玉米胚乳特異表達啟動子50kD zein啟動子的克隆及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種玉米胚乳特異表達啟動子50kD?zein啟動子及其克隆方法。本發(fā)明首次分離到一個可在玉米胚乳中特異性表達的啟動子——50kD?zein基因啟動子。該啟動子具有SEQ?ID?NO.1所示的核苷酸序列，或該序列經(jīng)取代、缺失和／或添加一個或幾個核苷酸且同等功能的由其衍生的核苷酸序列。本發(fā)明從克隆玉米胚乳特異表達啟動子50kD?zein啟動子入手，通過對50kD?zein啟動子的功能分析，從實驗水平上驗證了該啟動子適用于啟動目標基因在玉米胚乳中特異性表達，而在其他組織中低表達或不表達。為植物基因工程表達載體構(gòu)建提供了合適的調(diào)控元件，為實驗室其他課題的研究進行提供了新的材料。
【專利說明】玉米胚乳特異表達啟動子50kD zein啟動子的克隆及其應 用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種玉米胚乳特異表達啟動子50kD zein啟動子及其克隆方法。 技術(shù)背景
[0002] 玉米是世界上種植面積、產(chǎn)量、區(qū)域分布方面都占主要地位的糧食作物和飼料來 源。胚乳是玉米主要的貯藏器官，因此分離和鑒定玉米胚乳特異表達的啟動子，對改造玉米 籽粒性狀有重要的價值。
[0003] 啟動子是一段位于基因上游區(qū)的DNA序列，參與下游基因的表達調(diào)控，決定了基 因的轉(zhuǎn)錄起始、轉(zhuǎn)錄效率和時空特異性。一般由核心啟動子和上游的一些作用元件組成，核 心啟動子包括轉(zhuǎn)錄起始位點、TATA-box以及5'UTR序列。上游的作用元件包括CAAT-box 、GC-box，以及一些組成型表達序列。啟動子并不直接控制基因的表達，而是通過與轉(zhuǎn)錄因 子結(jié)合來控制基因的活動。
[0004] 按照啟動子的作用方式和功能可以分為三大類：組成型啟動子、誘導型啟動子以 及組織特異性啟動子。目前組成型啟動子在植物基因工程中應用較為廣泛，但在應用中逐 漸暴露出一些問題，比如說它使外源基因在整個植株中表達，產(chǎn)生大量的外源蛋白質(zhì)或代 謝產(chǎn)物，打破了植株原有的代謝平衡，加重了植株的負擔，影響了植物的形態(tài)和正常的生長 發(fā)育，甚至會導致植株死亡，造成資源不必要的浪費。而且轉(zhuǎn)基因安全問題一直備受關(guān)注， 使用植物自身的啟動子相對而言安全性會好一些。
[0005] 因此，人們正在努力尋找一些植物自身特有的組織特異啟動子，來用于轉(zhuǎn)基因載 體的構(gòu)建。使用組織特異啟動子，可以按照人們的意愿在生物體內(nèi)表達外源基因，使外源基 因更為經(jīng)濟有效地發(fā)揮作用。
[0006] 組織特異性啟動子（tissue-specific promoter)又稱器官特異性啟動子。這類啟 動子只在某些特定的器官或組織部位調(diào)控基因表達，并表現(xiàn)出發(fā)育調(diào)節(jié)的特性。其特點在 于，在植物發(fā)育過程中，能夠在時間和空間上有效地調(diào)控目的基因的表達，使得目的基因的 表達產(chǎn)物在特定的空間區(qū)域積累，按照人們的意愿改進代謝途徑，提高組織中營養(yǎng)物質(zhì)含 量，調(diào)控轉(zhuǎn)基因植物繼代繁殖，利用種子便利地獲得工業(yè)新產(chǎn)品和醫(yī)藥新化合物等。因此， 組織特異性啟動子，已成為轉(zhuǎn)基因研究中最具有發(fā)展前景的外源基因的啟動元件。
[0007] 目前組織特異性啟動子的應用主要在以下幾方面：①改良農(nóng)作物品質(zhì)，提高作 物的抗凍、抗旱、抗鹽能力，防止水果腐爛；②改良花卉品質(zhì)、控制觀賞花卉的顏色；③提 高植物的抗病性、抗蟲性和抗除草劑能力；④開發(fā)生物反應器用于生物制藥；⑤創(chuàng)建雄性 不育系和恢復系；⑥用于植物的分化發(fā)育研究等。
[0008] 種子是主要的營養(yǎng)貯藏器官，具有重要的經(jīng)濟價值。因此，胚乳特異性啟動子作為 一種重要的順式作用元件，具有重要的實踐意義和應用價值，今后在利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)來提 高種子中蛋白質(zhì)含量和制備植物生物反應器等方面，將會有更加廣泛的應用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的之一在于提供一種玉米胚乳中特異表達啟動子50kD zein啟動子。
[0010] 本發(fā)明的目的之二在于提供該啟動子的克隆方法。
[0011] 為了達到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案： 一種玉米胚乳特異表達啟動子50kD zein啟動子，其特征在于該啟動子為下列之一： i) SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列； ii) SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列經(jīng)取代、缺失和/或添加一個或幾個核苷酸且同等 功能的由i)衍生的核苷酸序列。
[0012] 一種載體，其特征在于該載體含有上述的啟動子。
[0013] 一種轉(zhuǎn)基因細胞系，其特征在于該轉(zhuǎn)基因細胞系含有上述啟動子。
[0014] -種克隆上述的玉米胚乳特異表達啟動子50kD zein啟動子的方法，其特征在于 該方法的具體步驟為：在NCBI數(shù)據(jù)庫中找到玉米胚乳特異表達基因50kD zein的ATG上游 序列，截取2018bp的堿基序列，設(shè)計引物，以B73基因組為模板，通過PCR技術(shù)獲得片段，獲 得目的片段2018bp后，通過TA克隆連接載體，所述的引物序列為 ： 正向引物從Y端至:V端為：CAAGAGTAACAAATCCGC; 反向引物從 Y 端至:V 端為：GGTTTTTGGAGTTAGATAATTGATG。
[0015] 本發(fā)明首次提出一個新的能夠在玉米胚乳中特異表達啟動子50kD zein啟動子， 該啟動子適用于啟動目標基因（如GUS基因或GFP基因）在玉米胚乳中的特異性表達。由 于該啟動子的特異性很強，因此為后續(xù)進一步確定胚乳特異表達的瞬時作用元件奠定了基 礎(chǔ)，且為植物基因工程表達載體提供合適的調(diào)控元件，為實驗室其他課題的研究進行提供 新的材料。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0016] 圖1PCR獲得玉米胚乳特異表達基因50kD zein基因的ATG上游2018bp&1036bp 序列片段電泳圖 圖 2PCR 獲得 523bp、431bp、320bp、237bp、108bp 的序列片段 圖3基因槍瞬時轉(zhuǎn)化載體構(gòu)建示意圖 圖4B73玉米授粉后14天的籽?；驑屴Z擊GUS染色結(jié)果 A :35S(正對照）B :B73 負對照 C :50kDzein_2018bp 片段 D :50kDzein_1036bp 片段 E :50kDzein-523bp 片段 F :50kDzein-431bp 片段 G :50kDzein-320bp 片段 圖中的標尺長度代表1_ 圖5農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化載體構(gòu)建示意圖 圖6 PBPA玉米幼胚轉(zhuǎn)化流程圖 A :取胚侵染 B :共培養(yǎng)C :恢復培養(yǎng)D : -輪篩選E :三輪篩選 F :抗性愈 傷 G:暗再生 H:光再生 I:陽性苗入土 圖7PCR檢測結(jié)果電泳圖 A: (bar) 50-1-3, 4, 5; 50-4-9, 10, 11; 50-6-5, 6, 7; 50-8-9, 10, 11，12 B:(⑶S) 50-1-3, 4, 5; 50-4-9, 10, 11; 50-6-5, 6, 7; 50-8-9, 10, 11，12 圖8 部分事件bar探針檢測Southern雜交圖 M ：lkb marker 1 :PBPA基因組DNA 2_6 :5個獨立的轉(zhuǎn)基因事件基因組 圖9植株的葉、根、種皮、胚、胚乳組織GUS染色結(jié)果圖 35S-⑶S的 a :葉b :根c :種皮d :胚e :胚乳 50kD_⑶S的 A :葉B :根C :種皮D :胚E :胚乳 圖中的標尺長度代表1_。

【具體實施方式】
[0017] 下面結(jié)合具體實施事例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體實驗條件的實驗方法，通常按照常 規(guī)條件，如分子克?。∕olecular Cloning:A Laboratory Manual, 3rd ed.)或植物分子生 物學一實驗手冊（Plant Molecular Biology -A Laboratory Manual, Melody S. Clark 編，Springer-verlag Berlin Heidelberg, 1997)中所述條件，或按照制造廠商所建議的 條件。
[0018] 實施例一：獲得啟動子片段 在NCBI數(shù)據(jù)庫中找到玉米胚乳特異表達基因50kD zein的ATG上游序列，截取2018bp 和1036bp的堿基序列，具體序列詳見SEQ ID NO. 1 (序列表中沒有2018bp，請核查)，設(shè)計 引物，以B73基因組為模板，通過PCR技術(shù)獲得片段，參見圖1。擴增片段的引物序列： 2018bp: 正向引物從Y端至:V端為：CAAGAGTAACAAATCCGC; 反向引物從 Y 端至:V 端為：GGTTTTTGGAGTTAGATAATTGATG; 1036bp ： 正向引物從Y端至:V端為：AATTAACCAAGCAGGCAT ; 反向引物從 Y 端至:V 端為：GGTTTTTGGAGTTAGATAATTGATG; 結(jié)果：獲得目的片段2018bp和1036bp后通過TA克隆連接載體，測序比對，與數(shù)據(jù)庫中 提供的序列一致。
[0019] 實施例二：啟動子截短片段的獲得 根據(jù)預測啟動子元件的網(wǎng)站（http://www. softberry. com)的預測結(jié)果，分別截取 523bp、431bp、320bp、237bp、108bp大小的堿基序列，PCR獲得片段，見圖2。擴增片段的引 物序列： 523bp ： 正向引物從Y端至:V端為：CACATGACATTACCTTTA ; 反向引物從 Y 端至:V 端為：GGTTTTTGGAGTTAGATAATTGATG ; 431bp ： 正向引物從5'端至3'端為：GATTCGTCGCGTTTCAAC ; 反向引物從 Y 端至:V 端為：GGTTTTTGGAGTTAGATAATTGATG ; 320bp ： 正向引物從Y端至:V端為：AAGCTTATTATACTTCCT ; 反向引物從 Y 端至:V 端為：GGTTTTTGGAGTTAGATAATTGATG; 237bp ： 正向引物從5'端至3'端為：ACGTAAAGTGAGTGATGA; 反向引物從 Y 端至:V 端為：GGTTTTTGGAGTTAGATAATTGATG; 108bp ： 正向引物從5'端至3'端為：ACTCATGCATCACAAAAC; 反向引物從 Y 端至:V 端為：GGTTTTTGGAGTTAGATAATTGATG; 結(jié)果：分別回收不同大小的目的片段后通過TA克隆連接載體，測序比對，與提供的序 列一致。
[0020] 實施例三：截短片段與⑶S基因連接，打基因槍，驗證啟動子核心元件 用5)^ I + ? I酶點將gusA-NOS片段從PBI121載體上酶切連接到PUC18載體中， 構(gòu)建pUCIS-Gus-nos載體(見圖3)。將克隆到的不同長度的片段回收連接測序驗證正確后， 用油al+Aal酶切，連入pUC18-Gus-nos，構(gòu)建pUC18-50kD zein-GUS載體。將構(gòu)好的載體 轉(zhuǎn)入大腸桿菌T0P10中，抽提質(zhì)粒后打基因槍。
[0021] 選取B73玉米授粉后14天的籽粒為受體材料，用70%酒精消毒剝?nèi)シN皮，放到滲 透培養(yǎng)基上培養(yǎng)6小時?；驑寘?shù)：壓力650,距離3cm，兩槍。轟擊之后25°C暗培養(yǎng)48 小時，⑶S染色（圖4)。
[0022] 結(jié)果：50kDzein-2018bp 片段、1036bp 片段、523bp 片段、431bp 片段、320bp 片段均 有GUS表達，說明截短到302bp片段時啟動子仍有功能。
[0023] 實施例四：根據(jù)截短片段的功能驗證結(jié)果，選取1036bp片段構(gòu)建表達載體，農(nóng)桿 菌轉(zhuǎn)化玉米幼胚 選取PTF102載體作為農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化玉米幼胚的載體。先用Α? I酶切pTF102載體去除 35S-GUS片段，載體自連。將pUC18-50kD zein-GUS載體中的1036bp啟動子片段連接⑶S 的區(qū)段用油al+feo/P I酶切后，連入自連后的pTF102載體，構(gòu)建pTF102-50kDzein-GUS載 體(見圖5)，電擊轉(zhuǎn)化EHA101菌株。
[0024] 選取PBPA玉米品系授粉8-12天的幼胚，大小約1. 5mm左右作為受體材料，進行幼 胚轉(zhuǎn)化，具體流程（圖6):農(nóng)桿菌侵染lOmin-共培養(yǎng)20°C 3天-恢復培養(yǎng)28°C 7天-篩選 培養(yǎng)(雙丙氨磷1.5mg/l)28°C 14天-篩選培養(yǎng)(雙丙氨磷3mg/l)28°C 14天3-5輪-獲 得抗性愈傷組織-暗再生培養(yǎng)28 °C 14-21天-光再生培養(yǎng)28 °C 14-21天-獲得陽性苗-移 入盆中_PCR檢測（圖7) -Southern檢測（圖8)-授粉獲得后代。
[0025] 結(jié)果：選取了約2000個幼胚作為受體材料，經(jīng)過轉(zhuǎn)化篩選后獲得7個抗性愈傷，經(jīng) 過再生后獲得轉(zhuǎn)基因植株，并收獲后代。同時選取部分事件的葉子抽提基因組，通過PCR檢 測及Southern雜交驗證轉(zhuǎn)基因結(jié)果。
[0026] 實施實例五：⑶S染色 選取35S啟動子-GUS基因作為正對照，與轉(zhuǎn)基因植株的葉、根、種皮、胚、胚乳分別進行 ⑶S染色，驗證啟動子的特異性（圖9)。
[0027] 結(jié)果：35S-GUS在玉米植株的葉、根、胚、胚乳均有⑶S基因表達，而50kD-GUS在玉 米植株的葉、根、胚乳組織均沒有⑶S基因表達，胚組織有少量的表達，只有胚乳組織中⑶S 基因高效表達，證明50kD啟動子的特異性很好。
【權(quán)利要求】
1. 一種玉米胚乳特異表達啟動子50kD zein啟動子，其特征在于該啟動子為下列之 i) SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列； ii) SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列經(jīng)取代、缺失和/或添加一個或幾個核苷酸且同等 功能的由i)衍生的核苷酸序列。
2. -種載體，其特征在于該載體含有根據(jù)權(quán)利要求1所述的啟動子。
3. -種轉(zhuǎn)基因細胞系，其特征在于該轉(zhuǎn)基因細胞系含有根據(jù)權(quán)利要求1所述啟動子。
4. 一種克隆根據(jù)權(quán)利要求1所述的玉米胚乳特異表達啟動子50kD zein啟動子的方 法，其特征在于該方法的具體步驟為：在NCBI數(shù)據(jù)庫中找到玉米胚乳特異表達基因50kD zein的ATG上游序列，截取2018bp的堿基序列，設(shè)計引物，以B73基因組為模板，通過PCR 技術(shù)獲得片段，獲得目的片段2018bp后，通過TA克隆連接載體，所述的引物序列為： 正向引物從Y端至:V端為：CAAGAGTAACAAATCCGC ; 反向引物從 Y 端至:V 端為：GGTTTTTGGAGTTAGATAATTGATG。
【文檔編號】C12N15/84GK104140966SQ201410147127
【公開日】2014年11月12日 申請日期:2014年8月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月27日
【發(fā)明者】宋任濤, 馬亞飛, 張婷婷, 楊曦, 王冠, 王珊珊, 祁巍巍, 梅冰, 唐遠平 申請人:上海大學