一種利用擴(kuò)增dna片段長(zhǎng)度多態(tài)性測(cè)定短鏈rna的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種利用擴(kuò)增DNA片段長(zhǎng)度多態(tài)性測(cè)定短鏈RNA的方法，屬于分子生物【技術(shù)領(lǐng)域】，包括以下步驟：首先利用至少兩種與待測(cè)短鏈RNA相比無(wú)天然同源序列的合成小RNA作為測(cè)定的內(nèi)標(biāo)，將這些合成小RNA以不同分子數(shù)混合，形成動(dòng)態(tài)小RNA標(biāo)準(zhǔn)分子梯度；再以等量的所述動(dòng)態(tài)小RNA標(biāo)準(zhǔn)與所述待測(cè)短鏈RNA混合，經(jīng)由RNA反轉(zhuǎn)錄、cDNA加尾、PCR同步擴(kuò)增及PCR產(chǎn)物DNA長(zhǎng)度多態(tài)性片段的熒光定量分析，測(cè)得所述待測(cè)短鏈RNA擴(kuò)增產(chǎn)生的DNA片段熒光強(qiáng)度在所述動(dòng)態(tài)小RNA標(biāo)準(zhǔn)熒光強(qiáng)度梯度上的相對(duì)比例，本方法可以實(shí)現(xiàn)對(duì)短鏈RNA尤其是miRNA的絕對(duì)定量，且具有高特異性、高靈敏度、結(jié)果客觀、重復(fù)性好，可在100-106拷貝數(shù)范圍內(nèi)準(zhǔn)確定量，也適用于RNA粗提物。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種利用擴(kuò)增DNA片段長(zhǎng)度多態(tài)性測(cè)定短鏈RNA的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種用擴(kuò)增DNA片段長(zhǎng)度多態(tài)性定量測(cè) 定短鏈RNA的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] microRNA (即miRNA)是一類(lèi)調(diào)控基因表達(dá)的短單鏈小分子核糖核酸，由22個(gè) 左右核苷酸（nt)組成。miRNA參與細(xì)胞的各種活動(dòng)，影響并參與維持細(xì)胞的生理和分化狀 態(tài)，特定miRNA表達(dá)量的變化還能反映生物的生理、病理特征，預(yù)示其作為鑒定多種疾病的 生物標(biāo)記的可能性。例如肝細(xì)胞所特有的miR-122,在血液中的水平變化就可以揭示肝臟受 損的情形。miR-122為肝臟細(xì)胞所獨(dú)有，并在每個(gè)人類(lèi)肝細(xì)胞中有13萬(wàn)個(gè)，具有目前用于 肝損傷鑒定的生物標(biāo)記物所欠缺的專(zhuān)一性及靈敏度。盡管miRNA在這些病變中所起的作用 還有待明確，機(jī)制有待進(jìn)一步的揭示，但這已成為目前miRNA研究的一個(gè)最重要的方向。其 中miRNA定量檢測(cè)方法的客觀性、靈敏度及標(biāo)準(zhǔn)化是將miRNA研究成果推向臨床疾病診斷 應(yīng)用的瓶頸和關(guān)鍵。
[0003] 已知人類(lèi)擁有大約1千種以上的miRNA，與各種特定生理病理現(xiàn)象相關(guān)的miRNA表 達(dá)量的動(dòng)態(tài)范圍很大，從個(gè)位數(shù)級(jí)別到上萬(wàn)，加上miRNA擁有超短的長(zhǎng)度、相似的序列、二 級(jí)構(gòu)象、末端修飾及長(zhǎng)度差異性等特性，給miRNA的純化和準(zhǔn)確定量帶來(lái)很大的挑戰(zhàn)。
[0004] 目前應(yīng)用較多的對(duì)miRNA進(jìn)行定量測(cè)定的主流技術(shù)包括定量反轉(zhuǎn)錄PCR (RT-qPCR)及同時(shí)測(cè)定多種miRNA的能力的miRNA深度測(cè)序法（miR-seq)和microArray 雜交測(cè)定法等。其它也有很多基于RNA/DNA雜交技術(shù)的高通量技術(shù)平臺(tái)，如NanoString nCounter、nanopore技術(shù)，但受制于這些方法本身的不完善，缺乏應(yīng)有的靈敏度和準(zhǔn)確性， 距離實(shí)際應(yīng)用尚需時(shí)日。
[0005] 上述miRNA測(cè)定方法實(shí)際應(yīng)用的主要問(wèn)題是靈敏度，如其中最靈敏的NanoString nCounter法的測(cè)定低限為1 amol即約6xl05個(gè)分子以上的水平，而miR-seq和microArray 的測(cè)定低限為〇. 1 fmol即6xl07個(gè)分子以上的水平，顯然不滿(mǎn)足大多數(shù)分子診斷的需求。
[0006] 其中miR-seq法，對(duì)miRNA的鑒定不依賴(lài)于miRNA序列，可以對(duì)miRNA新種的發(fā)現(xiàn) 有不可替代的作用。而且其能統(tǒng)計(jì)出miRNA的相對(duì)讀數(shù)，而有很多研究中利用它作了很多 病理診斷應(yīng)用方面的探索，發(fā)現(xiàn)了很多有益的苗頭。但是，miR-seq的樣品處理需要利用RNA Ligase、DNA Ligase制備適用的cDNA庫(kù)，并經(jīng)PCR擴(kuò)增后才能上機(jī)檢出，作到相對(duì)定量。冗 長(zhǎng)的樣本制備過(guò)程及多種修飾酶的利用，破壞了待測(cè)目標(biāo)數(shù)量與檢測(cè)讀值的線(xiàn)性相關(guān)性， 影響miRNA測(cè)定的客觀性。因此，如果沒(méi)有更好的制備方法，miR-seq還不能作為miRNA定 量測(cè)定的方法。
[0007] 反轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光PCR定量技術(shù)（RT-qPCR)是現(xiàn)代分子生物診斷方法中對(duì)RNA檢出 最靈敏、最客觀可靠的方法，而且方法快捷，不需要特殊的設(shè)備。傳統(tǒng)的RT-qPCR測(cè)定對(duì)象 是長(zhǎng)鏈的RNA，如mRNA，所用primers長(zhǎng)度通常在20nt以上。但是，成熟miRNA的總長(zhǎng)度才 22nt左右，測(cè)定miRNA的RT-qPCR必須經(jīng)過(guò)特殊的修飾，使之能適合qPCR。除莖環(huán)引物可 作miRNA的RT以外，鎖核苷酸引物（LNA)及多聚A聚合酶加尾-寡聚dT引發(fā)的RT也被應(yīng) 用于miRNA的定量測(cè)定。以利用TaqMan探針、莖環(huán)引物的反轉(zhuǎn)錄-qPCR方法為代表的實(shí) 時(shí)熒光PCR定量法具備有測(cè)定單拷貝miRNA分子的能力，已經(jīng)廣泛的用于miRNA的機(jī)制研 究、疾病診斷、治療預(yù)后等的研究中。因其是所有方法中最靈敏、客觀、容易應(yīng)用，是驗(yàn)證從 microArray、miR-seq方法獲得的miRNA表達(dá)譜的優(yōu)選方法。盡管不斷的技術(shù)改進(jìn)和對(duì)工 藝的強(qiáng)化不斷地催生新的miRNA qPCR檢測(cè)方法，但是，至少有兩大障礙阻止了這些技術(shù)在 臨床應(yīng)用中的接受度：方法質(zhì)量的評(píng)估及方法的標(biāo)準(zhǔn)化。這兩個(gè)障礙嚴(yán)重影響到方法結(jié)果 在不同批次、操作人員及實(shí)驗(yàn)室之間的重復(fù)性，即測(cè)定結(jié)果存在不一致不穩(wěn)定的缺點(diǎn)。
[0008] 對(duì)液態(tài)的生物標(biāo)本而言，miRNA拷貝數(shù)的絕對(duì)定量分析可以揭示miRNA在一定體 積中的數(shù)量，是一種更容易理解和符合自然的單位，尤其適合液體樣本?？截悢?shù)的絕對(duì)定 量分析有助于更準(zhǔn)確地理解miRNA與疾病之間的關(guān)系，更能精細(xì)的揭示病變程度及預(yù)后。 Bissel等用10倍稀釋的合成miRNA等摩爾混合物作模板，利用microArray雜交測(cè)定法 做出miRNA拷貝數(shù)的效正曲線(xiàn)，做到了對(duì)miRNA的絕對(duì)定量。并實(shí)際測(cè)定大鼠肝臟RNA中 miR-122的含量為每10pg約53000個(gè)拷貝。很遺憾的是該法的最低測(cè)定的限度為1 amol， 也即6xl05拷貝，不能滿(mǎn)足臨床診斷的實(shí)際需求。實(shí)際上，因?yàn)椴煌琺icroArray平臺(tái)技術(shù) 的原理均以DNA/RNA雜交來(lái)實(shí)現(xiàn)的，雜交信號(hào)沒(méi)有擴(kuò)增，受雜交的熱力學(xué)平衡的制約，在滿(mǎn) 足測(cè)定的專(zhuān)一性的前提下，方法靈敏度很難突破amol的低限。另外一個(gè)可能帶來(lái)差異的因 素是miRNA的標(biāo)記反應(yīng)受miRNA的末端序列、二級(jí)構(gòu)象及所用的標(biāo)記方法所限，很難做到等 比例地標(biāo)記所有種類(lèi)的miRNA，對(duì)不同miRNA的測(cè)定帶來(lái)歧視性偏差。
[0009] 實(shí)用的miRNA定量測(cè)定方法必須能作到靈敏、準(zhǔn)確和可標(biāo)準(zhǔn)化。臨床樣品具多樣 性，及成分的不確定性。一個(gè)簡(jiǎn)單的例子是來(lái)自不同個(gè)體的血清所含的成分對(duì)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 及PCR反應(yīng)可能沒(méi)有作用、抑制或促進(jìn)?，F(xiàn)行的miR-seq、RT-qPCR法及microArray法用到 RNA ligase、Reverse Transcriptase及Taq polymerase對(duì)RNA樣品的雜質(zhì)很敏感，加上這 些技術(shù)設(shè)計(jì)原理是試圖直接得到樣品中待測(cè)目標(biāo)的數(shù)量，而這種測(cè)定方式靜態(tài)地假定純化 RNA為測(cè)定對(duì)象，沒(méi)有設(shè)計(jì)抗衡RNA樣品中不純物影響的機(jī)制，使其所得的結(jié)果受樣品來(lái)源 影響而呈現(xiàn)隨機(jī)性，增加了其標(biāo)準(zhǔn)化的難度。因而從嚴(yán)格意義上來(lái)說(shuō)，絕對(duì)定量是不可能用 現(xiàn)有測(cè)定方法來(lái)實(shí)現(xiàn)的。對(duì)于血液等生物樣本來(lái)講，從不同個(gè)體血清純化出的RNA中所含 的雜質(zhì)對(duì)RT反應(yīng)及PCR擴(kuò)增效率具有抑制甚或促進(jìn)的作用，加大了使用傳統(tǒng)RT-qPCR方法 進(jìn)行定量測(cè)定的難度。另外樣本的處理和純化，一般采用鹽酸胍苯酚等蛋白質(zhì)變性劑抽提 方法得到純度很高的RNA，但由于miRNA的平均大小僅為22nt，需要高濃度乙醇長(zhǎng)時(shí)間沉淀 以避免丟失，使純度和產(chǎn)率這對(duì)矛盾更加突出，而用親和樹(shù)脂柱的純化方法一般能保證RNA 的純度但尚需證明純化后RNA的完整性，即miRNA的丟失和選擇性丟失的問(wèn)題。從病人獲 得的病理標(biāo)本通常是少量而不可重復(fù)的，因此，這些問(wèn)題一直困擾著將miRNA定量檢測(cè)技 術(shù)推向臨床應(yīng)用的努力。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明的發(fā)明目的在于：針對(duì)上述存在的問(wèn)題，提供一種改善短鏈RNA定量測(cè)定 的靈敏度、準(zhǔn)確度和標(biāo)準(zhǔn)化的新方法。
[0011] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是這樣的：一種利用擴(kuò)增DNA片段長(zhǎng)度多態(tài)性定量測(cè)定 miRNA的方法，包括以下步驟： 首先利用至少兩種與待測(cè)短鏈RNA相比無(wú)天然同源序列的合成小RNA作為測(cè)定的內(nèi) 標(biāo)，將這些作為內(nèi)標(biāo)的所述合成小RNA以不同分子數(shù)混合，形成動(dòng)態(tài)小RNA標(biāo)準(zhǔn)分子梯度； 再以等量的所述動(dòng)態(tài)小RNA標(biāo)準(zhǔn)與所述待測(cè)短鏈RNA混合，經(jīng)由RNA反轉(zhuǎn)錄、cDNA加 尾、PCR同步擴(kuò)增及PCR產(chǎn)物DNA長(zhǎng)度多態(tài)性片段的熒光定量分析，測(cè)得所述待測(cè)短鏈RNA 擴(kuò)增產(chǎn)生的DNA片段熒光強(qiáng)度在所述動(dòng)態(tài)小RNA標(biāo)準(zhǔn)熒光強(qiáng)度梯度上的相對(duì)比例，從而實(shí) 現(xiàn)所述待測(cè)短鏈RNA的相對(duì)定量。
[0012] 在本發(fā)明中，首先在樣品中加入不同分子數(shù)目作為動(dòng)態(tài)小RNA標(biāo)準(zhǔn)的合成小RNA 與待測(cè)短鏈RNA混合，同一反應(yīng)中進(jìn)行同步檢測(cè)，由同步測(cè)得的分子標(biāo)準(zhǔn)量為動(dòng)態(tài)定量的 標(biāo)準(zhǔn)尺度，獲得待測(cè)短鏈RNA的相對(duì)峰值。為了不與樣品中的待測(cè)短鏈RNA的序列相混，所 以作為內(nèi)標(biāo)的合成小RNA要求與待測(cè)短鏈RNA無(wú)天然同源序列。雜質(zhì)或影響反應(yīng)的因素對(duì) 樣品中的待測(cè)短鏈RNA及動(dòng)態(tài)小RNA標(biāo)準(zhǔn)分子均有相同程度的影響，這種設(shè)計(jì)思路明顯地 區(qū)別于現(xiàn)行的方法，使本發(fā)明的方法擁有足夠的靈敏度和準(zhǔn)確性的同時(shí)，兼具有對(duì)樣品不 純成分的一定包容能力，有益于不同操作人員及實(shí)驗(yàn)室之間不同樣品測(cè)定結(jié)果的比較，容 易實(shí)施標(biāo)準(zhǔn)化。從而可以抗衡RNA尤其是短鏈RNA純化、樣本質(zhì)量及儀器、操作、耗材等外 在因素對(duì)RNA尤其是短鏈RNA測(cè)定結(jié)果的影響。
[0013] 作為優(yōu)選的技術(shù)方案，測(cè)得所述待測(cè)短鏈RNA在所述動(dòng)態(tài)小RNA標(biāo)準(zhǔn)梯度上的相 對(duì)強(qiáng)度比例后，再以待測(cè)短鏈RNA序列為模板合成的短鏈RNA參照物，該短鏈RNA參照物的 序列與待測(cè)短鏈RNA的序列相同，其不同分子數(shù)量，在上述動(dòng)態(tài)小RNA標(biāo)準(zhǔn)為梯度上的相對(duì) 比例而獲得的分子數(shù)目-相對(duì)強(qiáng)度校正曲線(xiàn)，利用所述待測(cè)短鏈RNA相對(duì)強(qiáng)度比例通過(guò)所 述校正曲線(xiàn)，計(jì)算出樣品中待測(cè)短鏈RNA的絕對(duì)分子數(shù)量。
[0014] 對(duì)比用已知數(shù)量的合成目標(biāo)RNA與相同小分子RNA標(biāo)準(zhǔn)的相對(duì)測(cè)定值作出的校正 曲線(xiàn)而得到確定的待測(cè)RNA的絕對(duì)數(shù)目，從而可以獲得待測(cè)RNA的絕對(duì)定量結(jié)果。
[0015] 作為優(yōu)選的技術(shù)方案，所述待測(cè)短鏈RNA為miRNA或siRNA。
[0016] 本發(fā)明的方法可用于對(duì)各種生物樣本或純化RNA中miRNA、siRNA及RNA的種類(lèi) (定性）及含量(定量）的測(cè)定，siRNA具有與miRNA -樣的物理、化學(xué)特性，上述的方法同樣 適用于siRNA的定性定量測(cè)定。本發(fā)明也適用于鑒定RNA中的一段或幾段較小的序列，從 而達(dá)到各種不同RNA的定性、定量測(cè)定的目的，尤其適合于miRNA這類(lèi)短鏈RNA。
[0017] 越來(lái)越多的研究已經(jīng)揭示miRNA及小RNA表達(dá)水平變異對(duì)疾病的診斷及預(yù)后的聯(lián) 系，從病人獲得的病理標(biāo)本通常是少量而不可重復(fù)的，miRNA及小RNA的純化方法還不能滿(mǎn) 足現(xiàn)行鑒定方法的需求，本發(fā)明可利用抵消miRNA樣本中不純物的影響而對(duì)待測(cè)miRNA進(jìn) 行精確定量，可以滿(mǎn)足通過(guò)對(duì)miRNA的相對(duì)或絕對(duì)定量測(cè)定達(dá)到臨床診斷、預(yù)后、刑偵等的 需求。miRNA指紋譜（miRNA signature)是幾個(gè)到幾十個(gè)與某生命現(xiàn)象相關(guān)的miRNA在特 定樣本中的表達(dá)水平，其改變規(guī)律可揭示相關(guān)的生理或病理變化。本發(fā)明的實(shí)施，可以在一 個(gè)或幾個(gè)反應(yīng)里，方便、快速、靈敏和準(zhǔn)確地鑒定miRNA指紋譜，有助于miRNA指紋譜的研究 和在臨床診斷中的應(yīng)用。
[0018] 本發(fā)明設(shè)計(jì)了通過(guò)DNA片段長(zhǎng)度多態(tài)性熒光相對(duì)定量分析來(lái)完成RNA尤其是 miRNA 的分子數(shù)絕對(duì)定量檢測(cè)的方法（miRNA-derived Fragment Length Polymorphism Assay，本發(fā)明中稱(chēng)為miRFLP定量分析法)。miRFLP定量分析法利用3種無(wú)天然同源序列的 合成小RNA作為測(cè)定的內(nèi)標(biāo)，將這三種內(nèi)標(biāo)小RNA以不同分子數(shù)混合，形成動(dòng)態(tài)小RNA標(biāo)準(zhǔn) 分子梯度，再以等量的動(dòng)態(tài)小RNA標(biāo)準(zhǔn)與待測(cè)短鏈RNA混合，經(jīng)由RNA反轉(zhuǎn)錄、cDNA加尾、 PCR同步擴(kuò)增及PCR產(chǎn)物的熒光片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析等四個(gè)步驟測(cè)得待測(cè)短鏈RNA產(chǎn)生的 DNA片段熒光強(qiáng)度在動(dòng)態(tài)小RNA標(biāo)準(zhǔn)熒光梯度上的相對(duì)比例。用合成的待測(cè)短鏈RNA參照 物分子數(shù)與其測(cè)得的熒光相對(duì)強(qiáng)度即可繪出短鏈RNA絕對(duì)數(shù)量的換算曲線(xiàn)，由此計(jì)算出待 測(cè)短鏈RNA的絕對(duì)含量。
[0019] 作為優(yōu)選的技術(shù)方案，所述RNA反轉(zhuǎn)錄過(guò)程中，所采用的引物為歐米茄引物。
[0020] 本發(fā)明所述的歐米茄引物，尤其指申請(qǐng)?zhí)枮镻CT/CN2013/070525的PCT專(zhuān)利申請(qǐng) 中所公開(kāi)的歐米茄引物。歐米茄引物作為本發(fā)明miRFLP定量分析反應(yīng)的引物探針。歐米 伽引物含有一個(gè)極穩(wěn)定的二級(jí)莖環(huán)結(jié)構(gòu)，可避免引物二聚體的形成，提高末端引發(fā)精確度， 且將引物有效地分隔為探針區(qū)及編碼區(qū)。通過(guò)加減編碼區(qū)的堿基數(shù)目就可以方便地對(duì)不同 引物進(jìn)行長(zhǎng)度編碼，并可在同一反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中將多種miRNA轉(zhuǎn)換為長(zhǎng)度不一的cDNA片段， 經(jīng)PCR同步擴(kuò)增進(jìn)行熒光片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析，解決了單一反應(yīng)中檢測(cè)多種miRNA的關(guān)鍵 技術(shù)問(wèn)題。
[0021] miRFLP反應(yīng)由miRNA反轉(zhuǎn)錄、cDNA加尾、PCR同步擴(kuò)增及PCR產(chǎn)物的熒光片段 長(zhǎng)度多態(tài)性分析等四個(gè)步驟組成，見(jiàn)圖1。反應(yīng)的第一步是將miRNA和歐米伽引物混合雜 交，miRNA與互補(bǔ)的探針形成配對(duì)，然后用反轉(zhuǎn)錄酶以未配對(duì)的miRNA 3'末端為模板合成 cDNA。除去RNA后，新合成的cDNA與含有共同PCR靶位的3'寡居核苷酸引物雜交并用DNA 聚合酶以cDNA的3'末端為起始補(bǔ)齊DNA配對(duì)后的單鏈缺口。經(jīng)此組合后，正確裝配的cDNA 擁有相同的5'及3'末端序列，可經(jīng)一對(duì)熒光PCR引物進(jìn)行同步等比擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)毛 細(xì)管凝膠電泳分離后測(cè)定不同長(zhǎng)度PCR片段的熒光強(qiáng)度，完成miRFLP分析圖譜。
[0022] 作為優(yōu)選的技術(shù)方案，所述RNA反轉(zhuǎn)錄過(guò)程中，所采用的引物為莖環(huán)引物。
[0023] 作為進(jìn)一步優(yōu)選的技術(shù)方案，所述莖環(huán)引物為經(jīng)過(guò)長(zhǎng)度編碼的莖環(huán)引物。
[0024] 作為更進(jìn)一步優(yōu)選的技術(shù)方案，所述長(zhǎng)度編碼的方法為：在所述莖環(huán)引物的PCR 靶位點(diǎn)與探針序列之間加上不同堿基數(shù)目，并調(diào)整引物5'端的堿基序列使之維持莖環(huán)的二 級(jí)結(jié)構(gòu)不變。
[0025] 莖環(huán)結(jié)構(gòu)的引物探針（Applied Biosystems, Inc,如PCT/CN2013/070525所提及 的）將多個(gè)小RNA同時(shí)定量地轉(zhuǎn)換為cDNA，經(jīng)與上述miRFLP反應(yīng)路徑相似的cDNA產(chǎn)物加 尾、反應(yīng)后經(jīng)PCR同步擴(kuò)增進(jìn)行熒光片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，只要加上長(zhǎng)度可 變的編碼區(qū)，莖環(huán)引物也可用于本發(fā)明的設(shè)計(jì)規(guī)劃的實(shí)施，并在測(cè)定有限數(shù)目的miRNA目 標(biāo)時(shí)，可以與歐米伽引物互換或同時(shí)使用。
[0026] 作為優(yōu)選的技術(shù)方案，所述校正曲線(xiàn)符合對(duì)數(shù)回歸的方式，表述為：aXb，其中a、b 為常數(shù)項(xiàng)，經(jīng)對(duì)不同分子數(shù)目的所述合成小RNA的實(shí)際測(cè)定值而確定。
[0027] 作為優(yōu)選的技術(shù)方案，所述與待測(cè)短鏈RNA相比無(wú)天然同源序列的合成小RNA的 種數(shù)為三種。由于熒光強(qiáng)度和熒光物質(zhì)的數(shù)量不是線(xiàn)性的關(guān)系，需要至少3種來(lái)確定一元 二次方程的回歸，而采用三種合成小RNA，既可以達(dá)到定量測(cè)定的要求，同時(shí)檢測(cè)過(guò)程也較 經(jīng)濟(jì)。
[0028] miRFLP定量分析法中的每一步中間產(chǎn)物的實(shí)現(xiàn)和信號(hào)的擴(kuò)增都是以線(xiàn)性或接近 線(xiàn)性定量的方式進(jìn)行的，因此擴(kuò)增后DNA片段的熒光強(qiáng)度與目標(biāo)miRNA的分子數(shù)成線(xiàn)性定 量的關(guān)系。但受DNA分析儀熒光探頭的線(xiàn)性定量范圍的客觀限制，儀器探頭的熒光強(qiáng)度與 熒光物質(zhì)的數(shù)量間的響應(yīng)曲線(xiàn)適用于實(shí)測(cè)得到的待測(cè)目標(biāo)的熒光強(qiáng)度與其分子數(shù)之間的 換算。為確定儀器探頭的響應(yīng)曲線(xiàn)，我們選擇了一份具有多個(gè)雜峰片段的PCR產(chǎn)物，經(jīng)系列 稀釋后將樣品用ABI 3730x1型DNA分析儀進(jìn)行熒光定量分析，分析確定了稀釋倍數(shù)與實(shí)測(cè) 的熒光強(qiáng)度的相關(guān)性在25 - 25000 FU的測(cè)定范圍內(nèi)均符合一元二次方程的回歸關(guān)系，R2平 均值大于〇. 9999。本方法中所用的動(dòng)態(tài)miRNA標(biāo)準(zhǔn)和樣本目標(biāo)熒光信號(hào)的擴(kuò)增是以接近線(xiàn) 性的定量方式同步進(jìn)行的，一元二次回歸方程適用于待測(cè)miRNA對(duì)動(dòng)態(tài)miRNA標(biāo)準(zhǔn)的相對(duì) 熒光強(qiáng)度的計(jì)算?，F(xiàn)代的DNA測(cè)序儀具有極高的敏感度和動(dòng)態(tài)探測(cè)范圍（ABI 3730DNA分 析儀：5-31000 FU)。不同廠家或不同型號(hào)的DNA熒光定量分析儀均可采用上述方法對(duì)適用 的突光響應(yīng)曲線(xiàn)及范圍進(jìn)行標(biāo)定，遴選出最適合亦即最精確的回歸方式。
[0029] 由于各種外在因素對(duì)測(cè)定方法的影響，所測(cè)得的miRNA值還不是miRNA的絕對(duì)分 子數(shù)目，而是待測(cè)miRNA在動(dòng)態(tài)miRNA標(biāo)準(zhǔn)的熒光強(qiáng)度梯度上的比值，比值的大小反映出待 測(cè)miRNA分子數(shù)目與動(dòng)態(tài)miRNA標(biāo)準(zhǔn)分子數(shù)的比例。因待測(cè)miRNA與動(dòng)態(tài)miRNA標(biāo)準(zhǔn)在 同一反應(yīng)中檢測(cè)，同步擴(kuò)增，排除了外在因素的干擾，動(dòng)態(tài)miRNA標(biāo)準(zhǔn)的分子數(shù)目用量是恒 定的，待測(cè)miRNA相對(duì)熒光強(qiáng)度比值就能客觀地反映不同反應(yīng)中待測(cè)miRNA的多寡。利用 系列稀釋的已知分子數(shù)的合成待測(cè)miRNA為參照物與動(dòng)態(tài)miRNA標(biāo)準(zhǔn)的比較可以作出待 測(cè)miRNA的相對(duì)比值與待測(cè)miRNA分子數(shù)目的校準(zhǔn)曲線(xiàn)，將待測(cè)miRNA相對(duì)比值轉(zhuǎn)換為其 miRNA絕對(duì)拷貝數(shù)。用二倍或三倍稀釋的合成miRNA參照物還可以用來(lái)準(zhǔn)確地衡量方法的 測(cè)定范圍及在每個(gè)濃度點(diǎn)的大致誤差范圍，可以幫助提高所得的數(shù)據(jù)分析結(jié)果的可信度和 標(biāo)準(zhǔn)化。用IBM SPSS Statistics 20分析軟件對(duì)10個(gè)實(shí)際測(cè)得的三倍系列稀釋的數(shù)據(jù)進(jìn) 行回歸模型的分析，我們發(fā)現(xiàn)miRNA的相對(duì)熒光強(qiáng)度與分子數(shù)之間符合對(duì)數(shù)方程的回歸規(guī) 律（power regresssion)，擬合優(yōu)度R2在適用的測(cè)定范圍內(nèi)大于0. 99。校正miRNA參照物 易于標(biāo)準(zhǔn)化，可用于校正不同操作員之間的操作誤差，讓不同實(shí)驗(yàn)室得出的數(shù)據(jù)具有可比 性。
[0030] 由于不同miRNA的探針及3'適配寡聚核苷酸具有不同的Tm值，即使在相同的反 應(yīng)條件下，其熱動(dòng)力學(xué)的影響也導(dǎo)致不同miRNA擁有不同的校準(zhǔn)曲線(xiàn)。由于沒(méi)有能通用的 miRNA的絕對(duì)定量校準(zhǔn)曲線(xiàn)，每個(gè)待測(cè)miRNA均需有自己的絕對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。本發(fā)明適用 于多個(gè)miRNA的同時(shí)鑒定，多種miRNA合成參照物也可以混合使用，大大減少所需反應(yīng)的數(shù) 目。例如完成9個(gè)不同miRNA的校正曲線(xiàn)，以三倍稀釋制作一個(gè)覆蓋50-5xl0 5個(gè)分子測(cè)定 范圍的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)需要測(cè)定10個(gè)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)miRNA參照物，如果使用標(biāo)準(zhǔn)的RT-qPCR測(cè) 定法，僅完成標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作就需要至少90個(gè)反應(yīng)才行，而用本發(fā)明的多目標(biāo)同步測(cè)定法 可將9種合成miRNA混合后作為模板，9種miRNA的絕對(duì)定量校準(zhǔn)曲線(xiàn)僅需10個(gè)反應(yīng)就可 完成。
[0031] 綜上所述，由于采用了上述技術(shù)方案，本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明的miRFLP定 量分析法與現(xiàn)行方法相比，至少有如下優(yōu)點(diǎn)： 1. 絕對(duì)定量：得益于與樣本RNA在同一反應(yīng)管中反應(yīng)形成的動(dòng)態(tài)小RNA標(biāo)準(zhǔn)分子，消 除復(fù)雜樣品以及RNA純度對(duì)測(cè)定的干擾，可對(duì)待測(cè)miRNA進(jìn)行絕對(duì)定量； 2. 高特異性：可鑒別只有1個(gè)堿基差別或同一家族的miRNA ; 3. 高靈敏度：對(duì)細(xì)胞單拷貝miRNA測(cè)定的上樣量范圍為0. 1 μ g-1 ng總RNA ; 4. 測(cè)定范圍：在100-106拷貝數(shù)范圍內(nèi)準(zhǔn)確定量，超出此范圍可作相對(duì)定量； 5. 結(jié)果客觀：設(shè)立了內(nèi)控做為RT或PCR反應(yīng)失敗導(dǎo)致陰性結(jié)果的指標(biāo)，對(duì)基因片段的 甑別可以精確到±0. 2個(gè)堿基； 6. 重復(fù)性好：可控的合成miRNA標(biāo)準(zhǔn)參照保證操作人員及實(shí)驗(yàn)室之間的重復(fù)性和可比 性，有益于方法的標(biāo)準(zhǔn)化。
[0032] 7.適用于RNA粗提物：可直接從血清、血漿等病人樣本中準(zhǔn)確客觀地測(cè)出miRNA 的表達(dá)水平，重復(fù)好，結(jié)果可靠。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0033] 圖1A和圖1B是miRFLP定量分析法反應(yīng)流程及測(cè)定原理圖； 圖2是隨機(jī)選取的具有多個(gè)雜峰的熒光PCR產(chǎn)物經(jīng)25倍稀釋后的DNA片段長(zhǎng)度熒光 分析圖譜； 圖2中，縱坐標(biāo)FU為熒光強(qiáng)度，"□"標(biāo)注的為隨機(jī)選擇的DNA片段； 圖3是長(zhǎng)度為62. OOnt及91. 22nt (B)的DNA片段在不同稀釋度下的熒光測(cè)定值與稀 釋倍數(shù)關(guān)系符合一元二次方程回歸曲線(xiàn)； 圖3中，"A"為62. 00nt的DNA片段，"B"為91. 22nt的DNA片段，縱坐標(biāo)FU為熒光強(qiáng) 度單位； 圖4A和圖4B是動(dòng)態(tài)miRNA標(biāo)準(zhǔn)和不同濃度miRNA的miRFLP分析圖譜； 圖4A和圖4B中，"std l"、"std 2"及"std 3"分別代表動(dòng)態(tài)miRNA標(biāo)準(zhǔn)（std l、std 2和std 3)的熒光DNA片段，"1"、"2"、"3"、"4"分別代表反應(yīng)1、反應(yīng)2、反應(yīng)3、反應(yīng)4， "a"代表miR-92a的熒光DNA片段，"b"代表miR-92b的熒光DNA片段，縱坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度； 圖5A和圖5B是不同分子數(shù)miR-92a和miR-92b的miRFLP測(cè)定圖譜及標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)； 圖5A和圖5B中，"1"為只含有動(dòng)態(tài)miRNA標(biāo)準(zhǔn)的空白對(duì)照測(cè)定結(jié)果，"2-10"分別為 加入了 2. 5x10s個(gè)至244個(gè)合成miR-92a分子和等量的miR-92b為待測(cè)目標(biāo)，圖5B為不同 miRNA拷貝數(shù)與其相對(duì)熒光強(qiáng)度的點(diǎn)對(duì)應(yīng)圖； 圖6是miRFLP方法測(cè)定miR-25家族成員矯正曲線(xiàn)的重復(fù)性及測(cè)定范圍結(jié)果圖； 圖6中，橫坐標(biāo)為miRNA分子數(shù)，縱坐標(biāo)為相對(duì)突光強(qiáng)度； 圖7是Let-7家族miRFLP定量分析譜對(duì)單個(gè)Let-7成員的測(cè)定結(jié)果圖； 圖7中，從上至下分別為let-7b、let-7c、let_7d及l(fā)et_7g的測(cè)定結(jié)果，"std l"、"std 2"及"std 3"代表的含義與圖4A中的"std l"、"std 2"及"std 3" 一致； 圖8是用莖環(huán)引物的miRFLP分析方法對(duì)miR-92b及miR-25的測(cè)定結(jié)果； 圖9帶有以堿基數(shù)目為編碼的莖環(huán)引物； 圖9中，A :為探測(cè)Standard 1 RNA設(shè)計(jì)的莖環(huán)引物，在5'端PCR祀位(箭頭）與探針 之間放置了 4個(gè)堿基(方框）作為標(biāo)記。莖環(huán)dG = -13.71。
[0034] B :為探測(cè)Standard 2 RNA設(shè)計(jì)的莖環(huán)引物，在5'端PCR靶位(箭頭）與探針之間 放置了 7個(gè)堿基(方框）作為標(biāo)記。莖環(huán)dG = -13. 09。

【具體實(shí)施方式】
[0035] 下面對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)的說(shuō)明。
[0036] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明 進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于 限定本發(fā)明。
[0037] 實(shí)施例1 miRFLP定量分析法反應(yīng)流程及測(cè)定原理 本實(shí)施例以歐米伽引物為例，具體闡述miRFLP定量分析法反應(yīng)流程及測(cè)定原理。
[0038] miRFLP反應(yīng)由miRNA反轉(zhuǎn)錄、cDNA加尾、PCR同步擴(kuò)增及PCR產(chǎn)物的熒光片段長(zhǎng) 度多態(tài)性分析等四個(gè)步驟組成，如圖1A和圖1B所示。反應(yīng)的第一步是將miRNA和歐米伽 引物混合雜交，miRNA與互補(bǔ)的探針形成配對(duì)，然后用反轉(zhuǎn)錄酶以未配對(duì)的miRNA3'末端為 模板合成cDNA。除去RNA后，新合成的cDNA與含有共同PCR靶位的3'寡居核苷酸引物雜 交并用DNA聚合酶以cDNA的3'末端為起始補(bǔ)齊DNA配對(duì)后的單鏈缺口。經(jīng)此組合后，正 確裝配的cDNA擁有相同的5'及3'末端序列，可經(jīng)一對(duì)熒光PCR引物進(jìn)行同步等比擴(kuò)增， 擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)毛細(xì)管凝膠電泳分離后測(cè)定不同長(zhǎng)度PCR片段的熒光強(qiáng)度，完成miRFLP分析 圖譜，圖1B為整個(gè)miRFLP定量分析的最后一步。
[0039] 實(shí)施例2 PCR熒光標(biāo)記產(chǎn)物等倍稀釋液熒光強(qiáng)度的測(cè)定試驗(yàn) 熒光定量分析儀測(cè)出的熒光強(qiáng)度與待測(cè)熒光物質(zhì)的數(shù)量成正比關(guān)系，這種關(guān)系與儀器 所配置的熒光探頭有關(guān)，即不同的熒光探頭擁有不同的熒光響應(yīng)曲線(xiàn)。ABI的Prizma 310 型DNA測(cè)序儀測(cè)得的熒光強(qiáng)度在5-7000 FU的范圍里與待測(cè)的熒光物質(zhì)數(shù)量成線(xiàn)性定量的 關(guān)系，當(dāng)熒光強(qiáng)度值大于7000FU時(shí)改變?yōu)閽佄锞€(xiàn)。不同儀器的熒光探頭響應(yīng)特性不一樣， 可以影響到測(cè)出的熒光強(qiáng)度與待測(cè)熒光量的回歸關(guān)系。本實(shí)施例對(duì)ABI 3730x1型DNA分析 儀的熒光響應(yīng)曲線(xiàn)用2倍系列稀釋的PCR產(chǎn)物進(jìn)行了標(biāo)定。實(shí)驗(yàn)隨機(jī)選取了一個(gè)具有多個(gè) 不同片度且熒光強(qiáng)度變化較大的熒光PCR產(chǎn)物，用ΙχΤΕ以25、50、100、200及400倍稀釋后 用ABI 3730x1型DNA分析儀分析。圖2是該P(yáng)CR產(chǎn)物經(jīng)25倍稀釋的樣品熒光掃描圖，從 中選取11個(gè)峰值介于253-25000FU的DNA片段，統(tǒng)計(jì)出它們?cè)诓煌♂尪鹊臒晒庾x值(見(jiàn) 表1)，經(jīng)IBM SPSS Statistics 20統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)稀釋倍數(shù)和熒光強(qiáng)度測(cè)定值的對(duì)應(yīng)關(guān)系進(jìn) 行回歸曲線(xiàn)的優(yōu)化評(píng)估，顯示一元二次方程回歸曲線(xiàn)適用于描述所有片度的熒光強(qiáng)度與稀 釋倍數(shù)的關(guān)系，回歸的擬合優(yōu)度R平方值均大于0.999。因此，經(jīng)ABI 3730x1型DNA分析儀 測(cè)得的DNA片段的熒光強(qiáng)度與熒光物質(zhì)數(shù)量的對(duì)應(yīng)關(guān)系可以用一元二次方程回歸曲線(xiàn)來(lái) 精確計(jì)算，而不是簡(jiǎn)單的線(xiàn)性定量關(guān)系。重復(fù)實(shí)驗(yàn)證明同樣的樣品在不同批次的測(cè)定絕對(duì) 值可以有所不同，但這種一元二次方程的回歸模型并不受影響。圖3顯示了在低豐度片段 (A :30FU-312FU)及高豐度片段（B :2052FU-24949FU)經(jīng)系列稀釋后的回歸曲線(xiàn)圖。不同廠 家或不同型號(hào)的DNA熒光定量分析儀均可采用上述方法對(duì)適用的熒光響應(yīng)曲線(xiàn)及范圍進(jìn) 行標(biāo)定，遴選出最適合亦即最精確的回歸方式。
[0040] 表1 :用于圖2的PCR產(chǎn)物經(jīng)25、50、100、200和400倍稀釋后 用ABI 3730x1型DNA分析儀在不同稀釋倍數(shù)下測(cè)得的熒光值及經(jīng)IBM SPSS Statistics 20統(tǒng)計(jì)軟件作一元二次方程回歸統(tǒng)計(jì)后的擬合優(yōu)度R平方：

【權(quán)利要求】
1. 一種利用擴(kuò)增DNA片段長(zhǎng)度多態(tài)性定量測(cè)定短鏈RNA的方法，其特征在于，包括以下 步驟： 首先利用至少兩種與待測(cè)短鏈RNA相比無(wú)天然同源序列的合成小RNA作為測(cè)定的內(nèi) 標(biāo)，將這些作為內(nèi)標(biāo)的所述合成小RNA以不同分子數(shù)混合，形成動(dòng)態(tài)小RNA標(biāo)準(zhǔn)分子梯度； 再以等量的所述動(dòng)態(tài)小RNA標(biāo)準(zhǔn)與所述待測(cè)短鏈RNA混合，經(jīng)由RNA反轉(zhuǎn)錄、cDNA加 尾、PCR同步擴(kuò)增及PCR產(chǎn)物DNA長(zhǎng)度多態(tài)性片段的熒光定量分析，測(cè)得所述待測(cè)短鏈RNA 擴(kuò)增產(chǎn)生的DNA片段熒光強(qiáng)度在所述動(dòng)態(tài)小RNA標(biāo)準(zhǔn)熒光強(qiáng)度梯度上的相對(duì)比例，從而實(shí) 現(xiàn)所述待測(cè)短鏈RNA的相對(duì)定量。
2. 如權(quán)利要求1所述的一種利用擴(kuò)增DNA片段長(zhǎng)度多態(tài)性定量測(cè)定miRNA的方法，其 特征在于，測(cè)得所述待測(cè)短鏈RNA在所述動(dòng)態(tài)小RNA標(biāo)準(zhǔn)梯度上的相對(duì)強(qiáng)度比例后，以待測(cè) 短鏈RNA序列為模板合成短鏈RNA參照物，測(cè)定不同分子數(shù)量的待測(cè)RNA參照物在上述動(dòng) 態(tài)小RNA標(biāo)準(zhǔn)梯度上的相對(duì)比例，由此獲得待測(cè)短鏈RNA參照物的分子數(shù)目-相對(duì)強(qiáng)度的 校正曲線(xiàn)，再利用所述待測(cè)短鏈RNA相對(duì)強(qiáng)度比例通過(guò)所述校正曲線(xiàn)，計(jì)算出樣品中待測(cè) 短鏈RNA的絕對(duì)分子數(shù)量。
3. 如權(quán)利要求1或2所述的一種利用擴(kuò)增DNA片段長(zhǎng)度多態(tài)性定量測(cè)定短鏈RNA的方 法，其特征在于，所述待測(cè)短鏈RNA為miRNA或siRNA。
4. 如權(quán)利要求1或2所述的一種利用擴(kuò)增DNA片段長(zhǎng)度多態(tài)性定量測(cè)定短鏈RNA的方 法，其特征在于，所述RNA反轉(zhuǎn)錄過(guò)程中，所采用的引物為歐米茄引物。
5. 如權(quán)利要求1或2所述的一種利用擴(kuò)增DNA片段長(zhǎng)度多態(tài)性定量測(cè)定短鏈RNA的方 法，其特征在于，所述RNA反轉(zhuǎn)錄過(guò)程中，所采用的引物為莖環(huán)引物。
6. 如權(quán)利要求5所述的一種利用擴(kuò)增DNA片段長(zhǎng)度多態(tài)性定量測(cè)定短鏈RNA的方法， 其特征在于，所述莖環(huán)引物為經(jīng)過(guò)長(zhǎng)度編碼的莖環(huán)引物。
7. 如權(quán)利要求6所述的一種利用擴(kuò)增DNA片段長(zhǎng)度多態(tài)性定量測(cè)定短鏈RNA的方法， 其特征在于，所述長(zhǎng)度編碼的方法為：在所述莖環(huán)引物的PCR靶位點(diǎn)與探針序列之間加上 不同堿基數(shù)目，并調(diào)整引物5'端的堿基序列使之維持莖環(huán)的二級(jí)結(jié)構(gòu)不變。
8. 如權(quán)利要求2所述的一種利用擴(kuò)增DNA片段長(zhǎng)度多態(tài)性定量測(cè)定短鏈RNA的方法， 其特征在于，所述校正曲線(xiàn)符合對(duì)數(shù)回歸的方式，表述為：aX b，其中a、b為常數(shù)項(xiàng)，經(jīng)對(duì)不同 分子數(shù)目的所述合成小RNA的實(shí)際測(cè)定值而確定。
9. 如權(quán)利要求1所述的一種利用擴(kuò)增DNA片段長(zhǎng)度多態(tài)性定量測(cè)定短鏈RNA的方法， 其特征在于，所述與待測(cè)短鏈RNA相比無(wú)天然同源序列的合成小RNA的種數(shù)為三種。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104120184SQ201410362696
【公開(kāi)日】2014年10月29日 申請(qǐng)日期:2014年7月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月28日
【發(fā)明者】徐凱, 唐放, 張耀藝, 馮梓浩, 楊宇, 吳秀錦, 張菲菲 申請(qǐng)人:成都諾恩生物科技有限公司