一種使煙草獲得馬鈴薯y病毒抗性的方法及vigs載體的制作方法
【專利摘要】一種使煙草獲得馬鈴薯Y病毒抗性的方法，該方法是首先制備含VIGS載體的根癌農(nóng)桿菌；該VIGS載體的靶標(biāo)序列為馬鈴薯Y病毒CP序列，如Seq?ID?No.1所示；再于煙苗剪葉后，噴施上述根癌農(nóng)桿菌和PBNTRA6根癌農(nóng)桿菌的混合菌液，使根癌農(nóng)桿菌侵染剪葉煙苗，通過侵染將CP基因片段導(dǎo)入煙草。本發(fā)明同時(shí)提供一種以馬鈴薯Y病毒基因?yàn)榘袠?biāo)的上述VIGS載體。本發(fā)明以種植普通煙草為試材，以煙田危害廣泛的馬鈴薯Y病毒為靶標(biāo)病毒進(jìn)行具體實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，導(dǎo)入CP基因的煙草獲得良好的PVY病毒抗性。
【專利說明】一種使煙草獲得馬鈴薯Y病毒抗性的方法及VIGS載體

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及利用RNA沉默技術(shù)誘導(dǎo)植物抗性技術(shù)，特別是一種使煙草獲得馬鈴薯Y病毒抗性的方法及VIGS載體。

【背景技術(shù)】
[0002]煙草是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物。煙草馬鈴薯Y病毒病(Potato virus Y，PVY)是煙草上的最重要病害之一。根據(jù)近年調(diào)查發(fā)現(xiàn):煙草PVY的危害日益嚴(yán)重，防治困難，嚴(yán)重影響煙草的產(chǎn)量和品質(zhì)，已造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前生產(chǎn)上煙草PVY病毒病缺乏有效的防治措施，對(duì)煙草花葉病毒防效較好的藥劑(如寧南霉素、病毒A等)對(duì)煙草PVY的防治效果非常有限，煙草PVY無(wú)藥可防，導(dǎo)致農(nóng)民濫用藥、誤打藥，造成藥害和煙葉中農(nóng)藥殘留，污染環(huán)境，嚴(yán)重影響煙草產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。因此，生產(chǎn)上迫切需要一種新的方法來(lái)有效防治煙草PVY，保障煙草的生產(chǎn)安全。病毒誘導(dǎo)的基因沉默(Virus induced gene silencing,VIGS)應(yīng)用于植物病毒病害的防治可能是解決此問題的有效途徑之一。
[0003]病毒誘導(dǎo)的基因沉默(Virus-1nduced gene silence, VIGS)是植物抗病毒侵染的一種自然機(jī)制。當(dāng)病毒基因組cDNA導(dǎo)入植株并表達(dá)后，誘發(fā)RNA介導(dǎo)的防御機(jī)制(RNA-mediated deference, RMD),同時(shí)誘發(fā)與插入片段同源基因的表達(dá)沉默。早在20世紀(jì)20~30年代期間，人們就發(fā)現(xiàn)感染了病毒溫和株系的植株可以抵御隨后的溫和株系及與其親源關(guān)系相近的強(qiáng)毒株系病毒的侵染，即交叉保護(hù)現(xiàn)象。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，交叉保護(hù)現(xiàn)象是由于病毒誘導(dǎo)產(chǎn)生了 RNA沉默，使植株產(chǎn)生了對(duì)該病毒的抗性，即病毒誘導(dǎo)的基因沉默。后來(lái)在轉(zhuǎn)基因植株中出現(xiàn)了類似的現(xiàn)象，即病毒接種的初期，病毒正常增殖，接種葉片表現(xiàn)出被病毒感染的癥狀。但隨著病毒在植株中的系統(tǒng)擴(kuò)散，植株的新生葉片中雖僅含有少量的轉(zhuǎn)入基因，但表現(xiàn)出對(duì)該病毒的抗性。RNA沉默廣泛存在于真核生物中，包括真菌、藻類、昆蟲、植物、原生動(dòng)物、無(wú)脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物等。大量實(shí)驗(yàn)證明，病毒誘導(dǎo)的基因沉默是植物抗病的可能機(jī)制，VIGS與動(dòng)物干擾(RNA interference, RNAi)機(jī)理上有許多相似之處，雙鏈(dsRNA)是基因沉默的關(guān)鍵因子，VIGS啟動(dòng)時(shí)一般先形成雙鏈dsRNA，dsRNA首先被稱為DICER( —種RNA III酶)的核酸酶降解為不同長(zhǎng)度的小RNA，然后這些小RNA分子與RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RNA-1nduced silencing complex, RISC)結(jié)合并引導(dǎo)RISC降解同源mRNA。21-24nt的小mRNA在調(diào)芐基因的表達(dá)和保護(hù)基因組中發(fā)揮著作用，這些小分子RNA能夠作為沉默信號(hào)分子被放大，且植物和動(dòng)物體內(nèi)有不同的放大機(jī)制，通過提高dsRNA的量可以明顯增強(qiáng)VIGS的效果。將靶病毒基因片段插入VIGS病毒載體-煙草脆裂病毒(Tobacco rattle virus, TRV)，插入片段隨著TRV的侵染進(jìn)入植物基因組，轉(zhuǎn)錄成dsRNA，隨TRV的在植物體內(nèi)的擴(kuò)展產(chǎn)生大量dsRNA，病毒侵染植物，導(dǎo)致侵入病毒的靶向同源基因降解，抑制靶病毒的侵染。
[0004]Ratciff 等將其改造成 TRV 的 RNAl (PTV00)和 RNA2 (PBNTRA6) cDNA 的雙元表達(dá)載體，并利用TRV載體成功使轉(zhuǎn)基因煙草的綠色熒光蛋白基因沉默。TRV是目前應(yīng)用最廣的VIGS載體，具有沉默效率高且效果持久、各種組織均可產(chǎn)生沉默等優(yōu)點(diǎn)，介導(dǎo)基因沉默同時(shí)不會(huì)帶來(lái)病毒誘導(dǎo)的癥狀，改造后的病毒能夠促進(jìn)非病毒序列的插入以及對(duì)植物的后續(xù)感染，因而已被廣泛應(yīng)用于煙草、番茄、馬鈴薯、碧冬茄、辣椒等多種茄科植物。
[0005]病毒外殼蛋白(coat protein, CP)是ORF編碼的最后一個(gè)蛋白，包被病毒RNA,對(duì)病毒起保護(hù)作用。CP分為三個(gè)區(qū)域:暴露在病毒粒子表面的N-端、C-端和中間區(qū)域。中間區(qū)域較為保守，與病毒組裝、胞間連絲排通極限及細(xì)胞到細(xì)胞的移動(dòng)有關(guān)。CP的N-端區(qū)域最易變異，參與病毒在植物細(xì)胞間長(zhǎng)距離的移動(dòng)。CP的N-端包含一個(gè)保守的氨基酸序列(DAG)，該基序通過與HC-Pro互作參與和蚜蟲口針的結(jié)合，因此CP對(duì)蚜蟲的傳毒很重要。此外，CP還參與調(diào)控病毒RNA復(fù)制、擴(kuò)增等過程。
[0006]選用對(duì)蚜蟲傳毒有重要影響的CP基因作為抗馬鈴薯Y病毒的靶標(biāo)基因，干擾病毒的組裝、移動(dòng)和傳播，達(dá)到防病毒效果。但到目前為止，通過基因沉默原理，特異性的沉默馬鈴薯Y病毒CP基因使煙草獲得馬鈴薯Y病毒抗性的方法還未見報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是:針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種使煙草獲得馬鈴薯Y病毒抗性的方法，以及該方法涉及到的VIGS載體。
[0008]為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是:一種使煙草獲得馬鈴薯Y病毒抗性的方法，該方法步驟如下:
[0009](I)制備含VIGS載體的根癌農(nóng)桿菌；該VIGS載體的靶標(biāo)序列為馬鈴薯Y病毒CP序列，如Seq ID N0.1所示；
[0010](2)煙苗剪葉后噴施上述根癌農(nóng)桿菌和PBNTRA6根癌農(nóng)桿菌的體積比為1:1的混合菌液，使根癌農(nóng)桿菌侵染剪葉煙苗，通過侵染將CP基因片段導(dǎo)入煙草。
[0011]本發(fā)明同時(shí)提供一種以馬鈴薯Y病毒基因?yàn)榘袠?biāo)的VIGS載體，所述VIGS載體的靶標(biāo)序列為CP序列，如Seq ID N0.1所示。
[0012]本發(fā)明還保護(hù)轉(zhuǎn)化有上述VIGS載體的菌株，其出發(fā)菌株為根癌農(nóng)桿菌GV3101。
[0013]本發(fā)明目的在于，以煙草馬鈴薯Y病毒脈壞死株系為材料，構(gòu)建靶向CP基因的VIGS載體，誘發(fā)煙草自身防御機(jī)制的同時(shí)，干擾煙草馬鈴薯Y病毒在植物體內(nèi)的復(fù)制、運(yùn)輸、致病性和傳播，并使病毒失去保護(hù)作用，達(dá)到防御煙草馬鈴薯Y病毒病的目的。本發(fā)明區(qū)別現(xiàn)有技術(shù)的思路是:構(gòu)建的使煙草產(chǎn)生馬鈴薯Y病毒抗性的VIGS載體的沉默對(duì)象是入侵病毒的CP基因，而非植物本身基因。
[0014]本發(fā)明以種植普通煙草為試材，以煙田危害廣泛的馬鈴薯Y病毒為靶標(biāo)病毒進(jìn)行具體實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，噴施菌液的煙草獲得良好的PVY病毒抗性?；诒景l(fā)明的構(gòu)思，說明書中記載的實(shí)驗(yàn)方法的指導(dǎo)以及本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所具備的常規(guī)實(shí)驗(yàn)技能，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以將本發(fā)明的方法應(yīng)用到多種煙草病毒病，這種應(yīng)用都在本發(fā)明請(qǐng)求保護(hù)的范圍內(nèi)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1是含PVY CP基因片段載體的構(gòu)建。
[0016]圖2是含馬鈴薯Y病毒脈壞死株系馬鈴薯總RNA提取的電泳圖。
[0017]其中:從左至右，第1-6泳道:含馬鈴薯Y病毒脈壞死株系馬鈴薯總RNA提取，可以觀察到有明顯的兩條帶，證明RNA提取成功,可進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄；第7泳道:2k plus mark。
[0018]圖3是馬鈴薯Y病毒CP基因PCR擴(kuò)增電泳圖。
[0019]其中，M:2k plus mark ；1:退火溫度50°C ；2:退火溫度52°C ；3:退火溫度54°C ；
4:退火溫度56°C ;5:退火溫度58°C ;6:陰性對(duì)照。
[0020]圖4是PTVOO-CP載體質(zhì)粒酶切電泳圖。
[0021]其中，I=PTVOO-CP 質(zhì)粒；2 =PTVOO-CP 質(zhì)粒酶切；M:2K plus mark。
[0022]圖5是大田驗(yàn)證PTVOO-CP的轉(zhuǎn)入。
[0023]其中，1-2:陰性對(duì)照；3_24:田間試驗(yàn)隨機(jī)采樣，反轉(zhuǎn)錄后用PTV00R/PTV00FPCR擴(kuò)增；M:2K plus mark。
[0024]圖6是接種實(shí)驗(yàn)。
[0025]其中，A、C表示含VIGS載體的被試煙苗，與正常煙苗無(wú)異；B、D表示噴施清水對(duì)照，有明顯的脈壞死、花葉癥狀。

【具體實(shí)施方式】
[0026]本發(fā)明中所有引物皆由上海生工生物工程公司合成。
[0027]實(shí)施例1PVY的CP基因的克隆及測(cè)序驗(yàn)證
[0028]馬鈴薯Y病毒(Potato virus Y，PVY)是馬鈴薯Y病毒屬中的典型種，對(duì)馬鈴薯、煙草等重要經(jīng)濟(jì)作物危害相當(dāng)嚴(yán)重，特別是PVY壞死株系(PVYN)可以造成寄主植物提前死亡而絕產(chǎn)。PVY-CP基因序列如SEQ ID N0.1所示。
[0029]本發(fā)明針對(duì)馬鈴薯Y病毒(PVY)脈壞死株系的CP基因設(shè)計(jì)引物:CPF: 5'-GAGGATCCGCATTCAACCAAATCTCAACA-3' (如 SEQ ID N0.2 所示)，CPR: 5' -TAGGTACCGCATAGCGAGCCAAACTTCC-3' (如SEQ ID N0.3所示)，下劃線部分為引入的酶切位點(diǎn)，采用PCR方法克隆PVY的CP基因，具體步驟如下:
[0030]提取含馬鈴薯Y病毒總RNA。通過瓊脂糖凝膠電泳和核酸定量?jī)x檢測(cè)其質(zhì)量和濃度，見圖 2,通過反應(yīng)體系(RNA50ng_5ug、Anchored oligo (dT) Primerlul>2*TS Rect1nMixlOul、Enzyme Mixlul > gDNA Removerlul、去 RNA 水補(bǔ)足至 20ul)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄成 cDNA。[0031 ] 利用引物CPF/CPR，以該馬鈴薯Y病毒cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得PVY-CP基因片段，見圖3。其中，PCR反應(yīng)體系為:10父？0?緩沖液2111、0嫩模板1111、(1見131.6111、上下游引物各0.8ul、Taq酶0.4ul、去離子水補(bǔ)足至20ul ；PCR反應(yīng)條件為:94V 3min預(yù)變性，940C 30sec變性；50-68°C 30sec退火；72V Imin延伸(目的片段大于500 bp用I分鐘，小于 500 bp 用 40 秒)，35 個(gè)循環(huán)，72°C 10min，4°C保存。
[0032]對(duì)PCR產(chǎn)物(PVY-CP基因片段)進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，回收該P(yáng)VY-CP基因片段，將該回收片段與載體Tl Cloning Vector (購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司)連接,取1ul連接產(chǎn)物,轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞(感受態(tài)大腸桿菌TransTl ChemicallyCompetent Cell購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司)。根據(jù)載體上的氨芐青霉素抗性標(biāo)記篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，利用克隆載體檢測(cè)引物(M13+:5’ -AGGGTTTTCCCAGTCACG-3’，如SEQ IDN0.4 所示，Ml3-:5’ -GTGTGAAATTGTTATCCGCTC-3’，如 SEQ ID N0.5 所示)，按前述的 PCR 擴(kuò)增方法和體系篩選陽(yáng)性克隆，其PCR產(chǎn)物大小約530bp，與CP基因片段長(zhǎng)度基本一致。將陽(yáng)性克隆送上海生工生物工程公司測(cè)序，結(jié)果與預(yù)期完全一致。
[0033]實(shí)施例2 VIGS載體(PTV00-CP重組載體)構(gòu)建
[0034]病毒載體:煙草脆裂病毒(Tobacco rattle virus, TRV), Ratciff等將其改造成TRV的RNAl和RNA2 cDNA的雙元表達(dá)載體，通過進(jìn)一步改造成PTVOO和PBNTRA6，本實(shí)驗(yàn)亦有保存。
[0035]本發(fā)明中利用PTVOO —組酶切位點(diǎn)BamHI/Kpnl，將PCR擴(kuò)增獲得的CP基因片段(530bp)連接到PTVOO酶切位點(diǎn)中。將PTVOO-CP質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒用于根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化。酶切驗(yàn)證如圖4，可結(jié)合參見圖1。測(cè)序結(jié)果顯示序列構(gòu)建位置正確。操作如下:
[0036]步驟1.PTVOO載體片段酶切與回收
[0037]提取大腸桿菌中PTVOO質(zhì)粒(質(zhì)粒DNA的小量提取試劑盒)。取25ul質(zhì)粒，利用BamHI和KpnI內(nèi)切酶，采用10ul酶切體系，37°C酶切45min，回收酶切產(chǎn)物中3K左右長(zhǎng)度的質(zhì)粒片段；采用DNA/RNA的紫外分光檢測(cè)瓊脂糖凝膠電泳分析判斷回收片段的濃度。回收片段標(biāo)記為PTVOO-BamHI/KpnI。
[0038]步驟2.PVY-CP基因PCR片段酶切與回收
[0039]分別純化回收PCR產(chǎn)物得CP基因片段。各取25ul回收片段，利用KpnI和BamHI內(nèi)切酶，采用10ul酶切體系，37°C酶切45min，回收酶切產(chǎn)物中對(duì)應(yīng)SEQ ID N0.1所示序列長(zhǎng)度的質(zhì)粒片段。取Iul回收片段，進(jìn)行凝膠電泳判斷回收質(zhì)量。CP回收片段標(biāo)記為CP-KpnI/BamH1.
[0040]步驟3.PTVOO-BamHI/KpnI和CP_KpnI/BamHI的連接與轉(zhuǎn)化大腸桿菌
[0041]取5ul CP-KpnI/BamHI 和 2ul PTVOO-BamHI/KpnI 以反應(yīng)體系(10XT4 DNALigat1n Buffer4ul、T4 DNA Ligase (lU/ul) 2ul、酶切回收后 PCR 片段 10ul、載體(50-400ng)4ul、無(wú)菌去離子水補(bǔ)足到20ul)分別進(jìn)行接連，用PCR儀進(jìn)行控溫，16°C 16h。
[0042]將鏈接產(chǎn)物進(jìn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，參照實(shí)施例1中的PCR擴(kuò)增方法和反應(yīng)體系，于篩選平板加入50mg/L卡那霉素(Kan)為抗生素篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，利用克隆載體檢測(cè)引物M13+/-檢測(cè)轉(zhuǎn)化子，選擇PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的轉(zhuǎn)化菌，測(cè)序驗(yàn)證:得到重組載體，標(biāo)記為PTV00-CP。
[0043]實(shí)施例3 PTV00-CP重組載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101
[0044]步驟1.根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備
[0045](I)挑選根癌農(nóng)桿菌GV3101菌落，接種于含有50mg/L的利福平的液體LB培養(yǎng)基中，28°C 200rpm 培養(yǎng) 16h。
[0046](2)取500ulGV3101菌液至50ml液體LB培養(yǎng)基中搖陪至0D600值為0.6左右。
[0047](3)將菌液冰浴 30min, 4°C。5000rmp 離心 1min,收集菌。
[0048](4)用40ml預(yù)冷的10%甘油重懸菌體，4°C 4500rmp，離心10min，收集菌體。
[0049](5)用20ml預(yù)冷的10%甘油重懸菌體，4°C 4500rmp，離心10min，收集菌體。
[0050](6)用1ml預(yù)冷的10%甘油重懸菌體，4°C 4500rmp，離心10min，收集菌體。
[0051](7)用2ml預(yù)冷的10%甘油重懸菌體，分裝每管50ml液氮速凍。_80°C保存。
[0052]步驟2.PTV00-CP 電擊轉(zhuǎn)化進(jìn) GV3101
[0053](I)從_80°C冰箱中取出感受態(tài)細(xì)胞，置于冰上解凍。
[0054](2)取Iul純化后的PTV00-CP質(zhì)粒于1.5ml的離心管中，將其和0.1cm的電擊杯一起置于冰上預(yù)冷。
[0055](3)將10ul解凍的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)移至1.5ml的離心管中，小心混勻，冰上放置1min0
[0056](4)打開電轉(zhuǎn)儀，調(diào)至Manal，使其電壓2.1kv0
[0057](5)將此混合物轉(zhuǎn)移至已預(yù)冷的點(diǎn)擊杯中，輕輕敲擊電擊杯，使其混合物均勻進(jìn)入電擊杯的底部。
[0058](6)將電擊杯推入電轉(zhuǎn)化儀，按(4)中設(shè)定的參數(shù)，聽到蜂鳴后，向電擊杯中迅速加入1ml的SOC液體培養(yǎng)基，重懸細(xì)胞后，轉(zhuǎn)移到1.5ml的離心管中。
[0059](7)28°C、200rmp 震蕩培養(yǎng) 3h。
[0060](8)取50_100ul菌液涂布在加有抗生素Kan和Rif的LB培養(yǎng)基上，平板正向放置Ih, 28°C倒置培養(yǎng)2-3天，直至菌落長(zhǎng)出。
[0061](9)以實(shí)施例1中的PCR擴(kuò)增方法和反應(yīng)體系，利用克隆載體檢測(cè)引物M13+/-篩選陽(yáng)性克隆，陽(yáng)性克隆PCR產(chǎn)物大小約530bp，與預(yù)期大小一致，選擇PCR檢測(cè)為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化菌，測(cè)序驗(yàn)證:得到根癌農(nóng)桿菌陽(yáng)性菌液，標(biāo)記PTV00-CP-GV3101。
[0062]實(shí)施例4含CP基因煙草的獲得
[0063]步驟1.PTVOO-CP導(dǎo)入被試煙草
[0064](l)28°C、200rmp 培養(yǎng) PTV00-CP-GV3101 和 PBNTRA6-GV3101 菌液，搖至 0D600 為
0.4-0.6 左右；
[0065](2)將 PTV00-CP-GV3101 和 PBNTRA6-GV3101 以 1:1 比例混合在一起，放置 30min ；
[0066](3)選取將剪葉的煙草苗，進(jìn)行剪葉，噴施(2)中所述的混合菌液；
[0067](4) 1min后，用清水噴施，將葉片菌液洗凈；
[0068](5)每隔3天噴施I次，連續(xù)噴施3次。
[0069]步驟2.被試煙草RT-PCR檢測(cè)
[0070]待育苗盤煙草長(zhǎng)至足夠移苗，提取被試煙苗RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，利用引物(PTV00R: 5' -TAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTC-3'，如 SEQ ID N0.6 所示；PTV00F: 5' -GGCMTCAGGTGCGACAATC-3'，如SEQ ID N0.7所示)，RT-PCR檢測(cè)CP基因是否成功轉(zhuǎn)入被試煙草中。結(jié)果如圖5所示,顯示CP基因成果轉(zhuǎn)入。
[0071]實(shí)施列5 VIGS技術(shù)處理煙草的抗性確定
[0072]本實(shí)驗(yàn)原理，TRV侵染煙草引起防衛(wèi)反應(yīng)，同時(shí)由于TRV的侵染將PVY CP基因?qū)霟煵?，啟?dòng)VIGS，PVY侵染煙草時(shí)引起CP基因同源降解，抑制PVY的侵染。
[0073]待田間煙草進(jìn)入旺長(zhǎng)初期，摩擦接種馬鈴薯Y病毒脈壞死株系病毒。
[0074](I)配置 0.01mol/L、ρΗ7.0 磷酸緩沖液。PBS 配置 KCl 0.2g、KH2PO40.2g、NaCl
8.0g、Na2HPO4.2H20 1.56g、溶于1000ml三蒸水中，分裝消毒，高壓鍋中121。。20min消毒；
[0075](2)病毒制備:取實(shí)驗(yàn)室保存含馬鈴薯Y病毒脈壞死株系煙草發(fā)病葉片。按1:200比例加磷酸緩沖液，搗碎，雙層紗布過濾后立即使用；
[0076](3)借種方法:選取長(zhǎng)成新葉，在表面均勻撒上碳化硅(600目)，用毛筆蘸取接種懸浮液，在葉面輕度摩擦造成微傷，每株接種I片葉，接種后20min用清水沖洗葉面上多余的病毒汁液。接種當(dāng)天溫度為20-30°C，正常栽培管理；
[0077](4)病情調(diào)查與分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)國(guó)家病害調(diào)查標(biāo)準(zhǔn)GB/T 233222-2008。
[0078]

【權(quán)利要求】
1.一種使煙草獲得馬鈴薯Y病毒抗性的方法，其特征在于，該方法步驟如下: (1)制備含VIGS載體的根癌農(nóng)桿菌；該￥163載體的靶標(biāo)序列為馬鈴薯Y病毒CP序列，如 Seq ID N0.1 所示； (2)煙苗剪葉后，噴施上述根癌農(nóng)桿菌和PBNTRA6根癌農(nóng)桿菌的體積比為1:1的混合菌液，使根癌農(nóng)桿菌侵染剪葉煙苗，通過侵染將CP基因片段導(dǎo)入煙草。
2.如權(quán)利要求1所述的一種使煙草獲得馬鈴薯Y病毒抗性的方法，其特征在于，所述VIGS載體為PTVOO-CP載體。
3.一種以馬鈴薯Y病毒基因?yàn)榘袠?biāo)的VIGS載體，其特征在于，所述VIGS載體的靶標(biāo)序列為馬鈴薯Y病毒CP序列，如Seq ID N0.1所示。
4.含有權(quán)利要求3所述VIGS載體的菌株。
5.如權(quán)利要 求4所述的菌株，其出發(fā)菌株為根癌農(nóng)桿菌GV3101。
【文檔編號(hào)】C12N1/21GK104131032SQ201410362991
【公開日】2014年11月5日 申請(qǐng)日期:2014年7月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月28日
【發(fā)明者】唐前君, 魏潤(rùn)潔, 肖啟明, 蔡海林, 曾維愛, 楊紅武, 胡新喜, 劉雙清, 李魏, 周志成, 李迅 申請(qǐng)人:湖南農(nóng)業(yè)大學(xué), 湖南省煙草公司長(zhǎng)沙市公司