一株體外高效拮抗稻瘟病菌的水稻內(nèi)生放線菌的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株體外高效拮抗稻瘟病菌的水稻內(nèi)生放線菌Streptomycessp.OsiSh-2，CGMCCNo.8716，該菌具有體外高效拮抗稻瘟病菌能力，能對至少5種不同生理小種的梨孢霉菌有拮抗作用；能夠分泌幾丁質(zhì)酶及纖維素酶；具有較強的生長能力，易于培養(yǎng)。在生物防治水稻稻瘟病、開發(fā)新藥物等方面具有較大的開發(fā)潛力。
【專利說明】一株體外高效拮抗稻瘟病菌的水稻內(nèi)生放線菌

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，具體涉及從水稻中分離獲得一株具有體外高效拮抗稻瘟 病菌能力的水稻內(nèi)生放線菌。

【背景技術(shù)】
[0002] 水稻是世界上最重要的農(nóng)作物之一。包括大多數(shù)發(fā)展中國家在內(nèi)，全世界約40 % 人口的主要食物來自水稻。但是，水稻的高產(chǎn)和穩(wěn)產(chǎn)會受到一些病害的影響，其中以稻瘟病 尤為嚴重。該病在全球85個有水稻種植的國家和地區(qū)均有發(fā)生，每年由于水稻稻瘟病導致 的損失約占總產(chǎn)量的10%?30%。稻癌病由真菌梨孢霉oiTzae)引起，該 病菌能夠侵染水稻的大多數(shù)組織。傳統(tǒng)的稻瘟病控制主要依靠噴灑化學農(nóng)藥和選育新的抗 病品種。由于稻瘟病原菌遺傳復雜、致病多樣和極易變異等特點，新抗病品種需辛苦培育， 且常在推廣數(shù)年內(nèi)失去抗性，這便降低了該方法控制稻瘟病的效果?；瘜W農(nóng)藥是目前抗稻 瘟病的一種有效措施，但是大量和長期使用化學農(nóng)藥，既增加生產(chǎn)成本，也易導致病原菌產(chǎn) 生抗藥性而降低防治效果，同時造成環(huán)境污染和破壞生態(tài)平衡，給人類健康及環(huán)境安全帶 來嚴重隱患。因此，越來越多的科學家希望通過生物農(nóng)藥來控制和解決稻瘟病。
[0003] 內(nèi)生菌是一種能夠在植物體內(nèi)存活而不對寄主植物具有明顯危害的微生物，內(nèi)生 菌制劑可以減少由于田間操作、氣候變化等因素對其生長、繁殖和防治效果的影響，是一種 天然的微生物活體農(nóng)藥。以抗稻瘟病菌的內(nèi)生菌活體作為農(nóng)藥制劑，不僅能以其更安全的 生物代謝物避免化學農(nóng)藥產(chǎn)生的隱患，還可以利用種類豐富的內(nèi)生菌與病原菌之間的拮抗 對應(yīng)關(guān)系，減少稻瘟病病菌多樣、易變異帶來的影響。
[0004] 從水稻中可以分離、篩選出一些具有抑制稻瘟病菌的內(nèi)生菌，這些內(nèi)生菌或是分 泌某些代謝物、或是提高水稻抵抗力來抵抗稻瘟病菌。目前所分離得到的抗病性內(nèi)生菌大 多是易培養(yǎng)的細菌和真菌類群，而作為難分離的內(nèi)生放線菌則報道較少。放線菌又是抗生 素的主要來源，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的抗生素有近6000種，其中4000多種由放線菌產(chǎn)生。作為一 類能產(chǎn)生多種有益代謝產(chǎn)物的微生物，放線菌顯然具有很高的經(jīng)濟價值。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提供了一種具有防治稻瘟病潛力的水稻內(nèi)生放線菌，該菌能對至少5種不 同生理小種的梨孢霉菌(稻瘟病的致病真菌）有拮抗作用，液體培養(yǎng)在第7天時菌液抑制稻 瘟病的能力最強。該菌株分離自健康水稻鞘部，其具有較強的生長能力，易于培養(yǎng)。 發(fā)明所得菌株通過結(jié)合菌落菌體形態(tài)特征和基于細菌16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā) 育分析，鑒定為 屬，命名為 0siSh-2。該菌株已于 2014 年 1月10日由中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC)所保藏(保藏地址 是：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號)，保藏號為CGMCC No. 8716,分類命名為鏈霉菌 OsiSh-2,經(jīng)檢測存活。 OsiSh-2菌株的分離、純化和篩選過程為：將秈稻谷梅4號洗去泥土后進行植物表面消 毒，干燥后置于內(nèi)生菌分離培養(yǎng)基(MS)上，27°C培養(yǎng)，待內(nèi)生放線菌長出，再結(jié)合劃線分離 法在固體PDA平板上進行分離，直至獲得其純培養(yǎng)物。將分離得到的菌株與稻瘟病致病菌 梨孢霉同時接種到PDA固體平板上，放入霉菌培養(yǎng)箱中28°C倒置培養(yǎng)，每天觀察，篩選拮抗 真菌效果最明顯的菌株，即從水稻鞘部分離得到的高效拮抗梨孢霉菌株OsiSh-2。
[0006] 稻瘟病菌的細胞壁主要成分是幾丁質(zhì)和纖維素，用幾丁質(zhì)培養(yǎng)基和纖維素培養(yǎng)基 對該放線菌能否分泌幾丁質(zhì)酶及纖維素酶進行了定性檢測。該放線菌在28°C恒溫培養(yǎng)條件 下能產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶和纖維素酶，表明OsiSh-2可能通過分泌幾丁質(zhì)酶和纖維素酶，溶解殺 死真菌性病害。 本發(fā)明所述菌株的有益效果為：菌株作為健康水稻的內(nèi)生菌，在28°C、PDA培養(yǎng)基培養(yǎng) 條件下能有效抑制稻瘟病病菌的生長；在ISP II液體培養(yǎng)基中，28°C，150r/min液體震蕩培 養(yǎng)條件下培養(yǎng)7天后，取出100 μ L菌液，加入到混合有梨孢霉孢子的PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)， 有明顯的抑制稻瘟病生長的抑菌圈出現(xiàn)；能對至少5種不同生理小種（來自于湖南農(nóng)業(yè)大 學和湖南亞華種子有限公司）的梨孢霉菌有拮抗作用；本菌株具有較強的生長能力，易于培 養(yǎng)；能夠分泌幾丁質(zhì)酶及纖維素酶。該菌的上述特征表明其在生物防治水稻稻瘟病、開發(fā)新 藥物等方面具有較大的開發(fā)潛力。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0007] 圖1 :本發(fā)明菌株的菌落形態(tài)圖，a. OsiSh-2培養(yǎng)5天；b. OsiSh-2生長25天后 菌體變?yōu)楹谏呐囵B(yǎng)圖； 圖2 :本發(fā)明菌株的顯微觀察圖； 圖3 :本發(fā)明菌株的進化樹； 圖4 :本發(fā)明菌株液體培養(yǎng)生長情況圖； 圖5 :本發(fā)明菌株在固體培養(yǎng)基上對稻瘟病菌RB3的抑制情況，a. OsiSh-2培養(yǎng)5天； b. OsiSh-2生長25天后菌體變?yōu)楹谏呐囵B(yǎng)圖； 圖6 :本發(fā)明菌株培養(yǎng)7天的菌液對稻瘟病菌RB3的抑制情況，a. OsiSh-2培養(yǎng)5天； b. OsiSh-2生長25天后菌體變?yōu)楹谏呐囵B(yǎng)圖； 圖7 :本發(fā)明菌株對5種不同生理小種的稻瘟病梨孢霉菌的抑制情況，a. - e.稻瘟病 菌對照；f. - j. 0siSh-2對5種不同生理小種的梨孢霉菌的抑制； 圖8 :本發(fā)明菌株分泌幾丁質(zhì)酶的定性實驗，a. OsiSh-2分泌幾丁質(zhì)酶的定性實驗結(jié) 果；b.空白對照； 圖9 :本發(fā)明菌株分泌纖維素酶的定性實驗，a. OsiSh-2分泌纖維素酶的定性實驗結(jié) 果；b.空白對照；

【具體實施方式】： 實施例1 :0siSh-2菌株的分離 OsiSh-2菌株的分離、純化和篩選過程為：將秈稻谷梅4號洗去泥土后進行植物表面消 毒，干燥后，按照根、莖、葉鞘、葉片四種組織分割，每種組織都切割為lcm左右的小段，置于 內(nèi)生菌分離培養(yǎng)基(MS)上，27°C培養(yǎng)，待內(nèi)生放線菌長出，再結(jié)合劃線分離法在固體PDA平 板上進行分離，直至獲得其純培養(yǎng)物。將分離得到的菌株與稻瘟病致病菌梨孢霉同時接種 到PDA固體平板上，放入霉菌培養(yǎng)箱中28°C倒置培養(yǎng)，每天觀察，篩選拮抗真菌效果最明顯 的菌株，分離得到來自水稻葉鞘組織的高效拮抗梨孢霉菌株〇siSh-2。用幾丁質(zhì)培養(yǎng)基和纖 維素培養(yǎng)基對該放線菌能否分泌幾丁質(zhì)酶及纖維素酶進行了定性檢測。該放線菌在28°C恒 溫培養(yǎng)條件下能產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶和纖維素酶，表明OsiSh-2可以通過分泌幾丁質(zhì)酶和纖維素 酶，溶解殺死真菌性病害。 所用MS培養(yǎng)基組成為：大豆粉20g，甘露醇20g，瓊脂粉20g，蒸餾水定容至1L，調(diào)節(jié)PH 值范圍7. 2±0. 2,121°C高溫高壓滅菌25分鐘。PDA培養(yǎng)基組成為：土豆200g，煮沸30min 后4層紗布過濾，濾液中加入10g葡萄糖，瓊脂15g，蒸餾水定容至1L，自然PH，121°C高溫 高壓滅菌25分鐘。ISP II液體培養(yǎng)基組成為：麥芽浸粉10g，酵母浸粉4g，葡萄糖4g，瓊脂 18g，蒸餾水定容至1L，調(diào)節(jié)PH值范圍7. 2±0. 2，121°C高溫高壓滅菌25分鐘。幾丁質(zhì)培養(yǎng) 基組成為：膠狀幾丁質(zhì)4. 5g，硫酸銨3g，七水合硫酸鎂0. 3g，磷酸二氫鉀2g，檸檬酸一水合 物lg，吐溫80 200 μ L，溴甲酚紫0· 15g，瓊脂15g，蒸餾水定容至1L，調(diào)節(jié)PH值到4. 7,121°C 高溫高壓滅菌15分鐘。纖維素培養(yǎng)基：羧甲基纖維素鈉20g，磷酸氫二鈉2. 5g，磷酸二氫 鉀1. 5g，蛋白胨2. 5g，酵母浸粉0. 5g，瓊脂15g，蒸餾水定容至1L，調(diào)節(jié)PH值到7. 0,121°C 高溫高壓滅菌15分鐘。
[0008] 實施例2 :菌株的生物學鑒定 1.菌株形態(tài)特征 (1) 菌落形態(tài)特征：將單菌落劃線接種至PDA固體培養(yǎng)基中，將平板倒置于恒溫培養(yǎng) 箱，28°C培養(yǎng)，3天以內(nèi)長出無色基生菌絲和氣生菌絲，菌落表面褶皺、邊緣緊致。3天后長 出白色孢子覆蓋在菌落上。20天后菌體逐漸變?yōu)楹谏?，見附圖1。 (2) 菌體形態(tài)特征：用插片法培養(yǎng)該菌，在光學顯微鏡下觀察其氣生菌絲分枝情況，見 附圖2。 2.菌株16S rRNA分析 研磨菌體并用玻璃砂劇烈震蕩后，采用革蘭氏陽性菌基因組DNA提取試劑盒 (Shanghai Generay Biotech Co·, Ltd)的方法，抽提菌株基因組DNA，以該DNA為模板，米 用放線菌16S rRNA基因引物（27F-765R及704F-1492R)，擴增出菌株的16S rRNA片段并 測序，將得到的16S rRNA序列與NCBI中的核酸數(shù)據(jù)庫進行Blast同源性比對（www. ncbi. nlm. nih. gov/Blast)，與數(shù)據(jù)庫中已知放線菌 的 16S rRNA 全長序列的相似性達到了 99%，V4、V5可變區(qū)的序列相似性達到100%，將該菌株鑒定為 5^/'<9/7(〇?/^<951屬，命名為5^/'(9/7(〇?/^(9>58。.08丨311-2。使用軟件]\0^^5.0中的鄰近結(jié)合法 (neighbor-joining method)制作 0siSh-2 的系統(tǒng)發(fā)育樹，見附圖 3。 實施例3 :菌株在ISP II液體培養(yǎng)基中的生長情況 采用放線菌稱干重法繪制生長情況圖。將所得菌株接種到裝有50mL的ISP II液體培養(yǎng) 基的250mL規(guī)格錐形瓶中，在28°C，150r/min條件下振蕩培養(yǎng)，每天取樣20mL，平行取3次， 4000rpm離心30min以去掉上清液，烘干過夜稱取菌體干重。共測量7天，其結(jié)果見附圖4。
[0009] 實施例4 :菌株對稻瘟病的抑制情況結(jié)果 (1)固體拮抗實驗：在直徑為90mm的培養(yǎng)皿中心接種梨孢霉菌RB3 (來自湖南亞華種 子有限公司），刮取活化好的OsiSh-2菌在距離真菌30mm的位置上劃一條線。封口膜封好 培養(yǎng)皿，28°C倒置培養(yǎng)7天以上，最后以生長出來的真菌與放線菌之間的距離遠近判斷該 菌的拮抗能力強弱，結(jié)果見附圖5。拮抗其他4種梨孢霉菌生理小種61、62、307、02(來自 于湖南農(nóng)業(yè)大學和湖南亞華種子有限公司）見附圖7。 (2)液體拮抗實驗：將菌株接種到裝有50mL ISP II液體培養(yǎng)基的250mL規(guī)格錐形瓶 中，28°C、150r/min條件下震蕩培養(yǎng)，每天取出lOOyL菌液，注入置于混合有梨孢霉孢子 的PDA培養(yǎng)基上的牛津杯中，28°C培養(yǎng)7天以上，觀察抑制稻瘟病生長的抑菌圈大小，結(jié)果 見附圖6,可見第7天菌液的抑菌圈所占面積約為梨孢霉培養(yǎng)總面積的78%。
[0010] 實施例5 :分泌幾丁質(zhì)酶及纖維素酶的定性實驗 (1)幾丁質(zhì)酶定性實驗：用滅菌接種環(huán)挑取OsiSh-2菌塊置于幾丁質(zhì)培養(yǎng)基中央，于28 °〇恒溫培養(yǎng)7天后開始觀察培養(yǎng)基顏色變化情況?？瞻讕锥≠|(zhì)培養(yǎng)基為黃色，OsiSh-2產(chǎn) 生的幾丁質(zhì)酶使培養(yǎng)基變?yōu)樽仙姼綀D8,表1。
[0011] (2)纖維素酶定性實驗：使用剛果紅染色法。將OsiSh-2挑取置于纖維素培養(yǎng)基 中央，培養(yǎng)觀察7到15天。培養(yǎng)基經(jīng)剛果紅染色后呈紅色，當培養(yǎng)基中的羧甲基纖維素被 OsiSh-2所產(chǎn)生的纖維素酶分解后，培養(yǎng)基中出現(xiàn)以O(shè)siSh-2菌為中心的白色透明圈，見附 圖9,表1。
[0012] 表1菌OsiSh-2的水解酶產(chǎn)生情況

【權(quán)利要求】
1. 一株體外高效拮抗稻瘟病菌的水稻內(nèi)生放線菌，所述水稻內(nèi)生放線菌為 5^/'<9/^〇?/^<9518卩.〇8丨311-2，保藏號為〇6]\0^1^〇.8716。
2. 如權(quán)利要求1所述的水稻內(nèi)生放線菌在防治水稻稻瘟病上的應(yīng)用。
3. 如權(quán)利要求1所述水稻內(nèi)生放線菌的培養(yǎng)方法，其特征在于：將所述菌株接種到裝 ISP II液體培養(yǎng)基中，于28°C，150r/min條件下振蕩培養(yǎng)。
【文檔編號】C12N1/20GK104195064SQ201410278588
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年6月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月20日
【發(fā)明者】朱詠華, 劉選明, 楊曉璐, 廖紅東, 袁珊珊, 徐婷, 曾夏東, 王真真 申請人:湖南大學