行特征、致病性、疾病治療及預(yù)后等方面存在十分緊密的關(guān)系。不同基因型呈一定的地理區(qū)域性分布，我國的主要流行株有B型和C型。而基因型C在全國各地均有流行，尤其以北方地區(qū)流行為主，有的城市甚至高達69%。
[0008]由于HBV具有高度的宿主特異性，僅感染人和少數(shù)靈長類動物，不感染小鼠等常見實驗動物，有關(guān)HBV及乙型肝炎的研究受到很大限制。轉(zhuǎn)基因小鼠的建立，為乙型肝炎的基礎(chǔ)研究和抗乙肝病毒藥物的開發(fā)帶來了希望。但是HBV全基因組單拷貝或二拷貝轉(zhuǎn)基因動物實驗顯示HBV的復(fù)制和表達效率很低，嚴(yán)重影響了其廣泛應(yīng)用。目前國內(nèi)研究多為D型轉(zhuǎn)基因小鼠。而針對國流行株C型轉(zhuǎn)基因小鼠研究較少。因此十分有必要建立一種C型HBV基因高效復(fù)制和表達的轉(zhuǎn)基因小鼠，為我國乙型肝炎預(yù)防和治療研究更加理想的動物模型。然而，本實驗室通過顯微原核注射的方法制備出的C型轉(zhuǎn)基因小鼠，在免疫組化結(jié)果中顯示H)代到F3代陽性小鼠的肝組織和腎組織均有HBsAg表達，且均為胞質(zhì)型，表明該基因可以表達且可以傳代。但是小鼠血清和尿液HBsAg和HBeAg很難檢測到，血清熒光定量PCR也顯示HBV DNA為低復(fù)制表達水平，拷貝數(shù)為IO2~IO3拷貝/mL。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有乙型肝炎研究轉(zhuǎn)基因動物模型存在的技術(shù)不足，提供一種能穩(wěn)定傳代和表達的C型乙肝疾病研究動物模型，即高效復(fù)制和表達C型HBV轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建方法。
[0010]本發(fā)明目的是提供一種1.3拷貝C基因型HBV轉(zhuǎn)基因小鼠的制備方法。
[0011]本發(fā)明還提供上述1.3拷貝C基因型HBV轉(zhuǎn)基因小鼠的應(yīng)用。[0012]本發(fā)明上述目的通過以下技術(shù)方案實現(xiàn):
本發(fā)明提供了一種1.3拷貝C基因型HBV轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建方法，步驟如下:
51.胚胎干細胞系的建立；
52.將1.3倍加長片段C型HBV質(zhì)粒電轉(zhuǎn)導(dǎo)到胚胎干細胞，經(jīng)過培育和嘌呤霉素篩選得到陽性的胚胎干細胞，進行擴大培養(yǎng)；
53.把陽性胚胎干細胞注射到囊胚期小鼠卵細胞中，將注射好的囊胚移植到假孕母鼠的子宮，培育得到1.3拷貝C基因型HBV轉(zhuǎn)基因小鼠。
[0013]其中，步驟SI所述胚胎干細胞系的建立方法如下:
511.取懷孕3.5天的C57BL/6J雌性孕鼠，斷頸處死；
512.用酒精將Sll處死的孕鼠消毒；
513.打開孕鼠腹腔，修除去脂肪和系膜，從輸卵管根部及子宮下端分叉處剪下雙側(cè)子宮，將雙角子宮于陰道處剪斷；
514.注射器吸入M2(購自美國Sigma公司)作為沖胚液，注射器的針頭在使用之前把針尖剪掉磨平滅菌； 將注射器從子宮的一端插入子宮腔內(nèi)，夾緊，吹入沖胚液，再從子宮的另一端插入注射器，吹入沖胚液；
515.將上述沖胚液取出置于平皿中，平皿置于解剖鏡下，用口叼管吸取少量沖胚液，將囊胚吸出；
516.然后將囊胚放入KSOMaa胚胎培養(yǎng)基(購自美國ZenithBiotech公司)中，觀察，選擇比較好的囊胚；
517.將選擇的囊胚吹入預(yù)先接種了飼養(yǎng)層細胞(北京思賽因公司提供)的細胞板，換用小鼠胚胎干細胞建系培養(yǎng)基(購自北京思賽因公司)，每孔中放I個囊胚；
518.放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)，囊胚逐漸長大，最后貼壁，滋胚層展開，囊胚的內(nèi)細胞不斷增
殖；
519.培養(yǎng)4~6天后，囊胚的內(nèi)細胞成為一團圓柱形或凸起細胞團，此時可離散囊胚的內(nèi)細胞團，得到胚胎干細胞系。
[0014]步驟S2所述1.3倍加長片段C型HBV質(zhì)粒由中國人民解放軍第302醫(yī)院贈與，序列全長如SEQ ID N0.1所示。
[0015]所述1.3倍加長片段C型HBV質(zhì)粒的構(gòu)建方法為:通過Spe I和如a I兩個酶切位點將1.3倍加長片段C型HBV的DNA片段連接入pcDNA3.1質(zhì)粒中，得到1.3倍加長片段C型HBV質(zhì)粒的示意圖如附圖1所示。
[0016]步驟S2所述電轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法如下:
521.將培養(yǎng)的胚胎干細胞系用胰酶消化為單個細胞，加入終止培養(yǎng)基(廣州科學(xué)院與健康研究院提供)終止消化，離心，去除上清，然后用減血清培養(yǎng)基opt1-MEM (購自美國Gbico公司)懸浮；
522.懸浮液中加入電轉(zhuǎn)導(dǎo)所需的C型HBV質(zhì)粒，混勻，轉(zhuǎn)移到電轉(zhuǎn)杯中，用電轉(zhuǎn)儀進行電轉(zhuǎn)導(dǎo)，電轉(zhuǎn)導(dǎo)后迅速加入細胞培養(yǎng)基(廣州科學(xué)院與健康研究院提供)，然后鋪到細胞板中；
523.第二天，更換培養(yǎng)基為嘌呤霉素抗性的培養(yǎng)基，每天進行換液；
524.培養(yǎng)5~7天后，只有轉(zhuǎn)入了質(zhì)粒的細胞才能生長成集落克隆，分別挑取篩選出來的克隆到細胞板中，每個孔I個細胞克隆；
525.第二天，將細胞傳代到新的細胞板中，再次長滿后，細胞用于提取DNA進行PCR鑒定，得到陽性克??；
526.將得到的陽性克隆的細胞進行擴大培養(yǎng)，得到陽性胚胎干細胞系。
[0017]步驟S3所述注射的方法如下:
531.將電轉(zhuǎn)導(dǎo)獲得的陽性胚胎干細胞系消化重懸成單個細胞；
532.用激光破膜儀在囊胚的透明帶上打孔，用注射針將10~20枚陽性胚胎干細胞打到囊胚腔里面，然后用胚胎培養(yǎng)基KSOMaa (購自美國Zenith Biotech公司)培養(yǎng)2~3小時后，顯微鏡下觀察囊胚形態(tài)恢復(fù)。
[0018]步驟S3所述的假孕母鼠通過如下方法獲得:將KM母鼠和KM結(jié)扎公鼠按照雌雄比例2:1進行合籠飼養(yǎng)，次晨挑選有陰栓且陰門腫脹、紅潤的母鼠，即為假孕母鼠，記作0.5天假孕母鼠，而囊胚注射移植于2.5天假孕母鼠。
[0019]本發(fā)明還提供了上述1.3拷貝C基因型HBV轉(zhuǎn)基因小鼠在乙肝相關(guān)研究領(lǐng)域方面的應(yīng)用。
[0020]更具體地，所述應(yīng)用是指1.3拷貝C基因型HBV轉(zhuǎn)基因小鼠在研究機體免疫系統(tǒng)抗乙肝病毒感染、免疫致病過程中和抗乙肝病毒藥物開發(fā)方面的應(yīng)用。
[0021]本發(fā)明所用C57BL/6J鼠由本實驗室保存。C57BL/6J鼠的主要特性為:(摘自《實驗動物學(xué)》，主編:郝光榮，第二軍醫(yī)大學(xué)出版社，見該書105頁)
(O免疫學(xué)特性=IgG在20月齡前緩慢增加，IgG2b為高值，IgG為低值。無菌飼養(yǎng)較普通飼養(yǎng)者IgG絕對量低。IgG為高值，有的個體12個月齡后可超過800 μ g/mL。無菌飼養(yǎng)的IgM較高。細胞免疫力隨增齡較少降低,可能與自發(fā)腫瘤較少有關(guān)。較易誘發(fā)免疫耐受性。干擾素產(chǎn)量較高。對百日咳易感因子(Pertussis HSF)敏感；
(2)形態(tài)學(xué)特性:新生仔中雌性的16.8%、雄性的3%為小眼或無眼癥；新生仔的0.6%出現(xiàn)后肢多趾癥；
(3)生理學(xué)特性:嗜酒精性高，腎上腺貯存脂質(zhì)少；將雄鼠皮膚移植至同系雌鼠，20天后出現(xiàn)排拆；這是因為組織相容性原中存在雄性抗原，C57BL/6J小鼠較其它系小鼠更為顯著；注射酪蛋白后易引起淀粉樣變癥；用可的松可誘發(fā)出現(xiàn)腭裂的概率為20%，對結(jié)核桿菌敏感，對鼠痘病毒有一定抗力；
(4)癌發(fā)生率:乳腺癌少發(fā)(乳腺癌率為O~1%);用致癌劑難以致癌。老齡鼠淋巴瘤自發(fā)率為20~25% ;雌鼠白血病為7~16% ;經(jīng)X線照射后肝癌發(fā)生率高；
(5)壽命:最長達1200天；平均雌鼠692天，雄鼠676天。
[0022]本發(fā)明選用C57BL/6J鼠主要是因為其毛色為黑色，而囊胚注射時胚胎來源為白毛的KM鼠，這樣就無需通過另外的檢測方法來檢測嵌合鼠的嵌合率，直接通過毛色就可以判斷嵌合率。
[0023]目前針對國內(nèi)流行株C型HBV轉(zhuǎn)基因小鼠研究較少。本發(fā)明利用囊胚注射法在國內(nèi)率先建立一種能穩(wěn)定傳代和高效復(fù)制表達C型HBV轉(zhuǎn)基因小鼠，為我國乙型肝炎預(yù)防和治療研究提供更加理想的動物模型。本發(fā)明通過囊胚注射ES細胞法構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠，C型HBV基因能夠定點重 組ES細胞(定點重組的結(jié)構(gòu)示意圖如附圖2所示?；蚨c整合技術(shù)又稱為基因打靶，是指構(gòu)建含有同源序列的DNA片段的整合載體，通過各種轉(zhuǎn)化方法，使外源DNA序列與靶序列之間發(fā)生同源重組，從而將靶DNA序列定點破壞，通過一系列篩選手段，最終得到定向轉(zhuǎn)化的細胞。基因定點整合技術(shù)的其中一個方法就是引入重組酶Flp+Cre系統(tǒng)，在胚胎干細胞(ES cell)中通過置換型載體進行同源重組，向基因組靶位點引入選擇標(biāo)記基因，并在其兩側(cè)分別引入同向排列的FRT和Loxp位點。兩條同源染色體都帶有FRT和Loxp位點且引入的FRT和Loxp位點不能干擾祀基因的轉(zhuǎn)錄。
[0024]通過大量的實驗表明，根據(jù)本發(fā)明所述構(gòu)建方法獲得的陽性C基因型HBV轉(zhuǎn)基因小鼠的效率非常高，且能夠穩(wěn)定傳代。經(jīng)過反復(fù)的實驗驗證，本發(fā)明通過囊胚注射ES細胞得到的小鼠嵌合率有40%~60%，大大提高了小鼠的轉(zhuǎn)基因效率。另外，本發(fā)明使用囊胚注射ES細胞的方法，HBV-C基因能夠定點重組ES細胞，得到的C型HBV嵌合體小鼠陽性率更高，陽性率為50%，明顯高于現(xiàn)有技術(shù)獲得的C型HBV轉(zhuǎn)基因小鼠。
[0025]另外，本發(fā)明轉(zhuǎn)基因小鼠具有與傳統(tǒng)轉(zhuǎn)1.3拷貝的C基因型HBV轉(zhuǎn)基因小鼠不同的特點，該模型的H BV的復(fù)制和表達效率較高，為進一步研究乙肝發(fā)病機制，肝臟病變的發(fā)展和轉(zhuǎn)歸機制研究，為C型HBV感染后機體的病理改變以及機體免疫系統(tǒng)在抗病毒感染和免疫致病過程中的作用機制提供理想的動物模型。這一模型的建立將填補國內(nèi)外缺乏此類動物模型的空白，使相關(guān)的研究手段更加豐富，也為抗乙肝藥物的研發(fā)提供更加先進的評價體系和技術(shù)平臺，為建立乙肝的免疫治療方法并作出評價提供一種全新的思路和研究平臺，可以利用此轉(zhuǎn)基因小鼠模型進行乙肝免疫致病機制的研究及乙肝免疫治療新方法的探索性研究，并為后續(xù)實現(xiàn)這種新的乙肝疾病模型的產(chǎn)業(yè)化和批量供應(yīng)奠定堅實的基礎(chǔ)，促進我國乙肝治療、研究水平的提高。
[0026]本發(fā)明具有以下有益效果:
本發(fā)明克服了乙型肝炎研究的傳統(tǒng)轉(zhuǎn)1.3拷貝的C基因型HBV轉(zhuǎn)基因小鼠HBV復(fù)制和表達效率較低等技術(shù)問題，提供了一種利用囊胚注射法構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠的方法，該方法能夠?qū)崿F(xiàn)C型HBV定點整合轉(zhuǎn)基因小鼠，獲得能穩(wěn)定傳代和高效的C型乙肝疾病模型，即高效復(fù)制和表達C型HBV轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建方法，填補了國內(nèi)外缺乏此類動物模型的空白。
[0027]另外，本發(fā)明構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠使用的ES細胞來源是C57BL/6小鼠，毛色為黑色，而囊胚來源是KM小鼠，毛色為白色，將ES細胞注射到囊胚后，生出的小鼠的毛色是部分是灰的或黑的，而且可以遺傳到下一代，這樣就可以通過毛色簡單地鑒定嵌合率。而且選擇繁殖能力強的KM鼠做假孕鼠，產(chǎn)仔率高，母性好。
[0028]本發(fā)明構(gòu)建方法構(gòu)建得到的轉(zhuǎn)基因小鼠能夠全面、真實地反映臨床乙肝發(fā)生、發(fā)展過程，為乙肝發(fā)病機制、肝臟病變的發(fā)展和轉(zhuǎn)歸機制研究、機體免疫系統(tǒng)在抗病毒感染和免疫致病過程中的作用機制研究及抗乙肝藥物的研發(fā)和評價提供理想動物模型，為建立乙肝的免疫治療方法并作出評價提供了一種全新的思路和研究平臺，促進我國乙肝治療研究水平的提高。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0029]圖1為1.3倍加長片段C型HBV質(zhì)粒示意圖。
[0030]圖2為C型HBV基因定點重組ES細胞的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0031]圖3為本發(fā)明構(gòu)建方法構(gòu)建得到的陽性嵌合鼠?！揪唧w實施方式】
[0032]以下結(jié)合附圖和具體實施例來進一步說明本發(fā)明，但實施例并不對本發(fā)明做任何形式的限定。除非特別說明，本發(fā)明采用的試劑、設(shè)備和方法為本【技術(shù)領(lǐng)域】常規(guī)試劑、設(shè)備和方法。
[0033]除非特別說明，本發(fā)明實施例所用C57BL/6J小鼠和KM小鼠均為市購。
[0034]實驗例I構(gòu)建1.3拷貝C基因型HBV轉(zhuǎn)基因小鼠 1、胚胎干細胞(ES細胞)系的建立
(I)取懷孕3.5天的C57BL/6J雌性孕鼠，斷頸處死。
[0035](2)用75%酒精將Sll處死的孕鼠消毒，盡量噴濕全身。
[0036](3)打開孕鼠腹腔，修除去脂肪和系膜，從輸卵管根部及子宮下端分叉處剪下雙側(cè)子宮，將雙角子宮于陰道處剪斷。
[0037](4)注射器吸入M2 (購自美國Sigma公司)作為沖胚液，注射器的針頭在使用之前把針尖剪掉磨平滅菌；將注射器從子宮的一端插入子宮腔內(nèi)2~3mm，夾緊，吹入沖胚液，再從子宮的另一端插入注射器，吹入沖胚液。
[0038](5)將上述沖胚液取出置于平皿中，平皿置于解剖鏡下，用口叼管吸取少量沖胚液，將囊胚吸出。
[0039](6)然后將囊胚放入KSOMaaa胚胎培養(yǎng)基(購自美國Zenith Biotech公司)中，觀察，選擇比較好的囊胚。
[0040](7)將選擇的囊胚吹入預(yù)先接種了飼養(yǎng)層細胞(北京思賽因公司提供)的4孔板或24孔板，換用小鼠胚胎干細胞建系培養(yǎng)基(購自北京思賽因公司)，每孔中放I個囊胚。
[0041](8)放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)，囊胚逐漸長大，最后貼壁，滋胚層展開，囊胚的內(nèi)細胞不斷增殖。
[0042](9)培養(yǎng)4~6天后，囊胚的內(nèi)細胞成為一團圓柱形或凸起細胞團，此時可離散囊胚的內(nèi)細胞團，得到胚胎干細胞系。
[0043]2、本實施例所用的1.3倍加長片段C型HBV質(zhì)粒由中國人民解放軍第302醫(yī)院贈與，序列全長如SEQ ID N0.1所示。
[0044]所述1.3倍加長片段C型HBV質(zhì)粒的構(gòu)建方法為:通過Spe I和Apa I兩個酶切位點將1.3倍加長片段C型HBV的DNA片段連接入pcDNA3.1質(zhì)粒中，得到1.3倍加長片段C型HBV質(zhì)粒的示意圖如附圖1所示。
[0045]3、1.3拷貝C基因型HBV電轉(zhuǎn)導(dǎo)到胚胎干細胞(ES細胞)
(1)將培養(yǎng)的胚胎干細胞系(12孔板一個孔長滿)用胰酶消化為單個細胞，加入終止培養(yǎng)基(廣州科學(xué)院與健康研究院提供)終止消化，轉(zhuǎn)移到15mL離心管中1000rpm離心5分鐘，去除上清(盡量完全去除干凈)，然后用100μL的opt1-MEM (購自美國Gbico公司)懸浮，轉(zhuǎn)移到 1.5mL的離 心管(EP)管中；
(2)加入電轉(zhuǎn)所需的1.3倍加長片段C型HBV質(zhì)粒5Pg，用移液槍輕輕混勻，再轉(zhuǎn)移到電轉(zhuǎn)杯中，用電轉(zhuǎn)儀進行電轉(zhuǎn)，電轉(zhuǎn)后迅速加入細胞培養(yǎng)基(廣州科學(xué)院與健康研究院提供)，然后鋪到細胞板(6孔板I個孔)中。
[0046](3)第二天，更換培養(yǎng)基為有抗性的培養(yǎng)基(使用Wg/mL的puix)進行篩選)，每天進行換液(抗性的)。[0047](4) 5~7天后，只有轉(zhuǎn)入了質(zhì)粒的細胞才能生長成集落克隆，分別挑取篩選出來的克隆到96孔板中，每個孔I個細胞克隆。
[0048](5)第二天，將細胞傳代到48孔板中，再次長滿后，大部分細胞可以用于提取DNA進行PCR鑒定，剩下的細胞繼續(xù)培養(yǎng)直至鑒定結(jié)果出來。
[0049](6)將得到的陽性克隆的細胞進行擴大培養(yǎng)，得到陽性胚胎干細胞系。
[0050]經(jīng)電轉(zhuǎn)導(dǎo)后，1.3拷貝C型HBV基因能夠定點重組ES細胞，定點重組ES細胞的示意圖如附圖2所示。
[0051 ] 4、陽性胚 胎干細胞囊胚注射
(I) 3.5天KM母鼠通過沖雙側(cè)子宮取得囊胚。
[0052](2)將電轉(zhuǎn)導(dǎo)獲得的陽性胚胎干細胞系消化重懸成單個細胞。
[0053](3)用激光破膜儀在囊胚的透明帶上打孔，用注射針將15~20枚的陽性胚胎干細胞打到囊胚腔里面，然后用KSOMaa胚胎培養(yǎng)基(購自美國Zenith Biotech公司)培養(yǎng)2~3小時后，顯微鏡下觀察囊胚形態(tài)恢復(fù)。
[0054]5、囊胚移植 (I)假孕母鼠的制備
KM鼠繁殖能力強，產(chǎn)仔率高，母性好，因此選用KM鼠來制備假孕鼠。
[0055]假孕母鼠的制備方法如下:將KM母鼠和KM結(jié)扎公鼠按照雌雄比例2:1進行合籠飼養(yǎng)，次晨挑選有陰栓且陰門腫脹、紅潤的母鼠，即為假孕母鼠，記作0.5天假孕母鼠，而囊胚注射移植于2.5天假孕母鼠。
[0056]將注射好的囊胚移植到2.5天的假孕母鼠的子宮，培育得到1.3拷貝C基因型HBV轉(zhuǎn)基因小鼠。
[0057]6、結(jié)果統(tǒng)計
結(jié)果共注射囊胚221枚，成活180枚，注射成活率81.45%。共移植假孕雌鼠14只，10只懷孕，假孕雌鼠妊娠率71.4% ;產(chǎn)仔10只，其中2只產(chǎn)后第二天被吃，存活的8只H)代小鼠。
[0058]實驗例2實施例1制備1.3拷貝C型HBV轉(zhuǎn)基因小鼠的鑒定 1、小鼠嵌合率的統(tǒng)計
(I)根據(jù)小鼠毛色判斷小鼠的嵌合率:由于ES細胞來源于黑色毛的C57BL/6J鼠，而囊胚來源于白毛的KM鼠，因而根據(jù)出生小鼠黑毛的百分率來判斷小鼠的嵌合率。
[0059](2)將得到的嵌合鼠(H)代)和正常的KM鼠合籠。如果得到的Fl代小鼠是嵌合鼠，證明了該H)代嵌合鼠有生殖嵌合，可以遺傳到下一代。
[0060]2、ELISA檢測轉(zhuǎn)基因小鼠血清和尿液中的乙肝表面抗原(HBsAg)和乙肝e抗原(HBeAg )，檢測方法如下:
(I)乙肝表面抗原(HBsAg)的檢測(ELISA法)
利用乙型肝炎病毒表面抗原診斷試劑盒(購自上?？迫A生物技術(shù)有限公司)生產(chǎn)許可證號:滬20110148，批準(zhǔn)文號:國藥準(zhǔn)字S10910113，生產(chǎn)批號:20130105進行檢測，檢測方法參照說明書進行。
[0061]檢測具體操作如下:
S1.配置工作濃度洗滌液，用純水進行25倍稀釋；52.根據(jù)實驗要求(9個孔，一個空白對照孔，兩個陰性對照孔，兩個陽性對照孔，4個嵌合鼠樣品)，選擇9個孔的反應(yīng)板條；
53.分別加入75PL的4個嵌合鼠樣品和陰性對照、陽性對照(陰性對照何陽性對照為試劑盒自帶)于反應(yīng)孔中(預(yù)留陽性對照2孔，陰性對照2孔，空白對照I孔)。然后用封片紙覆蓋反應(yīng)板，將反應(yīng)板置于37°C孵育60min ；
54.取出反應(yīng)板，撕去封片，在已加入待測樣本和陰、陽性對照的孔中加入50μL酶結(jié)合物(試劑盒自帶)，空白對照孔不加，輕輕震蕩10s，用封片紙覆蓋反應(yīng)條，將反應(yīng)板置于37°C孵育30min ；
55.洗板:取出反應(yīng)板，撕去封片，棄去孔內(nèi)液體，用步驟SI配置的工作濃度洗滌液注滿各孔，靜置30~60s，甩干，重復(fù)5次后，在干凈的吸水紙上拍干；
56.在所有孔內(nèi)加入顯色劑A、顯色劑B各50μL，混勻；輕輕震蕩10s，用封片紙覆蓋反應(yīng)條，將反應(yīng)板置于37°C孵育30min ；
57.在所有孔內(nèi)加入50μL終止液，振蕩反應(yīng)板5s;酶標(biāo)儀讀數(shù)，波長為450nm和630nm雙波長，先用空白孔調(diào)零，然后讀取各孔OD值。
[0062]結(jié)果判斷:C0V=陰性對照平均值+0.1。當(dāng)待測樣本OD值≥COV時，判斷為陽性；當(dāng)待測樣本OD值〈C0V時，判斷為陰性。
[0063](2)乙肝 e 抗原(HBeAg) (ELISA 法)
乙型肝炎病毒e抗原診斷試劑盒(購自上?？迫A生物技術(shù)有限公司)生產(chǎn)許可證號:滬食藥監(jiān)械生產(chǎn)許20030916號，產(chǎn)品注冊號:國食藥監(jiān)械(準(zhǔn))字2012第3400740號，產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)號:YZB/國2142-2012生產(chǎn)批號:20121206進行檢測，檢測方法參照說明書進行。
[0064]檢測具體操作如下:
S1.配置工作濃度洗滌液，用純水進行25倍稀釋；
S2.根據(jù)實驗要求，選擇9個孔的反應(yīng)板條(9個孔，一個空白對照孔，兩個陰性對照孔，兩個陽性對照孔，4個嵌合鼠樣品)；
S3.每孔加入待測樣品50μL，設(shè)陰性對照、陽性對照(陰性對照何陽性對照為試劑盒自帶)各2孔，每孔加入陰性對照(或陽性對照)各50μL，并設(shè)空白對照I孔；
S4.每孔加入50μL酶結(jié)合物(空白對照孔不加)，充分混勻，封板，置于37°C孵育30min ；
S5.洗板:棄去孔內(nèi)液體，用步驟SI配置的工作濃度洗滌液注滿各孔，靜置5s，甩干，重復(fù)5次后拍干；
S6.每孔加入顯色劑A、顯色劑B各50μL，混勻，封板，置于37°C孵育15min；
S7.每孔加入終止液50μL，混勻；酶標(biāo)儀讀數(shù)，波長為450nm和630nm雙波長，先用空白孔調(diào)零，然后讀取各孔OD值。
[0065]結(jié)果判斷=COV=陰性對照平均OD值X 2.1 (陰性對照OD值低于0.050按0.050計算，高于0.050按實際OD值計算)。當(dāng)待測樣本OD值≥ COV時，判斷為陽性；當(dāng)待測樣本OD值〈C0V時，判斷為陰性。
[0066]3、鑒定結(jié)果
8只H)代小鼠中有陽性嵌合小鼠4只，嵌合鼠陽性率為50%。
[0067]實驗例3實施例1制備1.3拷貝C型HBV轉(zhuǎn)基因小鼠的傳代鑒定1、將實施例制備得到的嵌合鼠(H)代)和正常的KM鼠合籠，得到Fl代小鼠32只。
[0068]2、小鼠嵌合率的統(tǒng)計，以及ELISA檢測轉(zhuǎn)基因小鼠血清和尿液中的乙肝表面抗原(HBsAg)和乙肝e抗原(HBeAg)的方法同實施例2。
[0069]3、鑒定結(jié)果
(1)32只Fl代小鼠中有5只為陽性嵌合小鼠，嵌合鼠陽性率為15.6%，表明本發(fā)明方法構(gòu)建得到能夠傳代的嵌合鼠。
[0070](2) 5只Fl代嵌合小鼠分別編號為BI~B5。
[0071]ELISA檢測乙肝表面抗原(HBsAg)和乙肝e抗原(HBeAg)的結(jié)果顯示，BI~B5小鼠血清和尿液中的HBsAg和HBeAg均為陽性。測得OD值如表1所示:
表1 ELISA檢測Fl代嵌合小鼠血清和尿液中的HBsAg和HBeAg
【權(quán)利要求】
1.一種1.3拷貝C基因型HBV轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟如下: .51.胚胎干細胞系的建立； .52.將1.3倍加長片段C型HBV質(zhì)粒電轉(zhuǎn)導(dǎo)到胚胎干細胞，經(jīng)過鑒定得到陽性的胚胎干細胞，進行擴大培養(yǎng)； .53.把陽性胚胎干細胞注射到囊胚中，將注射好的囊胚移植到假孕母鼠的子宮，培育得到1.3拷貝C基因型HBV轉(zhuǎn)基因小鼠。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，SI所述胚胎干細胞系的建立方法如下: .511.取懷孕3.5天的C57BL/6J雌性孕鼠，斷頸處死； .512.用酒精將Sll處死的孕鼠消毒； .513.打開孕鼠腹腔，修除去脂肪和系膜，從輸卵管根部及子宮下端分叉處剪下雙側(cè)子宮，將雙角子宮于陰道處剪斷； .514.注射器吸入沖胚液，注射器的針頭在使用之前把針尖剪掉磨平滅菌；將注射器從子宮的一端插入子宮腔內(nèi)，夾緊，吹入沖胚液，再從子宮的另一端插入注射器，吹入沖胚液； .515.將上述沖胚液取出置于平皿中，平皿置于解剖鏡下，用口叼管吸取少量沖胚液，將囊胚吸出； .516.然后將囊胚放入胚胎培養(yǎng)基中，觀察，選擇比較好的囊胚； .517.將選擇的囊胚吹入預(yù)先接種了飼養(yǎng)層細胞的細胞板，換用小鼠胚胎干細胞建系培養(yǎng)基，每孔中放I個囊胚； .518.放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)，囊胚逐漸長大，最后貼壁，滋胚層展開，囊胚的內(nèi)細胞不斷增殖； .519.培養(yǎng)4~6天后，囊胚的內(nèi)細胞成為一團圓柱形或凸起細胞團，此時可離散囊胚的內(nèi)細胞團，得到胚胎干細胞系。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，S2所述電轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法如下: .521.將培養(yǎng)的胚胎干細胞系用胰酶消化為單個細胞，加入終止培養(yǎng)基終止消化，離心，去除上清，然后用減血清培養(yǎng)基opt1-MEM進行懸??； .522.懸浮液中加入電轉(zhuǎn)導(dǎo)所需的C型HBV質(zhì)粒，混勻，轉(zhuǎn)移到電轉(zhuǎn)杯中，用電轉(zhuǎn)儀進行電轉(zhuǎn)導(dǎo)，電轉(zhuǎn)導(dǎo)后迅速加入細胞培養(yǎng)基，然后鋪到細胞板中； .523.第二天，更換培養(yǎng)基為嘌呤霉素抗性的培養(yǎng)基，每天進行換液； .524.培養(yǎng)5~7天后，只有轉(zhuǎn)入了質(zhì)粒的細胞才能生長成集落克隆，分別挑取篩選出來的克隆到細胞板中，每個孔I個細胞克隆； .525.第二天，將細胞傳代到新的細胞板中，再次長滿后，細胞用于提取DNA進行PCR鑒定，得到陽性克隆； . 526.將得到的陽性克隆的細胞進行擴大培養(yǎng)，得到陽性胚胎干細胞系。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，S3所述注射的方法如下: .531.將電轉(zhuǎn)導(dǎo)獲得的陽性胚胎干細胞系消化重懸成單個細胞； .532.用激光破膜儀在囊胚的透明帶上打孔，用注射針將陽性胚胎干細胞打到囊胚腔里面，然后用KSOMaa胚胎培養(yǎng)基培養(yǎng)2~3小時后，顯微鏡下觀察囊胚形態(tài)恢復(fù)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，S3所述的假孕母鼠通過如下方法獲得:將KM母鼠和KM結(jié)扎公鼠按照雌雄比例2:1進行合籠飼養(yǎng)，次晨挑選有陰栓且陰門腫脹、紅潤的母鼠，即為假孕母鼠，記作0.5天假孕母鼠，而囊胚移植于2.5天假孕母鼠。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述所述構(gòu)建方法制備得到的1.3拷貝C基因型HBV轉(zhuǎn)基因小鼠在乙肝相關(guān)研究領(lǐng)域方面的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，1 .3拷貝C基因型HBV轉(zhuǎn)基因小鼠在研究機體免疫系統(tǒng)抗乙肝病毒感染、免疫致病過程中和抗乙肝病毒藥物開發(fā)方面的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N5/0735GK103952441SQ201410011674
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年1月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月10日
【發(fā)明者】劉光澤, 陳媚娟, 李秀梅, 謝勇, 張振偉, 孔祥平 申請人:中國人民解放軍第四五八醫(yī)院