本發(fā)明屬于生物工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及一種大菱鲆增食欲素Orexin基因、重組蛋白及其制備方法。
背景技術(shù)：
：Orexin（增食欲素）是一組近年來發(fā)現(xiàn)的新型下丘腦神經(jīng)肽，最初是在研制能控制進(jìn)食的新藥試驗(yàn)中，在大鼠下丘腦腹外側(cè)核內(nèi)發(fā)現(xiàn)的。Orexin主要由下丘腦神經(jīng)元產(chǎn)生，通過其神經(jīng)纖維的直接投射或釋放入腦脊髓液作用于靶位點(diǎn)，激活2種與G蛋白耦聯(lián)的細(xì)胞表面受體OX1R和OX2R，參與機(jī)體對攝食、能量代謝、睡眠覺醒循環(huán)等生理活動(dòng)的調(diào)節(jié)。Orexin在魚類中的重要生理作用，近年來才被科學(xué)家認(rèn)識(shí)并逐漸得到重視，針對Orexin的基因克隆、組織學(xué)分布、生理作用等相關(guān)研究隨之展開。近年來，隨著分子生物學(xué)特別是功能基因組學(xué)技術(shù)，被陸續(xù)應(yīng)用于魚類重要下丘腦神經(jīng)多肽的發(fā)掘和生理調(diào)控功能研究以來，人們對于魚類Orexin的結(jié)構(gòu)、分布以及功能等領(lǐng)域的研究逐步得以深入。與此同時(shí)，隨著垂體促性腺激素釋放激素（GnRH）、生長激素（GH）等神經(jīng)多肽在養(yǎng)殖生產(chǎn)中成熟地應(yīng)用于調(diào)控魚類的生長和繁殖以來，如何借助Orexin來人為調(diào)控養(yǎng)殖魚類的攝食、營養(yǎng)代謝、能量平衡及其他生理活動(dòng)也逐漸成為關(guān)注的重點(diǎn)。當(dāng)前中國的海水魚類養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速，為了促進(jìn)產(chǎn)業(yè)朝著規(guī)模化、集約化、環(huán)境友好型的新型養(yǎng)殖模式發(fā)展，對魚類攝食機(jī)理、營養(yǎng)吸收和能量轉(zhuǎn)換等方面的基礎(chǔ)研究顯得尤為重要，為此急需開展魚類Orexin等神經(jīng)內(nèi)分泌因子相關(guān)研究，開發(fā)魚類早期發(fā)育必需的營養(yǎng)飼料，特別是為研制可應(yīng)用于生產(chǎn)的促進(jìn)魚類攝食和生長的高新產(chǎn)品及技術(shù)打下基礎(chǔ)，以實(shí)現(xiàn)育苗早期成活率的大幅度提高，就必將有利于推動(dòng)海水魚類養(yǎng)殖大產(chǎn)業(yè)向集約化、可持續(xù)、環(huán)境友好型的方向發(fā)展。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供了一種大菱鲆增食欲素Orexin基因、重組蛋白及其制備方法。本發(fā)明構(gòu)建了含有大菱鲆增食欲素Orexin基因的重組表達(dá)載體，并將其轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株進(jìn)行表達(dá)，經(jīng)純化獲得大菱鲆增食欲素重組蛋白。為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)：本發(fā)明提供了一種大菱鲆增食欲素Orexin，所述大菱鲆增食欲素Orexin的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。本發(fā)明提供了編碼所述的大菱鲆增食欲素Orexin的Orexin基因，所述Orexin基因的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。進(jìn)一步的：克隆所述Orexin基因所需的引物F1和R1序列如下：F1:5′-TGGGCAAGCGGGAGGAGGATGAGYAT-3′；R1:5′-ATRCTCATCCTCCTCCCGCTTGCCCA-3′。本發(fā)明提供了含有所述的Orexin基因的重組表達(dá)載體。進(jìn)一步的：所述重組表達(dá)載體為pET-24a-SL，其制備過程為：使用正向引物F和反向引物R，通過PCR擴(kuò)增獲得所述Orexin基因，并在Orexin基因的兩端分別添加XhoI和EcoRI酶切位點(diǎn)，將該核苷酸序列經(jīng)過限制性內(nèi)切酶XhoI和EcoRI酶切后，插入pET-24a(+)表達(dá)載體XhoI和Eco4RI酶切位點(diǎn)之間，獲得重組表達(dá)載體pET-24a-orexin。進(jìn)一步的：所述正向引物F和反向引物R序列如下：F:5′-CCGGAATTCATGACTCCCCTTCACAAAAAG-3′；R:5′-CCGCTCGAGCACAGGAAGGGGTGTTGTGATG-3′；PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為：95℃5min；95℃35s，55℃退火35s，72℃延伸1min，35個(gè)循環(huán)。本發(fā)明提供了所述的大菱鲆增食欲素Orexin重組蛋白的制備方法，所述制備方法包括如下步驟：（1）將重組表達(dá)載體pET-24a-orexin轉(zhuǎn)化大腸桿菌，將挑取的陽性克隆菌株接種于含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)瓶中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜，次日轉(zhuǎn)接到含有LB培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，37℃培養(yǎng)到OD600=0.5~1.0時(shí)，加入IPTG誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)，離心收集細(xì)菌培養(yǎng)物；（2）將誘導(dǎo)表達(dá)后的細(xì)菌培養(yǎng)物重懸于裂解液中，超聲破碎，將超聲破碎的細(xì)胞裂解液離心，收集沉淀即為包涵體，使用包涵體洗滌液洗滌包涵體；用溶解緩沖液溶解包涵體，4℃放置過夜；室溫下離心；將上述溶液滴加到緩沖液，將稀釋后的包涵體溶液裝入透析袋中，4℃透析過夜；（3）利用低壓層析系統(tǒng)，將透析后的包涵體溶液上樣至Ni柱；收集洗脫后的蛋白流出液；裝入透析袋中，放入緩沖液中，透析過夜；獲得純化后的增食欲素Orexin重組蛋白。進(jìn)一步的：所述步驟（1）中IPTG的濃度為0.5~0.7mmol/L，誘導(dǎo)表達(dá)的時(shí)間為3~5h。進(jìn)一步的：所述步驟（3）中透析后的包涵體溶液以0.5ml/min流速上樣至Ni-IDA-SepharoseCL-6B親和層析柱。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和技術(shù)效果是：本發(fā)明利用分子生物學(xué)手段獲得大菱鲆增食欲素Orexin的成熟肽編碼序列，通過構(gòu)建重組大菱鲆增食欲素Orexin的原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌，誘導(dǎo)菌體表達(dá)，收集菌體及純化獲得重組表達(dá)的大菱鲆增食欲素Orexin重組蛋白。本發(fā)明可用于制備ELISA試劑盒和飼料添加劑等產(chǎn)品，將為研究大菱鲆的食欲調(diào)控機(jī)理和開發(fā)可應(yīng)用于生產(chǎn)的促進(jìn)魚類攝食和生長的新產(chǎn)品打下良好基礎(chǔ)。附圖說明圖1：表達(dá)載體pET-24a-orexin示意圖。圖2：重組表達(dá)載體pET-24a-orexin的雙酶切核酸電泳圖；其中：LaneM：DL2,000DNAMarker；Lane1：重組表達(dá)載體雙酶切產(chǎn)物。圖3：SDS-PAGE分析重組大菱鲆增食欲素（Orexin）蛋白表達(dá)情況，其中：LaneM：蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。圖4：SDS-PAGE分析純化的大菱鲆增食欲素（Orexin）重組蛋白，其中：LaneM：蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；Lane1：經(jīng)Ni柱純化后的大菱鲆Orexin重組蛋白。具體實(shí)施方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步詳細(xì)的說明。1、大菱鲆下丘腦總RNA提取大菱鲆下丘腦總RNA提取采用的EasyPureTMRNAKit動(dòng)物組織提取試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司提供)。具體操作方法如下：1）取20mg左右下丘腦組織，快速用液氮速凍組織，用研磨杵將組織研磨成粉未，將粉未轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管中加入0.6mlBindingBuffer和15mlProteinaseK，混勻后56℃處理20分鐘。2）室溫12000r/min離心5分鐘吸上清于RNase-free的離心管中，向上清中加入等倍體積70%乙醇。3）徹底混勻，將得到的沉淀和溶液一起加入離心柱中，12000r/min離心30秒，棄掉流出液。4）向離心柱中加500mlCB4（CleanBuffer4），室溫12000r/min離心30秒，棄掉流出液。然后向離心柱中加入80ml的DNaseI工作液，室溫放置15分鐘.5）重復(fù)步驟2）一次。6）加500mlWB4（WashBuffer4）室溫12000r/min離心30秒，棄掉流出液。7）重復(fù)步驟4）一次。8）室溫12000r/min離心2分鐘，徹底去除殘留的乙醇，在室溫中靜置數(shù)分鐘徹底晾干離心柱。9）將離心柱放入一個(gè)新的1.5mlRNase-free的管中，并向離心柱中央加入50mlRNase-freeWater,,室溫靜置1分鐘。10）室溫12000r/min離心2分鐘，用45ml洗脫液洗脫RNA。11）取5mlRNA樣品在2.0%的瓊脂糖凝膠中電泳，EB染色觀察結(jié)果。再取2mlRNA樣品在NanoDrop2000c分光光度計(jì)檢測RNA的濃度和純度。2、大菱鲆增食欲素（Orexin基因全長序列RACE克隆1）3’RACE擴(kuò)增大菱鲆增食欲素Orexin基因cDNA下游序列使用SMARTRACE試劑盒以及特異引物F1（SEQIDNO:3）和試劑盒中的3’CDS通用引物,進(jìn)行3’RACE擴(kuò)增。反應(yīng)條件如下：95°C預(yù)變性5min：以下重復(fù)30個(gè)循環(huán)：95°C變性35s，54°C退火35s，72°C延伸50S；最后72°C延伸10min。3’RACE擴(kuò)增PCR體系：反應(yīng)體系反應(yīng)體積（20μl）2×PCRMix10μlddH2O7μlF11μl3’CDS1μlcDNA1μl2）5’RACE擴(kuò)增大菱鲆增食欲素Orexin基因cDNA上游序列使用SMARTRACE試劑盒以及特異引物R1（SEQIDNO:4）和試劑盒中的5’Oliogo通用引物,進(jìn)行5’RACE擴(kuò)增。反應(yīng)條件如下：95°C預(yù)變性5min：以下重復(fù)35個(gè)循環(huán)：95°C變性35s，52°C退火35s，72°C延伸40min；最后72°C延伸10min。F1:5′-TGGGCAAGCGGGAGGAGGATGAGYAT-3′（SEQIDNO:3）；R1:5′-ATRCTCATCCTCCTCCCGCTTGCCCA-3′（SEQIDNO:4）。5’RACE擴(kuò)增PCR體系：反應(yīng)體系反應(yīng)體積（20μl）2×PCRMix10μlddH2O7μlR11μl5’Oliogo1μlcDNA1μl3）用2.0%瓊脂糖凝分離PCR擴(kuò)增得到DNA片段,并利用膠回收試劑盒（北京天根生化科技有限公司）純化分離得到目的DNA片段,然后亞克隆到pMD18-載體上，挑選陽性克隆委托上海生工進(jìn)行測序，獲得核苷酸序列如SEQIDNO:2所示的Orexin基因，編碼產(chǎn)生的大菱鲆增食欲素Orexin的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。3、大菱鲆增食欲素Orexin的蛋白重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建1）以大菱鲆下丘腦總RNA反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，以帶有酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基的引物：正向引物F和反向引物R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：95℃5min；95℃35s，55℃退火35s，72℃延伸1min，35個(gè)循環(huán)。正向引物(F):Forward5’-CCGGAATTCATGACTCCCCTTCACAAAAAG-3’（SEQIDNO:5）；反向引物(R)：Forward5’-CCGCTCGAGCACAGGAAGGGGTGTTGTGATG-3’（斜體CCG為保護(hù)堿基；下劃線GAATTC為Xhol位點(diǎn)；下劃線CTCGAG為EcoR1位點(diǎn)）（SEQIDNO:6）。2）克隆得到編碼大菱鲆增食欲素（Orexin）基因蛋白的cDNA序列并且兩端分別帶有XhoI和EcoRI酶切位點(diǎn)，將該序列經(jīng)過限制性內(nèi)切酶XhoI和EcoRI酶切后，插入pET-24a(+)表達(dá)載體XhoI和EcoRI酶切位點(diǎn)之間，獲得重組表達(dá)載體pET-24a-orexin。表達(dá)載體示意圖如圖1所示，大菱鲆增食欲素Orexin基因的cDNA序列經(jīng)XhoI和EcoRI雙酶切后的電泳結(jié)果如圖2所示。4、大菱鲆增食欲素（Orexin）重組蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)將重組表達(dá)載體pET-24a-orexin轉(zhuǎn)化大腸桿菌BG21，挑選陽性克隆，測序正確后，將挑取的BG21菌株接種于含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)瓶中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜，次日按1:100~1:500(V/V)轉(zhuǎn)接到含有10LLB培養(yǎng)基的15L的發(fā)酵罐中，37℃培養(yǎng)到OD600=0.5~1.0時(shí)，按濃度0.5~0.7mmol/L加入IPTG誘導(dǎo)3~5h，6000rpm離心10min，收集細(xì)菌培養(yǎng)物放到置于-20℃保存。采用SDS-PAGE分析重組大菱鲆Orexin蛋白表達(dá)情況，結(jié)果如圖3所示。5、大菱鲆增食欲素（Orexin）重組包涵體蛋白的變復(fù)性將誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體沉淀重懸于裂解液Lysisbuffer(20mMTris-HClcontaining1mMPMSFandbacteriaproteaseinhibitorcocktail,pH8.0)中，超聲破碎，將超聲破碎的細(xì)胞裂解液4℃10000g離心20min，收集沉淀即為包涵體，使用包涵體洗滌液(20mMTris，1mMEDTA，2M尿素，1MNaCl，1％TritonX-100，pH8.0)洗滌包涵體3-5次；用溶解緩沖液(20mMTris，5mMDTT，8M尿素pH8.0)，按一定比例溶解包涵體，4度放置過夜；室溫，15000rpm離心15min；將上述溶液滴加20mMTris-HCL5mMEDTABufferPH7.8緩沖液中，逐步成倍梯度稀釋緩慢攪拌，剪取處理好適量長度的透析袋，在純水中沖洗，將蛋白溶液裝入透析袋中，放入1*PBS（PH7.4）緩沖液中，4℃透析過夜。6、大菱鲆增食欲素（Orexin）重組蛋白的Ni柱親和純化利用低壓層析系統(tǒng)，將透析后的包涵體溶液以0.5ml/min流速上樣至Ni-IDABinding-Buffer預(yù)平衡的Ni-IDA-SepharoseCL-6B親和層析柱；用Ni-IDABinding-Buffer以0.5ml/min流速?zèng)_洗，至流出液OD280值到達(dá)基線；用Ni-IDAWashing-Buffer(20mMTris-HCl，20mM咪唑，0.15MNaCl，pH8.0)以1ml/min流速?zèng)_洗，至流出液OD280值到達(dá)基線；用Ni-IDAElution-Buffer(20mMTris-HCl，250mM咪唑，0.15MNaCl，pH8.0)以1ml/min流速洗脫目的蛋白，收集蛋白流出液；剪取處理好適量長度的透析袋，在純水中沖洗，將上述收集的蛋白溶液裝入透析袋中，放入1*PBS（PH7.4）緩沖液中，4℃透析過夜；分步收集洗脫液，檢測純度和含量。分別取3μL未純化包涵體蛋白、3μL變復(fù)性的蛋白和1μL洗脫的純化產(chǎn)物與蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行12％的聚丙烯酰胺凝膠電泳，經(jīng)考馬斯藍(lán)染色后，于凝膠成像系統(tǒng)觀察重組蛋白純化效果，結(jié)果見圖4所示。經(jīng)親和層析法純化后獲得純化的重組蛋白，收集后作為樣品備用。以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對其進(jìn)行限制；盡管參照前述實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，依然可以對前述實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換；而這些修改或替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明所要求保護(hù)的技術(shù)方案的精神和范圍。SEQUENCELISTING<110>中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所<120>一種大菱鲆增食欲素Orexin基因、重組蛋白及其制備方法<130><160>6<170>PatentInversion3.3<210>1<211>170<212>PRT<213>人工序列<400>1MetThrProLeuHisLysLysGlnLysMetMetMetTrpSerHisThr151015AsnLeuGlnArgMetThrProLeuHisLysLysGlnLysMetMetMet202530TrpSerHisThrAsnLeuGlnArgAlaAlaGlyMetAspProSerAsn354045LysLysValLeuValLeuValLeuThrLeuLeuLeuSerGlnLeuThr505560CysAspAlaHisSerLeuSerGluCysCysArgGlnThrSerArgSer65707580CysArgLeuTyrValLeuLeuCysArgSerGlyGlyLysAspThrGly859095GlyThrLeuAlaGlyAspAlaAlaAlaGlyIleLeuThrLeuGlyLys100105110ArgGluGluAspGluHisArgLeuHisSerArgLeuHisGlnLeuLeu115120125GlnValSerArgAsnGlnAlaAlaGlyIleLeuThrMetGlyLysArg130135140ThrGluGluSerAlaGlyGlyArgTyrMetAspTrpMetAlaArgSer145150155160GlyValThrIleThrThrProLeuProVal165170<210>2<211>453<212>DNA<213>人工序列<400>2atgactccccttcacaaaaagcagaagatgatgatgtggtcccacaccaacctccagaga60gctgctgggatggacccgtccaacaagaaagtcctggtgctcgtcttgacgttgctgctg120tcccagctgacctgcgacgctcacagcctgtctgagtgctgcagacaaacgtcccgctcc180tgtcgcctttacgtgttgctgtgtcgctccggcggaaaggacacgggggggacgctcgca240ggagacgccgccgctggcatcctcaccctgggcaagcgggaggaggatgagcatcgcctg300cacagccgactccaccagctcctgcaggtctccaggaaccaggcggccgggatcctgacg360atggggaagaggacagaggagagcgctggagggcggtacatggactggatggctcgatcg420ggggtcaccatcacaacaccccttcctgtgtga453<210>3<211>26<212>DNA<213>人工序列<400>3tgggcaagcgggaggaggatgagyat26<210>4<211>26<212>DNA<213>人工序列<400>4atrctcatcctcctcccgcttgccca26<210>5<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>5ccggaattcatgactccccttcacaaaaag30<210>6<211>31<212>DNA<213>人工序列<400>6ccgctcgagcacaggaaggggtgttgtgatg31當(dāng)前第1頁1 2 3