川藏高原冰葡萄酒三級復合發(fā)酵菌劑及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種川藏高原冰葡萄酒三級復合發(fā)酵菌劑的制備方法，以Pichia?manshurica(菌種保藏編號:CGMCC?No.6867)、Pichia?anomala(異常畢赤酵母，菌種保藏編號:CGMC?No.C6866)、Saccharomyces?cerevisiae和Saccharomyces?chevalieri為主要發(fā)酵菌，采用現(xiàn)代生物技術和微囊制劑制備技術，制成川藏高原冰葡萄酒前期沉釀-中期快速啟動-后期發(fā)酵三級復合發(fā)酵菌劑，為冰葡萄酒標準化生產提供了核心技術，填補國內生產空白，這將對我國葡萄與葡萄酒行業(yè)中高端產品的發(fā)展和適應市場消費需求起到積極的促進作用，符合了現(xiàn)實的地方特色產業(yè)發(fā)展需要。
【專利說明】川藏高原冰葡萄酒三級復合發(fā)酵菌劑及其制備方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及復合發(fā)酵制劑，尤其涉及的是一種川藏高原冰葡萄酒前期沉釀-中期 快速啟動-后期發(fā)酵三級復合發(fā)酵菌劑制備方法。

【背景技術】
[0002] 我國川高原藏區(qū)冰葡萄酒產區(qū)的發(fā)現(xiàn)和冰葡萄酒產業(yè)項目的建設，將會把地域性 極強的不可替代不可復制的自然資源優(yōu)勢轉化為市場競爭優(yōu)勢，促成具有國際競爭力的地 方特色產業(yè)和支柱產業(yè)的形成。冰葡萄酒作為葡萄酒中的貴族，酒香自然甜潤醇美，澄澈清 亮，口感雋永，品質上乘。同時，冰葡萄酒中營養(yǎng)成分豐富，幾乎包含了人體所必需的數(shù)十種 酶和氨基酸，具有養(yǎng)顏、美容、保健等生理功能，是不可多得的上乘佳釀。冰葡萄酒現(xiàn)已成為 世界葡萄酒市場上高端產品的代表。但是，由于受到科學認識的限制，冰葡萄酒一直處于家 庭作坊式和小產業(yè)生產，利用自然發(fā)酵釀造冰葡萄酒，產業(yè)發(fā)展速度極為緩慢。其生產依舊 維持在自然接種、自然發(fā)酵階段，其銷售僅囿于縣域覆蓋范圍之內，因此，對傳統(tǒng)冰葡萄產 業(yè)進行技術升級和標準化生產關鍵技術的研究開發(fā)已迫在眉睫。而冰葡萄酒標準化生產的 關鍵在于冰葡萄酒專用復合發(fā)酵菌劑的開發(fā)，市場所售的果酒等發(fā)酵劑容易使冰葡萄酒原 有的風味淡化，失去當?shù)靥厣酮毺氐娘L味，不能滿足四川高原藏區(qū)冰葡萄酒發(fā)酵。


【發(fā)明內容】

[0003] 本發(fā)明所要解決的技術問題是針對現(xiàn)有技術的不足提供一種川藏高原冰葡萄酒 前期沉釀-中期快速啟動-后期發(fā)酵三級復合發(fā)酵菌劑及其制備方法。
[0004] 本發(fā)明的技術方案如下：
[0005] -種川藏高原冰葡萄酒三級復合發(fā)酵菌劑的制備方法，包括以下步驟：
[0006] (1)酵母菌的擴大培養(yǎng)：將保藏編號：CGMCC6867的酵母菌Pichia manshurica、保 藏編號：CGMCC6866的Pichia anomala接種于培養(yǎng)基中，然后將其置于25°C的搖床中培養(yǎng) 24h，至活菌數(shù)為108cfu/mL，即制得復合酵母菌菌懸液；將擴大培養(yǎng)的混合菌種離心濃縮， 離心轉速為4000r/min，時間為lOmin，得到離心濃縮物1號備用；
[0007] (2)釀酒酵母菌的擴大培養(yǎng)：將釀酒酵母菌Saccharomyces cerevisiae和薛瓦酵 母Saccharomyces chevalieri接種于培養(yǎng)基中，然后將其置于25°C的搖床中培養(yǎng)24h，至 活菌數(shù)為108cfu/mL，即制得復合酵母菌菌懸液；
[0008] (3)將去籽后的冰葡萄果渣經高溫滅菌后，按果渣重量的5% -13%添加所述離心 濃縮物1號和2號，離心濃縮物1號和2號重量比例為：3:2?5:4,放入20-28°C發(fā)酵箱中快 速發(fā)酵l〇-18h，-45?-30°C超低溫冰箱中冷凍10-16h后或者采用二氧化碳干冰瞬間快速 冷凍后，取出放入真空冷凍干燥機中，在冷阱溫度-45?-30°C、物料倉溫度為-30?-35°C 條件下，真空度為〇. 90-0. 95MPa條件干燥24h后取出，經高速粉碎機粉碎后，即得到冰葡萄 酒前期沉釀發(fā)酵菌劑1號備用；
[0009] (4)中期快速發(fā)酵啟動菌劑制備方法：取所述菌種離心濃縮物1號和2號按比例 混合，離心濃縮物1號和2號重量比例為：3:5?4:7,與占離心濃縮物1號和2號混合物量 的7%?10% (W/V，以下百分比皆為W/V)的水溶殼聚糖，3%乳清濃縮蛋白，10%的多孔淀 粉混合而成的包埋劑；或與占離心濃縮物1號和2號混合物量的20%的殼聚糖，8%的乳清 濃縮蛋白，10%的葡萄糖混合而成的包埋劑，即得到冰葡萄酒中期快速啟動發(fā)酵菌劑2號 備用；
[0010] (5)后期發(fā)酵菌劑制備方法：取所述菌種離心濃縮物1號和2號共15?18g和3? 5g的多孔淀粉加入到pH值為5. 0?6. 5的水溶液中，離心濃縮物1號和2號重量比例為： 4:1?2:1 ;振蕩1. 5?2. 5h后加入6?8g的海藻酸鈉后攪拌0. 5?1. 5h，再將5?10mL 的2. 5% CaCl2溶液逐滴加入，固化25?35min后過濾，然后將其加入含有3?7%的醇溶 玉米濃縮蛋白和4%?6%醇溶小麥蛋白的乙醇溶液中，高速1200r/min攪拌1. 0?1. 5h， 將所得混合物放入噴霧裝置內，裝置的進口溫度為83?87°C，出口溫度為61?67°C，所得 后期發(fā)酵菌劑3號備用；
[0011] 將所述前期沉釀發(fā)酵菌劑1號、中期快速啟動發(fā)酵菌劑2號和后期發(fā)酵菌劑3號 按照1:3:1. 5?1:5:3得重量比混合，或者將前期沉釀發(fā)酵菌劑1號單獨真空小包裝，中期 快速啟動發(fā)酵菌劑2號和后期發(fā)酵菌劑3號按照3:2?5:4的重量比混合后真空小包裝， 并將二個小包裝經真空大包裝即成為川藏高原冰葡萄酒前期沉釀-中期快速啟動-后期發(fā) 酵三級復合發(fā)酵菌劑。
[0012] 所述的制備方法，所述步驟（1)中，所述的培養(yǎng)基成分為：1. 8%?2. 3%蛋白胨、 1. 9%?2. 2%葡萄糖、0· 9%?1. 1%酵母粉，ρΗ6· 8?7. 2。
[0013] 所述的制備方法，所述步驟（2)中，所述的培養(yǎng)基中包括4.5?5.5° Β?麥芽汁 1. 0L，瓊脂14. 5?15. 5g，自然pH。將擴大培養(yǎng)的菌種離心濃縮，離心轉速為4000r/min，時 間為lOmin，得到離心濃縮物2號備用。
[0014] 本發(fā)明以 Pichia manshurica (菌種保藏編號：CGMCC6867)、Pichia anomala (異 常畢赤酵母，菌種保藏編號：〔6]\〇^6866)、33(^1131'01115^68〇6^￥18136(釀酒酵母，購買自 中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，CICC1450)和Saccharomyces chevalieri (薛瓦酵母， 購買自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，CICC1424)為主要發(fā)酵菌，采用現(xiàn)代生物技術和 微囊制劑制備技術，制成川藏高原冰葡萄酒前期沉釀-中期快速啟動-后期發(fā)酵三級復合 發(fā)酵菌劑，為冰葡萄酒標準化生產提供了核心技術，填補國內生產空白，這將對我國葡萄與 葡萄酒行業(yè)中高端產品的發(fā)展和適應市場消費需求起到積極的促進作用，符合了現(xiàn)實的地 方特色產業(yè)發(fā)展需要。
[0015] 本發(fā)明的主要特點：（1)采用前期沉釀-中期快速啟動-后期發(fā)酵三級復合發(fā)酵 菌劑使川藏高原冰葡萄酒可以實現(xiàn)工業(yè)化生產，填補國內生產空白。（2)該三級復合發(fā)酵菌 劑所使用的主要菌種是從傳統(tǒng)冰葡萄酒發(fā)酵過程中分離出來的主要功能菌，采用該三級復 合發(fā)酵菌進行冰葡萄酒的發(fā)酵，保持了傳統(tǒng)川藏高原冰葡萄酒的風味和特征。（3)采用不同 性能的材料作為復合菌劑的包埋壁材，從而實現(xiàn)前期沉釀-中期快速啟動-后期發(fā)酵的三 級發(fā)酵。（4)采用該三級復合發(fā)酵菌劑使川藏高原冰葡萄酒發(fā)酵時間縮短25%-35%，生產 效率提高80 % -100%，填補國內生產空白。

【具體實施方式】
[0016] 以下結合具體實施例，對本發(fā)明進行詳細說明。
[0017] 從阿壩州理縣采摘成熟的威代爾冰葡萄進行榨汁處理，用虎紅培養(yǎng)基從葡萄汁中 篩選出生長旺盛且特征明顯的2株菌，通過平板劃線分離出該株菌的單菌落，挑取單菌落 在液體PDA培養(yǎng)液中培養(yǎng)后用甘油保存菌株，放置在_20°C備用。取分離得到的酵母菌株劃 線接種于WL培養(yǎng)基，28°C培養(yǎng)5d，觀察菌落的顏色、形態(tài)、表面是否光滑、邊緣是否整齊等 菌落特征。同時，在顯微鏡下觀察酵母的細胞形態(tài)。以此對分離到的酵母菌株進行初步的形 態(tài)分類。在形態(tài)分類的基礎上，選不同形態(tài)的2株酵母菌（XHU410和XHU411)采用18SrDNA 序列分析法對分離出的菌種進行分子鑒定，測序結果與數(shù)據庫NCBI Blast比對后，再通 過Clustal XI. 8將代表序列與數(shù)據庫中所得序列進行完全比對，確定該兩種酵母菌分別 為 Pichia manshurica(XHU411)和 Pichia anomala(XHU410)，并于 2012 年 11 月 22 日送 交中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（地址：北京市朝陽區(qū)大屯路中國科學 院微生物研究所）保藏，保藏信息分別為：XHU411，分類命名Pichia manshurica，保藏編 號：CGMCC6867 ;XHU410,分類命名：異常畢赤酵母Pichia anomala，保藏編號：CGMCC6866)。
[0018] 酵母菌的擴大培養(yǎng)：將上述兩株酵母菌Pichia manshurica(菌種保藏編 號：CGMCC6867)、Pichia anomala (菌種保藏編號：CGMCC6866)接種于培養(yǎng)基中，然后將其 置于25°C的搖床中培養(yǎng)24h，至活菌數(shù)為108cfu/mL，即制得復合酵母菌菌懸液；所述的培 養(yǎng)基成分為：1. 8%?2. 3%蛋白胨、1. 9%?2. 2%葡萄糖、0. 9%?1. 1%酵母粉，pH6. 8? 7. 2。將擴大培養(yǎng)的混合菌種離心濃縮，離心轉速為4000r/min，時間為lOmin，得到離心濃 縮物1號備用。
[0019] 釀酒酵母菌的擴大培養(yǎng)：將Saccharomyces cerevisiae (釀酒酵母菌，購買自中 國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，CICC1450)和Saccharomyces chevalieri (薛瓦酵母，購 買自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，CICC1424)接種于培養(yǎng)基中，然后將其置于25°C 的搖床中培養(yǎng)24h，至活菌數(shù)為108cfu/mL，即制得復合酵母菌菌懸液；所述的培養(yǎng)基中包括 4. 5?5. 5° Β?麥芽汁1. 0L，瓊脂14. 5?15. 5g，自然pH。將擴大培養(yǎng)的菌種離心濃縮，離 心轉速為4000r/min，時間為10min，得到離心濃縮物2號備用。
[0020] 川藏高原冰葡萄酒前期沉釀-中期快速啟動-后期發(fā)酵三級復合發(fā)酵菌劑中，前 期沉釀發(fā)酵菌劑制備方法：將去籽后的冰葡萄果渣經高溫滅菌后，按果渣重量的5% -13% 添加上述離心濃縮物1號和2號（離心濃縮物1號和2號重量比例為：3:2?5:4)，放入 20-28°C發(fā)酵箱中快速發(fā)酵10_18h，-45?-30°C超低溫冰箱中冷凍10_16h后或者采用二 氧化碳干冰瞬間快速冷凍后，取出放入真空冷凍干燥機中，在冷阱溫度-45?-30°C、物料 倉溫度為-30?-35°C條件下，真空度為0. 90-0. 95MPa條件干燥24h后取出，經高速粉碎機 粉碎后，即得到冰葡萄酒前期沉釀發(fā)酵菌劑1號備用。
[0021] 中期快速發(fā)酵啟動菌劑制備方法：取上述菌種離心濃縮物1號和2號按比例混合 (離心濃縮物1號和2號重量比例為：3:5?4:7)，與占離心濃縮物1號和2號混合物量 的7%?10% (W/V，以下百分比皆為W/V)的水溶殼聚糖，3%乳清濃縮蛋白，10%的多孔淀 粉混合而成的包埋劑；或與占復合酵母菌懸液總量的20%的殼聚糖，8%的乳清濃縮蛋白， 10%的葡萄糖混合而成的包埋劑，即得到冰葡萄酒中期快速啟動發(fā)酵菌劑2號備用。
[0022] 后期發(fā)酵菌劑制備方法：取上述菌種離心濃縮物1號和2號（離心濃縮物1號和 2號重量比例為：4:1?2:1)15?18g，3?5g的多孔淀粉加入到pH值為5.0?6. 5的水 溶液中，振蕩1. 5?2. 5h后加入6?8g的海藻酸鈉后攪拌0. 5?1. 5h，再將5?lOmL的 2. 5% CaCl2溶液逐滴加入，固化25?35min后過濾，然后將其加入含有3?7%的醇溶玉 米醇溶濃縮蛋白和4%?6%醇溶小麥蛋白的乙醇溶液中（乙醇含量為15?18% )，高速 1200r/min攪拌1. 0?1. 5h，采用低溫噴霧干燥法，將上述所得混合物放入噴霧裝置內，裝 置的進口溫度為83?87°C，出口溫度為61?67°C，所得后期發(fā)酵菌劑3號備用。
[0023] -種川藏高原冰葡萄酒前期沉釀-中期快速啟動-后期發(fā)酵三級復合發(fā)酵菌劑及 其制備方法：
[0024] 將上述前期沉釀發(fā)酵菌劑、中期快速啟動發(fā)酵菌劑和后期發(fā)酵菌劑按照 1:3:1. 5?1:5:3 (重量）混合，或者將前期沉釀發(fā)酵菌劑單獨真空小包裝，中期快速啟動發(fā) 酵菌劑和后期發(fā)酵菌劑按照3:2?5:4 (重量）混合后真空小包裝，并將二者經真空大包裝 即成為一種川藏高原冰葡萄酒前期沉釀-中期快速啟動-后期發(fā)酵三級復合發(fā)酵菌劑及其 制備方法。
[0025] 本發(fā)明的采用不同性能的材料作為復合菌劑的包埋壁材，所使用的主要菌種是從 傳統(tǒng)冰葡萄酒發(fā)酵過程中分離出來的主要功能菌，采用先進的現(xiàn)代技術，制備出了前期沉 釀-中期快速啟動-后期發(fā)酵三級復合發(fā)酵菌劑，從而實現(xiàn)前期沉釀-中期快速啟動-后 期發(fā)酵的三級發(fā)酵，并保持了傳統(tǒng)川藏高原冰葡萄酒的風味和特征，使冰葡萄酒發(fā)酵時間 縮短25 % -35 %，生產效率提高80 % -100 %，該復合菌劑使川藏高原冰葡萄酒可以實現(xiàn)工 業(yè)化生產，填補國內生產空白。
[0026] 應用實例：
[0027] 本發(fā)明另一方面提供了一種前期沉釀-中期快速啟動-后期發(fā)酵三級復合發(fā)酵菌 劑生產冰葡萄的釀造工藝。具體工藝流程分為四個階段，（1)冰葡萄原料預處理；（2)加入 復合發(fā)酵菌劑；（3)啟動三級發(fā)酵；（4)后加工處理。
[0028] 冰凍葡萄一采摘、分選一壓榨一葡萄原汁添加 5-7%復合發(fā)酵菌劑一沉釀一澄清 -啟動發(fā)酵一冷凍一后期發(fā)酵一過濾除菌一灌裝一成品冰酒。
[0029] 1)采摘分選
[0030] 延緩葡萄采收期至嚴冬，讓葡萄經過幾次冰凍和解凍的過程。檢測葡萄汁中含糖 量以及總酸含量，當葡萄汁含糖量約為320-360g/L(以葡萄糖計），總酸約為8. 0-12. 0g/ L(以酒石酸計）時進行采摘。采摘分選冰葡萄在_7°C _9°C下進行，采摘過程必須用手工小 心仔細采摘，選擇無生青、病腐果立即壓榨。
[0031] 2)壓榨
[0032] 在壓榨過程中，采用分級控溫連續(xù)壓榨機組進行壓榨，使壓榨溫度嚴格控制在 在-7---iTC。同時，壓榨汁按80mg/L計算添加亞硫酸。
[0033] 3)三級發(fā)酵
[0034] 3. 1菌劑加入
[0035] 在已經壓榨好的冰葡萄原汁中，添加5-7wt%復合發(fā)酵菌劑，啟動前期沉釀過程。
[0036] 3. 2三級發(fā)酵
[0037] 采用三級低溫發(fā)酵方式進行發(fā)酵，一級沉釀發(fā)酵：發(fā)酵溫度為7°C _8°C，發(fā)酵時 間為4-6天，在粉碎的葡萄果皮（可以帶果皮發(fā)酵）下沉的過程中，添加的發(fā)酵菌劑中 的前期沉釀專用的發(fā)酵菌劑，能夠在果皮等沉淀物的下沉過程中啟動發(fā)酵，并每隔2-3h
【權利要求】
1. 一種川藏高原冰葡萄酒三級復合發(fā)酵菌劑的制備方法，其特征在于，包括以下步 驟： (1) 酵母菌的擴大培養(yǎng)：將保藏編號：CGMCC6867的酵母菌Pichia manshurica、保藏編 號：CGMCC6866的Pichia anomala接種于培養(yǎng)基中，然后將其置于25°C的搖床中培養(yǎng)24h， 至活菌數(shù)為108cfu/mL，即制得復合酵母菌菌懸液；將擴大培養(yǎng)的混合菌種離心濃縮，離心 轉速為4000r/min，時間為lOmin，得到離心濃縮物1號備用； (2) 釀酒酵母菌的擴大培養(yǎng)：將釀酒酵母菌Saccharomyces cerevisiae和薛瓦酵母 Saccharomyces chevalieri接種于培養(yǎng)基中，然后將其置于25°C的搖床中培養(yǎng)24h，至活 菌數(shù)為108cfu/mL，即制得復合酵母菌菌懸液； (3) 將去籽后的冰葡萄果渣經高溫滅菌后，按果渣重量的5% -13%添加所述離心濃縮 物1號和2號，離心濃縮物1號和2號重量比例為：3: 2?5:4,放入20-28°C發(fā)酵箱中快速 發(fā)酵10-18h，-45?-30°C超低溫冰箱中冷凍10_16h后或者采用二氧化碳干冰瞬間快速冷 凍后，取出放入真空冷凍干燥機中，在冷阱溫度-45?-30°C、物料倉溫度為-30?-35°C條 件下，真空度為0. 90-0. 95MPa條件干燥24h后取出，經高速粉碎機粉碎后，即得到冰葡萄酒 前期沉釀發(fā)酵菌劑1號備用； (4) 中期快速發(fā)酵啟動菌劑制備方法：取所述菌種離心濃縮物1號和2號按比例混合， 離心濃縮物1號和2號重量比例為：3:5?4:7,與占離心濃縮物1號和2號混合物量的 7 %?10% (W/V，以下百分比皆為W/V)的水溶殼聚糖，3%乳清濃縮蛋白，10%的多孔淀粉 混合而成的包埋劑；或與占離心濃縮物1號和2號混合物量的20%的殼聚糖，8%的乳清濃 縮蛋白，10%的葡萄糖混合而成的包埋劑，即得到冰葡萄酒中期快速啟動發(fā)酵菌劑2號備 用； (5) 后期發(fā)酵菌劑制備方法：取所述菌種離心濃縮物1號和2號共15?18g和3? 5g的多孔淀粉加入到pH值為5. 0?6. 5的水溶液中，離心濃縮物1號和2號重量比例為： 4:1?2:1 ;振蕩1. 5?2. 5h后加入6?8g的海藻酸鈉后攪拌0. 5?1. 5h，再將5?10mL 的2. 5% CaCl2溶液逐滴加入，固化25?35min后過濾，然后將其加入含有3?7%的醇溶 玉米濃縮蛋白和4%?6%醇溶小麥蛋白的乙醇溶液中，高速1200r/min攪拌1. 0?1. 5h， 將所得混合物放入噴霧裝置內，裝置的進口溫度為83?87°C，出口溫度為61?67°C，所得 后期發(fā)酵菌劑3號備用； 將所述前期沉釀發(fā)酵菌劑1號、中期快速啟動發(fā)酵菌劑2號和后期發(fā)酵菌劑3號按照 1:3:1. 5?1:5:3得重量比混合，或者將前期沉釀發(fā)酵菌劑1號單獨真空小包裝，中期快速 啟動發(fā)酵菌劑2號和后期發(fā)酵菌劑3號按照3:2?5:4的重量比混合后真空小包裝，并將 二個小包裝經真空大包裝即成為川藏高原冰葡萄酒前期沉釀-中期快速啟動-后期發(fā)酵三 級復合發(fā)酵菌劑。
2. 根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟（1)中，所述的培養(yǎng)基成分 為：L 8%?2. 3%蛋白胨、L 9%?2. 2%葡萄糖、0· 9%?L 1%酵母粉，ρΗ6· 8?7. 2。
3. 根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟（2)中，所述的培養(yǎng)基中包 括4. 5?5. 5° Β?麥芽汁1. 0L，瓊脂14. 5?15. 5g，自然pH。將擴大培養(yǎng)的菌種離心濃縮， 離心轉速為4000r/min，時間為10min，得到離心濃縮物2號備用。
4. 根據權利要求1或2所述的制備方法制備的川藏高原冰葡萄酒三級復合發(fā)酵菌劑。
【文檔編號】C12N1/18GK104120087SQ201410363460
【公開日】2014年10月29日 申請日期:2014年7月28日 優(yōu)先權日:2013年10月17日
【發(fā)明者】邢亞閣, 許青蓮, 車振明, 羅建峰, 尹燕, 唐渝成, 劉平, 蔣麗, 孫叢珊, 曹東, 張麗珠 申請人:西華大學