專(zhuān)利名稱(chēng)：牛凝血酶的提取分離方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其為牛凝血酶的提取分離方法。
凝血酶是良好的局部止血藥，其療效已被國(guó)內(nèi)外臨床醫(yī)師所認(rèn)可。目前，國(guó)內(nèi)商品凝血酶都是豬凝血酶，尚無(wú)作為藥用的牛凝血酶。在國(guó)外，英、美等國(guó)藥典雖早有牛凝血酶的記載，但工藝全過(guò)程未見(jiàn)系統(tǒng)發(fā)表。
本發(fā)明的目的在于提供一種在常溫下，操作簡(jiǎn)便，成本低，比活力高，適用于工業(yè)化生產(chǎn)的牛凝血酶的提取分離方法，彌補(bǔ)國(guó)內(nèi)在這方面的不足以及便于與國(guó)外同類(lèi)制品的接軌。
本發(fā)明所公開(kāi)的牛凝血酶的提取分離方法是把過(guò)量的枸椽酸鈉加入牛血液中，在常規(guī)離心分離出的抗凝牛血漿中加入BaCl2溶液，用帆布過(guò)濾出沉淀物，經(jīng)壓干、硫酸銨洗脫、鹽析，CM-Sephadex C-50柱層析分離制得牛凝血酶。
提取分離方法如下在牛血液中加0.1mol/L～0.17mol/L枸椽酸鈉溶液，枸椽酸鈉溶液與牛血液的體積比為1∶3～1∶5使之成為抗凝的牛血液。常規(guī)分離出抗凝牛血漿，加入0.5mol/L～2mol/L的BaCl2溶液，BaCl2溶液與抗凝牛血漿的體積比為1∶6～1∶25，BaCl2與抗凝牛血漿中枸椽酸鈉生成枸椽酸鋇進(jìn)而選擇性吸附牛凝血酶原，形成枸椽酸鋇與凝血酶原沉淀。帆布過(guò)濾出沉淀物，壓干，先用40％～45％飽和度的硫酸銨溶液洗脫沉淀中的凝血酶原，再補(bǔ)加硫酸銨使洗脫液中硫酸銨達(dá)65％～70％飽和度，鹽析出凝血酶原，經(jīng)透析去除硫酸銨后，用兔腦粉浸液和CaCl2溶液激活凝血酶原使之轉(zhuǎn)化為具有凝血活性的凝血酶。激活后的牛凝血酶用CM-Sephadex C-50柱層析進(jìn)一步分離純化，得純化的牛凝血酶，收率為28.9u～119.8u/毫升血漿，比活力為1000u/mg～2000u/mg蛋白。
本發(fā)明所提供的牛凝血酶的提取分離方法，避免了在低溫狀態(tài)下使用有機(jī)溶劑和高速連續(xù)離心分離，使操作簡(jiǎn)便，投資小，成本低，適用于工業(yè)生產(chǎn)。
實(shí)施例1.
采集牛血液20000ml，加0.1mol/L的枸椽酸鈉溶液4000ml，常規(guī)離心分離。取離心上層抗凝牛血漿10000ml，加入0.5mol/LBaCl2溶液1600ml，攪拌15分鐘，靜置15分鐘，帆布過(guò)濾沉淀物壓干后加1000ml40％飽和度的硫酸銨溶液，攪拌15分鐘，靜置6小時(shí)，常規(guī)離心分離，取上層液加固體硫酸銨168g，攪拌使之溶解，靜置10小時(shí)，離心分離，得沉淀物，用20ml蒸餾水溶解后裝入透析袋，水透析10小時(shí)，用納氏試劑檢測(cè)內(nèi)液不含硫酸銨，終止透析。在37℃下加入0.25mol/L CaCl2溶液3ml和兔腦粉浸液2ml，保持37℃激活1.5小時(shí)。
激活后的牛凝血酶經(jīng)CM-SephadexC-50柱層析；用0.05mol/L醋酸鈉緩沖液(含0.1mol/L NaCl pH5.0)洗脫至流出液測(cè)OD280值小于0.2后再用0.05mol/L醋酸鈉緩沖液(含0.6mol/L NaCl pH5.0＋0.1)洗脫牛凝血酶。收集凝血酶峰層析液，得純化后的牛凝血酶，收率30u/ml血漿，比活力2000u/mg蛋白。
實(shí)施例2.
原料與試劑牛血液100000ml、0.13mol/L枸椽酸鈉溶液25000ml，取抗凝牛血漿50000ml、1mol/L BaCl2溶液4000ml，40％飽和度的硫酸銨溶液5000ml，硫酸銨粉末840g，蒸餾水100ml，0.25mol/L CaCl2溶液15ml，兔腦粉浸液10ml。
提取分離步驟與操作方法同實(shí)施例1.收率109u/ml血漿，比活力1800u/mg蛋白。
實(shí)施例3.
原料與試劑牛血液200000ml，0.17mol/L枸椽酸鈉溶液66000ml，取抗凝牛血漿100000ml，2mol/L BaCl2溶液4000ml，45％飽和度的硫酸銨溶液10000ml，硫酸銨粉末2100g，蒸餾水200ml，0.25mol/L CaCl2溶液30ml，兔腦粉浸液20ml。
提取分離步驟與操作方法同實(shí)施例1.收率110u/ml血漿，比活力1600u/mg蛋白。
權(quán)利要求
1.牛凝血酶的提取分離方法，其特征在于把過(guò)量的枸椽酸鈉加入牛血液中，在常規(guī)離心分離出的抗凝牛血漿中加入BaCl2溶液，用帆布過(guò)濾出沉淀物，壓干，硫酸銨洗脫、鹽析，后經(jīng)CM-Sephadex C-50柱層析純化。
2.根據(jù)權(quán)利要求1.所述的牛凝血酶的提取分離方法，其特征在于所用枸椽酸鈉的濃度為0.1mol/L～0.17mol/L，枸椽酸鈉溶液與牛血液的體積比為1∶3～1∶5。
3.根據(jù)權(quán)利要求1.所述的牛凝血酶的提取分離方法，其特征在于所用BaCl2溶液濃度為0.5mol/L～2mol/L，BaCl2溶液與抗凝牛血漿的體積比為1∶6～1∶25。
4.根據(jù)權(quán)利要求1.所述的牛凝血酶的提取分離方法，其特征在于用40％～45％飽和度的硫酸銨溶液洗脫，用65％～70％飽和度的硫酸銨鹽析。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其為牛凝血酶的提取分離方法。本發(fā)明所公開(kāi)的牛凝血酶的提取分離方法是把過(guò)量的枸椽酸鈉加入牛血液中，在常規(guī)離心分離出的抗凝牛血漿中加入BaCl
文檔編號(hào)C12N9/74GK1141951SQ96103650
公開(kāi)日1997年2月5日 申請(qǐng)日期1996年4月6日 優(yōu)先權(quán)日1996年4月6日
發(fā)明者文尚武, 李佑漢, 劉國(guó)良, 孔維權(quán), 李曉紅, 劉保山 申請(qǐng)人:濟(jì)南軍區(qū)生物制品藥物研究所, 皖南醫(yī)學(xué)院