專(zhuān)利名稱(chēng)：使用輻射和免疫細(xì)胞因子的癌癥治療的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過(guò)在放射治療后施用免疫細(xì)胞因子(immunocytokine)來(lái)治療腫瘤和癌細(xì)胞的方法。此治療組合可以在照射和非照射部位刺激免疫應(yīng)答，其用于消除已從原發(fā)腫瘤部位擴(kuò)散的癌細(xì)胞。此外，通過(guò)此療法，可以按低于最大耐受劑量的劑量施用免疫細(xì)胞因子，優(yōu)選NHS-IL2 (D20T)和NHS-IL12，這減輕了與免疫細(xì)胞因子療法相關(guān)的副作用。
背景技術(shù)：
疾病如癌癥的有效治療需要一個(gè)或多個(gè)效應(yīng)細(xì)胞類(lèi)型，如天然殺傷(NK)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的有力免疫應(yīng)答。但是，現(xiàn)有的癌癥治療，例如放射治療和化學(xué)療法靶向快速分裂的細(xì)胞，并從而實(shí)際上破壞免疫細(xì)胞。此外，腫瘤自身的環(huán)境是免疫抑制的。為了克服目前的癌癥治療的免疫抑制效應(yīng)，已進(jìn)行了研究來(lái)研究與放射治療組合施用細(xì)胞因子 IL-2。參見(jiàn) Jacobs 等 Q005)，Cancer Immunol. Immunother. ,54 792-798 ；Everse 等(1997)，Int. Τ.Cancer,72 :1003-1007 ；Lam 等(1995)，Tournal of Immunotherapy, 18 (1) :28-34 ；禾口 Jiirgenliemk-SchuIz 等，(1997)，Radiation OncoloRY Investigations, 5力4_61。雖然針對(duì)某些癌癥類(lèi)型觀察到一些應(yīng)答，但在許多情況下，未完全消除腫瘤。在其他情況下，腫瘤可復(fù)發(fā)。此外，某些癌癥類(lèi)型顯示治療后無(wú)改善。此外， 已知IL-2產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用，包括血管滲漏綜合癥(vascular leakage syndrome)，其中流體從血管滲出，引起低血壓、呼吸困難和水腫。因此，需要增加全身免疫應(yīng)答的刺激，同時(shí)最小化由這些治療產(chǎn)生的副作用的改進(jìn)。發(fā)明概述本發(fā)明涉及用于在哺乳動(dòng)物中降低腫瘤或癌細(xì)胞生長(zhǎng)的方法。該方法通過(guò)在照射腫瘤后施用免疫細(xì)胞因子增強(qiáng)便于降低腫瘤生長(zhǎng)的免疫應(yīng)答來(lái)降低腫瘤或癌細(xì)胞生長(zhǎng)。實(shí)施本發(fā)明的一些方法可以減小腫瘤大小、抑制轉(zhuǎn)移、抑制腫瘤再生長(zhǎng)、抑制復(fù)發(fā)、增加平均進(jìn)展時(shí)間(average time to progression)、增加平均存活時(shí)間或促進(jìn)對(duì)治療方案的部分或完全應(yīng)答，該治療方案可以包括其他治療劑或活動(dòng)，如手術(shù)。本發(fā)明還涉及用于批準(zhǔn)施用本發(fā)明的免疫細(xì)胞因子或批準(zhǔn)為施用本發(fā)明的免疫細(xì)胞因子付款的健康護(hù)理商業(yè)方法。本發(fā)明還涉及免疫細(xì)胞因子用途，其通過(guò)在照射腫瘤后用免疫細(xì)胞因子增強(qiáng)便于降低腫瘤生長(zhǎng)的免疫應(yīng)答以降低腫瘤或癌細(xì)胞生長(zhǎng)。本發(fā)明的免疫細(xì)胞因子的一些用途可以減小腫瘤大小、抑制轉(zhuǎn)移、抑制腫瘤再生長(zhǎng)、抑制復(fù)發(fā)、增加平均進(jìn)行時(shí)間、增加平均存活時(shí)間或促進(jìn)對(duì)治療方案的部分或完全應(yīng)答，該治療方案可以包括其他治療劑或活動(dòng)，如手術(shù)。在一方面，本發(fā)明涉及通過(guò)對(duì)具有已經(jīng)照射過(guò)的腫瘤的哺乳動(dòng)物(例如人)施用免疫細(xì)胞因子來(lái)降低腫瘤或癌細(xì)胞生長(zhǎng)的方法。在另一方面，本發(fā)明涉及在多個(gè)位置具有癌細(xì)胞的哺乳動(dòng)物中增強(qiáng)全身免疫應(yīng)答的方法，其包括在已照射部分位置后施用免疫細(xì)胞因子。該照射在照射和非照射位置都增強(qiáng)免疫應(yīng)答。在另一方面，本發(fā)明涉及免疫細(xì)胞因子對(duì)在具有已經(jīng)照射過(guò)的腫瘤的哺乳動(dòng)物 (例如人)中降低腫瘤或癌細(xì)胞生長(zhǎng)的用途。在另一方面，本發(fā)明涉及免疫細(xì)胞因子對(duì)在多個(gè)位置具有癌細(xì)胞的哺乳動(dòng)物中增強(qiáng)全身免疫應(yīng)答的用途，其包括在已照射部分位置后使用免疫細(xì)胞因子。該照射在照射和非照射位置都增強(qiáng)免疫應(yīng)答。在另一方面，本發(fā)明涉及健康護(hù)理方法，其包括批準(zhǔn)對(duì)具有之前照射過(guò)的腫瘤或癌細(xì)胞的哺乳動(dòng)物施用免疫細(xì)胞因子，或批準(zhǔn)對(duì)具有之前照射過(guò)的腫瘤或癌細(xì)胞的哺乳動(dòng)物施用免疫細(xì)胞因子付款。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，施用的輻射(例如Y輻射)劑量是至少I(mǎi)Gy/天、至少2Gy/天或至少3Gy/天。在某些實(shí)施方案中，施用的輻射劑量是每天l_4Gy/天、I-IOGy/ 天、l-20Gy/ 天、2-4Gy/ 天、2-lOGy/ 天、2_20Gy/ 天、3_4Gy/ 天、3-lOGy/ 天或 3_20Gy/ 天。按照本發(fā)明的方法和用途組合輻射和免疫細(xì)胞因子治療的一個(gè)優(yōu)勢(shì)是可以施用更低劑量的免疫細(xì)胞因子，這降低了副作用的可能性。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，按低于免疫細(xì)胞因子最大耐受劑量的劑量施用或使用免疫細(xì)胞因子劑量。在另一實(shí)施方案中，按低于最大耐受劑量的一半、低于最大耐受劑量的三分之一、低于最大耐受劑量的四分之一或低于最大耐受劑量的十分之一的劑量施用或使用免疫細(xì)胞因子。在另一實(shí)施方案中，免疫細(xì)胞因子包括可選地?fù)饺肓艘粋€(gè)或多個(gè)突變?nèi)鏒20T突變的白細(xì)胞介素_2。還在另一實(shí)施方案中，免疫細(xì)胞因子包含白細(xì)胞介素-12。放射治療的次數(shù)及放射治療和施用免疫細(xì)胞因子之間的時(shí)間長(zhǎng)短可根據(jù)本發(fā)明的方法或用途而改變。在一些實(shí)施方案中，在不超過(guò)14天的期間內(nèi)僅在一天照射腫瘤，或在多天照射腫瘤。在某些實(shí)施方案中，該期間是6至8天、4至10天、2至12天或1至14 天。在特定實(shí)施方案中，在該期間的終點(diǎn)后至少2天、4天或6天施用免疫細(xì)胞因子。在另一實(shí)施方案中，在最初對(duì)腫瘤施用輻射的21天、18天、15天、12天或8天內(nèi)施用免疫細(xì)胞因子。在一個(gè)實(shí)施方案中，在最初對(duì)腫瘤施用輻射后至少5天、7天、9天或12天施用免疫細(xì)胞因子。本發(fā)明的實(shí)施方案可以包括將已知的癌癥療法與本發(fā)明的方法組合。在一些實(shí)施方案中，該方法還包括手術(shù)去除至少部分腫瘤、施用其他治療劑或照射腫瘤。本發(fā)明的其他實(shí)施方案可以包括與已知的癌癥治療組合使用免疫細(xì)胞因子。在一些實(shí)施方案中，免疫細(xì)胞因子可以用于具有之前照射過(guò)的腫瘤并已去除至少部分腫瘤的哺乳動(dòng)物中，或與使用其他治療劑組合。實(shí)施和使用本發(fā)明的一些方法可以組合上文定義的兩個(gè)或多個(gè)條件。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，所施用的輻射是至少I(mǎi)Gy/天(例如至少2、至少3、1-4、1-10、1-20、2-4、 2-10、2-20、3-4、3-10或3_20Gy/天)，僅對(duì)哺乳動(dòng)物中的部分癌細(xì)胞位置施用。可以在最初施用輻射的21天內(nèi)(例如18天內(nèi)、15天內(nèi)、12天內(nèi)或8天內(nèi))施用或使用免疫細(xì)胞因子，或可以按低于最大耐受劑量的一半(例如低于三分之一、低于四分之一或低于十分之一)的劑量施用或使用。在另一實(shí)施方案中，所施用的輻射是IGy/天(例如至少2、至少 3、1-4、1-10、1-20、2-4、2-10、2-20、3-4、3-10 或 3_20Gy/天)，并在最初施用輻射的 21 天內(nèi)(例如18天內(nèi)、15天內(nèi)、12天內(nèi)或8天內(nèi))，可選地按低于最大耐受劑量的一半(例如低于三分之一、低于四分之一或低于十分之一)的劑量施用或使用免疫細(xì)胞因子。在另一實(shí)施方案中，所施用的輻射是至少I(mǎi)Gy/天(例如至少2、至少3、1-4、1-10、1-20、2-4、2-10、 2-20、3-4、3-10或3-20Gy/天)，并按低于最大耐受劑量的一半的劑量施用或使用免疫細(xì)胞因子。在另一實(shí)施方案中，僅對(duì)哺乳動(dòng)物中的部分癌細(xì)胞位置施用輻射，并在最初施用輻射的21天內(nèi)(例如18天內(nèi)、15天內(nèi)、12天內(nèi)或8天內(nèi))，可選地按低于最大耐受劑量的一半 (例如低于三分之一、低于四分之一或低于十分之一)的劑量施用或使用免疫細(xì)胞因子。在另一實(shí)施方案中，僅對(duì)哺乳動(dòng)物中的部分癌細(xì)胞位置施用輻射，并按低于最大耐受劑量的一半(例如低于三分之一、低于四分之一或低于十分之一)的劑量施用或使用免疫細(xì)胞因子。在另一實(shí)施方案中，在最初施用輻射的21天內(nèi)(例如18天內(nèi)、15天內(nèi)、12天內(nèi)或8天內(nèi))在具有之前照射過(guò)的腫瘤的哺乳動(dòng)物中施用或使用免疫細(xì)胞因子，且按低于最大耐受劑量的一半(例如低于三分之一、低于四分之一或低于十分之一)的劑量施用免疫細(xì)胞因子。 總結(jié)起來(lái)，本發(fā)明涉及以下實(shí)施方案通過(guò)優(yōu)選降低腫瘤生長(zhǎng)來(lái)治療腫瘤的方法； 或用于這種治療的免疫細(xì)胞因子；或免疫細(xì)胞因子在制備用于此治療的藥物中的用途；包括按至少I(mǎi)Gy/天、優(yōu)選2Gy/天、最優(yōu)選2_20Gy/天的劑量對(duì)具有之前照射過(guò)的腫瘤的哺乳動(dòng)物施用免疫細(xì)胞因子的步驟的方法。通過(guò)優(yōu)選降低腫瘤生長(zhǎng)來(lái)治療腫瘤的方法；或用于這種治療的免疫細(xì)胞因子；或免疫細(xì)胞因子在制備用于此治療的藥物中的用途；包括按至少I(mǎi)Gy/天、優(yōu)選2Gy/天的劑量對(duì)具有之前照射過(guò)的腫瘤的哺乳動(dòng)物施用免疫細(xì)胞因子的步驟的方法，其中在最初對(duì)腫瘤施用輻射的21天內(nèi)，優(yōu)選5-21天內(nèi)施用免疫細(xì)胞因子。通過(guò)優(yōu)選降低腫瘤生長(zhǎng)來(lái)治療腫瘤的方法；或用于這種治療的免疫細(xì)胞因子；或免疫細(xì)胞因子在制備用于此治療的藥物中的用途；包括按至少I(mǎi)Gy/天、優(yōu)選2Gy/天的劑量對(duì)具有之前照射過(guò)的腫瘤的哺乳動(dòng)物施用免疫細(xì)胞因子的步驟的方法，其中在最初對(duì)腫瘤施用輻射后21天內(nèi)，優(yōu)選5-21天和在完成腫瘤的照射或最后的照射治療后1-6天，優(yōu)選2-5天施用免疫細(xì)胞因子。通過(guò)優(yōu)選降低腫瘤生長(zhǎng)來(lái)治療腫瘤的方法；或用于這種治療的免疫細(xì)胞因子；或免疫細(xì)胞因子在制備用于此治療的藥物中的用途；包括按至少I(mǎi)Gy/天、優(yōu)選2Gy/天的劑量對(duì)具有之前照射過(guò)的腫瘤的哺乳動(dòng)物施用免疫細(xì)胞因子的步驟的方法，其中在最初對(duì)腫瘤施用輻射后21天內(nèi)，優(yōu)選5-21天和在完成腫瘤的照射或最后的照射治療后1-6天， 優(yōu)選2-5天，按低于最大耐受劑量，優(yōu)選低于最大耐受劑量的一半，最優(yōu)選低于最大耐受劑量的三分之一或甚至十分之一的免疫細(xì)胞因子劑量，對(duì)具有之前照射過(guò)的腫瘤的哺乳動(dòng)物施用免疫細(xì)胞因子，其中最大耐受劑量定義為在患者中引起嚴(yán)重副作用的免疫細(xì)胞因子劑量。通過(guò)優(yōu)選降低腫瘤生長(zhǎng)來(lái)治療腫瘤的方法；或用于這種治療的免疫細(xì)胞因子；或免疫細(xì)胞因子在制備用于此治療的藥物中的用途；包括按至少I(mǎi)Gy/天、優(yōu)選2Gy/天的劑量在多個(gè)腫瘤細(xì)胞位置對(duì)具有之前照射過(guò)的腫瘤的哺乳動(dòng)物施用免疫細(xì)胞因子的步驟的方法，其中之前僅照射了部分位置，且其中在最初對(duì)腫瘤施用輻射后21天內(nèi)，優(yōu)選5-21天和還在完成腫瘤的照射或最后的照射治療后1-6天，優(yōu)選2-5天，按低于最大耐受劑量，優(yōu)選低于最大耐受劑量的一半，最優(yōu)選低于最大耐受劑量的三分之一或甚至十分之一的劑量，對(duì)具有之前照射過(guò)的腫瘤的哺乳動(dòng)物施用免疫細(xì)胞因子，其中最大耐受劑量定義為在患者中引起嚴(yán)重副作用的免疫細(xì)胞因子劑量。通過(guò)優(yōu)選降低腫瘤生長(zhǎng)來(lái)治療腫瘤的方法；或用于這種治療的免疫細(xì)胞因子；或免疫細(xì)胞因子在制備用于此治療的藥物中的用途；包括對(duì)具有之前在多個(gè)腫瘤細(xì)胞位置照射過(guò)的腫瘤的哺乳動(dòng)物施用免疫細(xì)胞因子的步驟的方法，其中之前僅照射了部分位置，且其中在最初對(duì)腫瘤施用輻射后21天，優(yōu)選5-21天內(nèi)和還在完成腫瘤的照射或最后的照射治療后1-6天，優(yōu)選2-5天施用免疫細(xì)胞因子。通過(guò)優(yōu)選降低腫瘤生長(zhǎng)來(lái)治療腫瘤的方法；或用于這種治療的免疫細(xì)胞因子；或免疫細(xì)胞因子在制備用于此治療的藥物中的用途；包括以下步驟的方法僅在一天按至少lGy、優(yōu)選2Gy、最優(yōu)選2_20Gy 的總劑量一次或分次照射患者中的腫瘤細(xì)胞，然后僅在結(jié)束該輻射后1-21天，優(yōu)選1-6天， 更優(yōu)選2-5天后的一天施用免疫細(xì)胞因子。通過(guò)優(yōu)選降低腫瘤生長(zhǎng)來(lái)治療腫瘤的方法；或用于這種治療的免疫細(xì)胞因子；或免疫細(xì)胞因子在制備用于此治療的藥物中的用途；包括以下步驟的方法僅在一天按至少lGy、優(yōu)選2Gy、最優(yōu)選2_20Gy的總劑量一次或分次照射患者中的腫瘤細(xì)胞，然后在幾天多次施用免疫細(xì)胞因子，其中在結(jié)束該輻射后1-21天，優(yōu)選1-6天，更優(yōu)選2-5天后進(jìn)行最初的施用，在該最初的施用后1-5天，優(yōu)選1-3天進(jìn)行第二次施用和可選地進(jìn)行其他施用?？蛇x地，可以進(jìn)行該多次施用免疫細(xì)胞因子的其他間隔， 其中每個(gè)間隔在3-12周之間。通過(guò)優(yōu)選降低腫瘤生長(zhǎng)來(lái)治療腫瘤的方法；或用于這種治療的免疫細(xì)胞因子；或免疫細(xì)胞因子在制備用于此治療的藥物中的用途；包括以下步驟的方法在不超過(guò)14天的期間內(nèi)按至少lGy、優(yōu)選2Gy、最優(yōu)選2-20Gy的總?cè)談┝恳淮位蚍执握丈浠颊咧械哪[瘤細(xì)胞，然后僅在一天施用免疫細(xì)胞因子，其中在最初照射腫瘤細(xì)胞后不遲于21天和在結(jié)束該多次放射治療后1-6天，優(yōu)選2-5天后進(jìn)行免疫細(xì)胞因子的施用。通過(guò)優(yōu)選降低腫瘤生長(zhǎng)來(lái)治療腫瘤的方法；或用于這種治療的免疫細(xì)胞因子；或免疫細(xì)胞因子在制備用于此治療的藥物中的用途；包括以下步驟的方法在不超過(guò)14天的期間內(nèi)在多天按至少lGy、優(yōu)選2Gy、最優(yōu)選2_20Gy的總?cè)談┝恳淮位蚍执握丈浠颊咧械哪[瘤細(xì)胞，然后在幾天多次施用免疫細(xì)胞因子，其中在最初照射腫瘤細(xì)胞后不遲于21天和在結(jié)束該多次放射治療后1-6天，優(yōu)選2-5天后進(jìn)行最初的免疫細(xì)胞因子施用，在該最初的施用后1-5 天，優(yōu)選1-3天進(jìn)行第二次施用和可選地進(jìn)行其他免疫細(xì)胞因子施用?？蛇x地，可以進(jìn)行該多次施用免疫細(xì)胞因子的其他間隔，其中每個(gè)間隔在3-12周之間。通過(guò)優(yōu)選降低腫瘤生長(zhǎng)來(lái)治療腫瘤的方法；或用于這種治療的免疫細(xì)胞因子；或免疫細(xì)胞因子在制備用于此治療的藥物中的用途；包括以下步驟的方法(i)僅在一天按至少lGy、優(yōu)選2Gy、最優(yōu)選2_20Gy 的總劑量一次或分次照射患者中的腫瘤細(xì)胞，(ii)然后在結(jié)束該輻射后1-21天，優(yōu)選1-6 天，更優(yōu)選2-5天后，僅在一天施用免疫細(xì)胞因子，(iii)然后在步驟(ii)后1-5天，但不超過(guò)輻射步驟(i)后14天，僅在一天按至少lGy、優(yōu)選2Gy、最優(yōu)選2_20Gy的總劑量一次或分次進(jìn)行第二照射步驟，和(iv)然后在結(jié)束該第二輻射后1-21天，優(yōu)選1-6天，更優(yōu)選 2-5天后，僅在一天進(jìn)行第二免疫細(xì)胞因子施用。上文所列的任意方法、用途或免疫細(xì)胞因子的方法、用途或免疫細(xì)胞因子，其中免疫細(xì)胞因子劑量低于具有之前照射過(guò)的腫瘤的哺乳動(dòng)物的最大耐受劑量，優(yōu)選低于最大耐受劑量的一半，最優(yōu)選低于最大耐受劑量的三分之一或甚至十分之一，其中最大耐受劑量定義為在患者中引起嚴(yán)重副作用的免疫細(xì)胞因子劑量。上文所列的任意方法、用途或免疫細(xì)胞因子的對(duì)應(yīng)方法，其中該免疫細(xì)胞因子的細(xì)胞因子部分是IL2、IL2(D20T)或IL12。上文所列的任意方法、用途或免疫細(xì)胞因子的對(duì)應(yīng)方法，其中該免疫細(xì)胞因子是NHS-IL2(D20T)、NHS-IL2、NHS-IL12。上文所列的任意方法、用途或免疫細(xì)胞因子的對(duì)應(yīng)方法，其中之前在多個(gè)腫瘤細(xì)胞位置照射了腫瘤，其中之前僅照射了部分位置。上文所列的任意方法、用途或免疫細(xì)胞因子的對(duì)應(yīng)方法，其中手術(shù)去除了至少部分腫瘤。上文所列的任意方法、用途或免疫細(xì)胞因子的對(duì)應(yīng)方法，其中該輻射是Y照射。在多個(gè)位置具有癌細(xì)胞的哺乳動(dòng)物中增強(qiáng)全身免疫應(yīng)答的方法，該方法包括在照射部分位置后施用免疫細(xì)胞因子的步驟，其中輻射在照射和非照射位置都增強(qiáng)免疫應(yīng)答，且其中按上文所列的方案進(jìn)行照射和免疫細(xì)胞因子施用的組合施用。附圖簡(jiǎn)述


圖1顯示示例性給藥方案，其中輻射“R”和免疫細(xì)胞因子“IC”可以各自作為由間隔1-1分開(kāi)的單劑量施用。圖2顯示示例性給藥方案，其中僅在一天施用輻射“R”，然后在多天施用免疫細(xì)胞因子“IC”。圖3顯示示例性給藥方案，其中在超過(guò)一天施用輻射“R”，然后僅在“IC1” 一天施用免疫細(xì)胞因子“IC”。圖4顯示示例性給藥方案，其中可以在超過(guò)一天施用輻射“R”，然后在超過(guò)一天施用免疫細(xì)胞因子“IC”。圖5顯示示例性給藥方案，其中可以在超過(guò)一天施用輻射“R”，然后在超過(guò)一天施用免疫細(xì)胞因子“IC”，且施用免疫細(xì)胞因子的起點(diǎn)“IC1”可以存在于照射期的終點(diǎn)“R2”之
、r -刖。圖6顯示用化學(xué)輻射(chemoradiation)加NHS_mulL12(空心正方形)、 EMD521873(空心圓)、化學(xué)輻射單獨(dú)(實(shí)心三角形)、NHS_muIL12單獨(dú)(實(shí)心正方形)、 EMD521873單獨(dú)(實(shí)心圓)或?qū)φ罩委煝胖委煹膭?dòng)物中腫瘤大小隨時(shí)間的變化。圖7顯示用免疫細(xì)胞因子NHS-IL12與化學(xué)輻射組合(實(shí)心圓)、EMD521873與化學(xué)輻射組合(空心圓)、無(wú)治療(X)、化學(xué)輻射單獨(dú)(空心正方形)、EMD521873單獨(dú)(空心菱形)或NHS-muIL12單獨(dú)(空心三角形)治療的動(dòng)物中腫瘤大小隨時(shí)間的變化。圖8顯示用化學(xué)輻射加EMD521873 (空心圓)、化學(xué)輻射單獨(dú)(空心三角形)、對(duì)照治療(X)或EMD521873單獨(dú)(空心盒)治療的動(dòng)物中腫瘤大小隨時(shí)間的變化。圖9顯示用lmg/kg EMD521873加化學(xué)輻射(實(shí)心正方形)、5mg/kg EMD521873加化學(xué)輻射(實(shí)心三角形)和15mg/kg EMD521873加化學(xué)輻射(實(shí)心圓)、lmg/kg EMD 521873 單獨(dú)(空心正方形)、5mg/kgEMD521873單獨(dú)(空心三角形)和15mg/kg EMD521873單獨(dú) (空心圓)、化學(xué)輻射單獨(dú)(+)或載體單獨(dú)(_)治療的動(dòng)物中腫瘤大小隨時(shí)間的變化。發(fā)明詳述本發(fā)明的方法提供用于具有一個(gè)或多個(gè)腫瘤的哺乳動(dòng)物的聯(lián)合治療，其包括輻射和免疫細(xì)胞因子施用，并導(dǎo)致增加的免疫應(yīng)答和隨后腫瘤生長(zhǎng)的降低。由于激活全身免疫應(yīng)答，本發(fā)明的方法可用于治療單個(gè)腫瘤、多個(gè)腫瘤(包括非照射腫瘤)或轉(zhuǎn)移灶 (metastase)。放射治療后，可以按低于最大耐受劑量的劑量施用免疫細(xì)胞因子，這是有利的，因?yàn)槭褂酶蛣┝康拿庖呒?xì)胞因子可以導(dǎo)致更少的副作用。放射治療根據(jù)本發(fā)明的方法，可以將輻射與免疫細(xì)胞因子組合施用來(lái)治療癌癥。放射治療通常使用高能離子束或波，如X射線(xiàn)和Y射線(xiàn)，通過(guò)在細(xì)胞的DNA中誘導(dǎo)突變來(lái)消除癌細(xì)胞。癌細(xì)胞比正常細(xì)胞更快地分裂，使得腫瘤組織比正常組織對(duì)輻射敏感。只要病人耐受輻射劑量而無(wú)顯著的副作用，可以對(duì)病人施用任何類(lèi)型的輻射。適宜的放射治療的類(lèi)型包括， 例如電離輻射(例如X射線(xiàn)、Y射線(xiàn)或高線(xiàn)性能輻射)。電離輻射定義為包含具有足夠的能量來(lái)產(chǎn)生電離，即得到或失去電子的粒子或光子的輻射(如例如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，770，581 中所述)。臨床醫(yī)生至少可以部分控制輻射的作用。優(yōu)選將輻射劑量分次來(lái)獲得最大的靶細(xì)胞暴露和降低的毒性。輻射可以與增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞殺傷的輻射敏化劑，或與保護(hù)健康組織免受輻射的有害作用的輻射防護(hù)劑(例如L-I或IL-6)同時(shí)施用。類(lèi)似地，應(yīng)用熱(即體溫過(guò)高(hyperthermia))或化學(xué)療法可以使組織對(duì)輻射敏感。
輻射源可以在患者外部或內(nèi)部。外部放射治療是最常見(jiàn)的，通常涉及用例如線(xiàn)性加速器將高能輻射束(粒子束)經(jīng)皮膚導(dǎo)向腫瘤部位。雖然將輻射束定位至腫瘤部位，但幾乎不可能避免正常健康組織的暴露。但是，患者通常很好地耐受外部輻射。在另一實(shí)例中，用Y射線(xiàn)從外部向患者提供輻射。Y射線(xiàn)是放射性同位素如鈷60 衰變產(chǎn)生的。使用稱(chēng)為“Gamma Knife ”的治療，可以?xún)H將、射線(xiàn)緊密集中于腫瘤組織， 使得損傷非常少的健康組織。另一方面，可以用由粒子加速器產(chǎn)生X射線(xiàn)來(lái)在身體的更大區(qū)域內(nèi)施用輻射。內(nèi)部放射治療涉及將輻射發(fā)射源，如小球、線(xiàn)、片、膠囊等在腫瘤部位或其附近處植入體內(nèi)。所使用的輻射來(lái)自放射性同位素，例如但不限于碘、鍶、磷、鈀、銫、銥、磷酸鹽或鈷。這類(lèi)植入物可以在治療后去除，或無(wú)活性地保留在體內(nèi)。內(nèi)部放射治療的類(lèi)型包括但不限于近距離放射治療(brachytherapy)、間質(zhì)照射和腔內(nèi)照射。目前較不常見(jiàn)的內(nèi)部放射治療的形式涉及放射性同位素的生物學(xué)載體，如放射免疫治療，其中對(duì)患者施用與放射性材料結(jié)合的腫瘤特異性抗體。該抗體結(jié)合腫瘤抗原，從而有效地對(duì)相關(guān)組織施用輻射劑量。將放射治療用作控制原發(fā)腫瘤生長(zhǎng)的方案的組件(參見(jiàn)例如Comphausen等 (2001) “Radiation Therapy to a Primary Tumor Accelerates Metastatic Growth in Mice,，，Cancer Res. 61 :2207-2211)。雖然放射治療單獨(dú)對(duì)破壞或預(yù)防轉(zhuǎn)移灶的效果可以較差，但將輻射與本文所述的免疫細(xì)胞因子組合可以增強(qiáng)放射治療的局部和全身功效。根據(jù)本發(fā)明的方法，可以在具有多個(gè)腫瘤或癌細(xì)胞的哺乳動(dòng)物中對(duì)部分腫瘤或部分癌細(xì)胞施用輻射。在一個(gè)實(shí)施方案中，該部分腫瘤是一個(gè)腫瘤。在已照射了部分位置后，施用免疫細(xì)胞因子。與免疫細(xì)胞因子施用單獨(dú)相比，照射在照射和非照射部位增強(qiáng)了免疫應(yīng)答。因此， 本發(fā)明的方法在治療癌細(xì)胞已在體內(nèi)從一個(gè)或多個(gè)腫瘤擴(kuò)散至其他位置的哺乳動(dòng)物中可以是有效的。由于輻射殺傷免疫效應(yīng)細(xì)胞，輻射的劑量和時(shí)間選擇很重要。照射過(guò)的腫瘤中T 細(xì)胞和樹(shù)突細(xì)胞在照射后立即減少；但是，T細(xì)胞水平反彈至高于基線(xiàn)水平。不論施用方法，可以在一天的過(guò)程中施用完整的輻射劑量。優(yōu)選地，將總劑量分次，并在幾天內(nèi)施用。因此，日輻射劑量可包含約3-20Gy/天，例如至少2、至少3、1-4、1-10、1-20、2-4、2-10、2_20、 3-4、3-10、3-20Gy/天。日劑量可以作為單劑量施用，或可以是在一天的過(guò)程內(nèi)以?xún)刹糠只蚨嗖糠质┯玫摹拔⒎执?microfractionated) ”劑量。在使用內(nèi)部輻射源，例如近距離放射治療或放射免疫治療時(shí)，通常將增加暴露時(shí)間，同時(shí)相應(yīng)地降低輻射強(qiáng)度。如本文所使用，“最初施用輻射”可以是單劑量，或者是在幾天內(nèi)展開(kāi)的一系列照射的開(kāi)始。雖然哺乳動(dòng)物可以已在之前接受了一個(gè)或多個(gè)過(guò)程的放射治療，但“最初的施用”與任何之前的輻射過(guò)程在時(shí)間上是分開(kāi)的。例如，若哺乳動(dòng)物在星期一、星期二和星期三接受輻射，則星期二的輻射將不是“最初的施用”。類(lèi)似地，若哺乳動(dòng)物在每個(gè)星期一、星期三和星期五接受輻射三周，則第一個(gè)星期一可以是“最初的施用”，但第二和第三個(gè)星期一不是。一般而言，最初施用輻射之前7天或多天不接受輻射(例如不接受治療性輻射劑量，如至少I(mǎi)Gy的劑量)。如本文所使用，照射“期間，，具有一個(gè)最初施用輻射，然后在其他一天或多天施用輻射。例如，可以在連續(xù)日(例如星期一、星期二、星期三)、隔日(例如星期一、星期三、星期五)等，或每周2或3或4或5或6次施用輻射。給定的輻射期間將不包含任何7個(gè)連續(xù)的無(wú)輻射日。相反，中斷7天后重新開(kāi)始規(guī)律施用輻射一般將標(biāo)記新的“期間”的開(kāi)始。 免疫細(xì)胞因子如本文所使用，術(shù)語(yǔ)“免疫細(xì)胞因子”理解為意指(i)具有針對(duì)預(yù)先選擇的抗原， 例如細(xì)胞類(lèi)型特異性抗原的結(jié)合特異性，并能夠與之結(jié)合的抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，和(ii)能夠誘導(dǎo)或刺激通常針對(duì)癌細(xì)胞的殺細(xì)胞免疫應(yīng)答的細(xì)胞因子的融合。預(yù)先選擇的抗原的實(shí)例包括如在癌細(xì)胞上的細(xì)胞表面抗原，和與細(xì)胞直接結(jié)合或不結(jié)合的作為腫瘤微環(huán)境特征的其他抗原，如可以分泌或以別的方式釋放或沉積在腫瘤附近的抗原；在腫瘤附近與細(xì)胞外膜結(jié)合的抗原；或結(jié)合與腫瘤接觸和/或浸潤(rùn)腫瘤的非惡性細(xì)胞的抗原。優(yōu)選的抗原是作為腫瘤細(xì)胞特征的靶抗原，如腫瘤特異性抗原。因此，免疫細(xì)胞因子能夠選擇性地遞送細(xì)胞因子至體內(nèi)靶標(biāo)(其通常是細(xì)胞)，使得細(xì)胞因子可以介導(dǎo)針對(duì)靶細(xì)胞的局部免疫應(yīng)答。例如，若免疫細(xì)胞因子的抗體成分選擇性結(jié)合癌細(xì)胞，如實(shí)體瘤，尤其是大于約100mm3的更大的實(shí)體瘤中的癌細(xì)胞上的抗原，則免疫細(xì)胞因子發(fā)揮局部抗癌活性。如本文所使用，術(shù)語(yǔ)“抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域”理解為意指至少部分免疫球蛋白重鏈，例如，能夠結(jié)合預(yù)先選擇的抗原如細(xì)胞類(lèi)型的免疫球蛋白可變區(qū)?？贵w結(jié)合結(jié)構(gòu)域還優(yōu)選包含至少部分免疫球蛋白恒定區(qū)，其包含例如CHl結(jié)構(gòu)域、CH2結(jié)構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域，或至少 CH3結(jié)構(gòu)域，或其一個(gè)或多個(gè)部分。此外，免疫球蛋白重鏈還可以共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合免疫球蛋白輕鏈，該免疫球蛋白輕鏈包含例如免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)和可選地包含輕鏈恒定區(qū)。 因此，考慮抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以包含能夠結(jié)合預(yù)先選擇的抗原的完整抗體或其片段，或單鏈抗體。對(duì)于免疫細(xì)胞因子，考慮可通過(guò)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的多種方式將抗體片段與細(xì)胞因子連接。例如，在融合蛋白質(zhì)構(gòu)建體中，優(yōu)選通過(guò)多肽鍵或接頭將抗體結(jié)合部位連接至細(xì)胞因子。備選地，可以通過(guò)抗體結(jié)合部位和細(xì)胞因子內(nèi)存在的氨基酸側(cè)鏈內(nèi)的反應(yīng)基，例如巰基來(lái)將抗體結(jié)合部位與細(xì)胞因子化學(xué)偶聯(lián)。如本文所使用，術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞因子”理解為意指能夠在哺乳動(dòng)物中刺激或誘導(dǎo)針對(duì)預(yù)先選擇的細(xì)胞類(lèi)型，例如癌細(xì)胞或病毒感染的細(xì)胞的殺細(xì)胞免疫應(yīng)答的任何蛋白質(zhì)或肽，其類(lèi)似物或功能性片段。因此，考慮可將多種細(xì)胞因子摻入本發(fā)明的免疫細(xì)胞因子。 可以摻入本發(fā)明的免疫細(xì)胞因子的細(xì)胞因子包括，例如腫瘤壞死因子、白細(xì)胞介素、集落刺激因子和淋巴因子，以及本領(lǐng)域已知的其他細(xì)胞因子。優(yōu)選的腫瘤壞死因子包括，例如腫瘤壞死因子α (TNFa)0優(yōu)選的白細(xì)胞介素包括，例如白細(xì)胞介素_2 (IL_2)、白細(xì)胞介素-4 (IL-4)、白細(xì)胞介素-5 (IL-5)、白細(xì)胞介素_7 (IL-7)、白細(xì)胞介素-12 (IL-12)、白細(xì)胞介素-15 (IL-15)和白細(xì)胞介素-18 (IL-18)。優(yōu)選的集落刺激因子包括，例如粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)和巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)。優(yōu)選的淋巴因子包括，例如淋巴毒素(LT)。其他有用的細(xì)胞因子包括干擾素，其包含IFN-a、IFN-β和IFN-γ，它們均具有獨(dú)立于其抗病毒活性的免疫學(xué)作用，以及抗血管發(fā)生作用。還可以使用改變形式的細(xì)胞因子。如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)7，186，804中所述，例如，免疫細(xì)胞因子的細(xì)胞因子部分中的突變可以賦予免疫細(xì)胞因子改進(jìn)的特性，如IL-2的D20T突變，相對(duì)于野生型IL-2，該突變提高了改變的IL-2對(duì)其高親和力受體的選擇性，從而降低了其毒性?？梢詮念^克隆、從可用來(lái)源獲得或通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)DNA合成從已知的核苷酸序列合成編碼特定目的細(xì)胞因子的基因。例如，LT的DNA序列是已知的(參見(jiàn)例如Nedwin等(1985)Nucleic Acids Res. 13 :6361)，IL-2 (參見(jiàn)例如 Taniguchi 等(1983)Nature 302 305-318)、GM-CSF (參見(jiàn)例如 Gasson 等(1984) Science 266 :1339-1342)和 TNF α (參見(jiàn)例如 Nedwin 等(1985)Nucleic Acids Res. 13 :6361)的序列也是已知的。在優(yōu)選實(shí)施方案中，免疫細(xì)胞因子是通過(guò)常規(guī)重組DNA方法，即通過(guò)形成編碼嵌合免疫細(xì)胞因子的核酸構(gòu)建體產(chǎn)生的重組融合蛋白質(zhì)?，F(xiàn)有技術(shù)中已描述了重組抗體-細(xì)胞因子融合蛋白質(zhì)的構(gòu)建。參見(jiàn)例如Gillies等(1992) Proc. Natl. Acad. ScL USA 89: 1428-1432 ；Gillies ^ (1998)1. Immunol. 160 :6195-6203 :和美國(guó)專(zhuān)利號(hào) 5, 650, 150。優(yōu)選地，編碼本發(fā)明的免疫細(xì)胞因子的基因構(gòu)建體以5'至3'的取向包含編碼免疫球蛋白重鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)域的DNA區(qū)段、編碼免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)的DNA區(qū)段和編碼細(xì)胞因子的 DNA。將融合基因組裝入或插入表達(dá)載體，該載體用于轉(zhuǎn)染入適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞，融合基因在該受體細(xì)胞中表達(dá)。優(yōu)選將雜合多肽鏈與免疫球蛋白輕鏈組合，使得免疫球蛋白重鏈可變區(qū)(Vh)和免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)組合產(chǎn)生單一且完整的用于結(jié)合預(yù)先選擇的抗原的部位。在優(yōu)選實(shí)施方案中，例如利用鏈間二硫鍵共價(jià)偶聯(lián)免疫球蛋白重鏈和輕鏈。此外，可以例如利用一個(gè)或多個(gè)鏈間二硫鍵共價(jià)偶聯(lián)其中之一或二者都與細(xì)胞因子融合的兩條免疫球蛋白重鏈。因此，本發(fā)明的方法用于增強(qiáng)治療腫瘤的治療性方法中所使用的免疫細(xì)胞因子的抗腫瘤活性，該免疫細(xì)胞因子包含W099/29732、W099/43713、W099/52562、W099/53958和 W001/10912中公開(kāi)的免疫細(xì)胞因子組合物和方法，以及在連接區(qū)中具有改變的氨基酸序列的基于抗體的融合蛋白質(zhì)。由于其結(jié)構(gòu)的兩個(gè)方面，可以認(rèn)為本發(fā)明的免疫細(xì)胞因子是嵌合的。首先，免疫細(xì)胞因子是嵌合的是因?yàn)樗c給定的細(xì)胞因子連接的具有抗原結(jié)合特異性的免疫球蛋白重鏈。其次，從它包含免疫球蛋白可變區(qū)(V)和免疫球蛋白恒定區(qū)(C) (二者都衍生自不同抗體，使得產(chǎn)生的蛋白質(zhì)是ν/c嵌合體)的意義上說(shuō)，本發(fā)明的免疫細(xì)胞因子可以是嵌合的。例如，可變區(qū)和恒定區(qū)可以衍生自可從不同物種分離的天然存在的抗體分子。參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4，816，567。還包含這樣的構(gòu)建體，其中免疫球蛋白可變區(qū)之一或二者都包含衍生自不同物種的構(gòu)架區(qū)(FR)序列和互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)序列。這類(lèi)構(gòu)建體公開(kāi)于例如 Jones 等(1986)Nature 321 :522-525 ；Verhoyen 等(1988) Science 239 :1534-1535 ；和美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，225，539和5，585，089中。此外，考慮可以通過(guò)針對(duì)以所希望的親和力結(jié)合預(yù)先選擇的抗原的可變區(qū)序列篩選文庫(kù)，例如噬菌體展示文庫(kù)來(lái)衍生可變區(qū)序列。用于產(chǎn)生和篩選噬菌體展示文庫(kù)的方法公開(kāi)于例如Huse等(1989) Science 246 1275-1281和Kang 等(1991)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 :11120-11123 中。免疫細(xì)胞因子的免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域可以選自稱(chēng)為IgAdga )、 IgD(IgS), IgE(Ige), IgG(Igy)和IgM(Igy)的五個(gè)免疫球蛋白種類(lèi)的任一種。但是，優(yōu)選來(lái)自IgG種類(lèi)的免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)。此外，考慮免疫球蛋白重鏈可以衍生自在本領(lǐng)域中稱(chēng)為IgGl、IgG2、IgG3和IgG4的IgG抗體亞類(lèi)的任一種。如已知，每個(gè)免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)包含四個(gè)或五個(gè)結(jié)構(gòu)域。將這些結(jié)構(gòu)域依次命名如下CH1-鉸合部-CH2-CH3-(-CH4)。CH4存在于無(wú)鉸鏈區(qū)的IgM中。重鏈結(jié)構(gòu)域的DNA序列在免疫球蛋白種類(lèi)中具有殘余同源，例如IgG的CH2結(jié)構(gòu)域與IgA和IgD的CH2結(jié)構(gòu)域及IgM和IgE的CH3 結(jié)構(gòu)域同源。免疫球蛋白輕鏈可以具有κ或λ恒定區(qū)。這些免疫球蛋白區(qū)域的序列和序列比對(duì)為本領(lǐng)域公知(參見(jiàn)例如Kabat等，〃 Sequences of Proteins of Immunological Interest, " U. S. Department of Health and Human Services,第三版 1983,第四版 1987 ; 和 Huck 等(1986)Nuc. Acids Res. 14 1779-1789)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，可變區(qū)衍生自對(duì)預(yù)先選擇的細(xì)胞表面抗原(與患病的細(xì)胞如癌細(xì)胞或病毒感染的細(xì)胞結(jié)合的抗原)特異的抗體，恒定區(qū)包含源自與作為可變區(qū)來(lái)源的抗體相同或不同的抗體的CHI、CH2和CH3結(jié)構(gòu)域。在本發(fā)明的實(shí)施中，優(yōu)選免疫細(xì)胞因子的抗體部分在預(yù)期的受體中是無(wú)免疫原性的或弱免疫原性的。因此，優(yōu)選抗體部分盡可能多地衍生自與預(yù)期的受體相同的物種。例如，若要對(duì)人施用免疫細(xì)胞因子，則優(yōu)選恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域來(lái)源于人。參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4，816，567。此外，在免疫球蛋白可變區(qū)衍生自預(yù)期的受體以外的物種時(shí)，例如，在可變區(qū)序列來(lái)源于鼠類(lèi)，而預(yù)期的受體是人時(shí)，則優(yōu)選可變區(qū)序列包含人FR序列，將鼠CDR序列插入FR序列之間，以產(chǎn)生具有針對(duì)預(yù)先選擇的抗原的結(jié)合特異性的嵌合可變區(qū)，但同時(shí)最小化在預(yù)期的宿主中的免疫反應(yīng)性。這類(lèi)嵌合可變區(qū)的設(shè)計(jì)和合成公開(kāi)于 Jones 等(1986) Nature 321 :522-525 ；Verhoyen 等(1988) Science 239 :1534-1535 ；和美國(guó)專(zhuān)利號(hào) 5，225，539 和 5，585，089 中。已在 Gillies 等(1998) T. Immunol. 160 :6195-6203中描述了人源化抗體-細(xì)胞因子融合蛋白質(zhì)KS-1/4抗-EpCAM 抗體-IL-12融合蛋白質(zhì)的克隆和表達(dá)，及其消除已建立的結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移灶的能力。直接或利用接頭，例如利用編碼(Gly4-kr) 3接頭的DNA將編碼細(xì)胞因子的基因符合讀框地與編碼免疫球蛋白恒定區(qū)的基因(例如CH2或CH3外顯子)的3'端連接。在某些實(shí)施方案中，接頭可以包含編碼蛋白酶剪切位點(diǎn)的核苷酸序列。在插入免疫球蛋白恒定區(qū)和細(xì)胞因子之間時(shí)，可以設(shè)計(jì)此位點(diǎn)來(lái)在靶部位提供細(xì)胞因子的蛋白酶解釋放。例如， 纖溶酶和胰蛋白酶在蛋白酶可及的位點(diǎn)處在賴(lài)氨酸和精氨酸殘基后切割是公知的。許多其他位點(diǎn)特異性?xún)?nèi)切蛋白酶和它們切割的氨基酸序列為本領(lǐng)域公知。優(yōu)選的蛋白酶剪切位點(diǎn)和與這類(lèi)切割位點(diǎn)反應(yīng)的蛋白酶解酶公開(kāi)于美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，541, 087和5，726，044中。核酸構(gòu)建體可以可選地包含用于可變區(qū)編碼基因的內(nèi)源性啟動(dòng)子和增強(qiáng)子，來(lái)調(diào)節(jié)嵌合免疫球蛋白鏈的表達(dá)。例如，可以作為包含前導(dǎo)肽、用于輕鏈的VJ基因(具有連接 (J)區(qū)段的功能上重排的可變(V)區(qū))或用于重鏈的VDJ基因和用于這些基因的內(nèi)源性啟動(dòng)子和增強(qiáng)子的DNA片段獲得可變區(qū)編碼基因。備選地，可以獲得除內(nèi)源性調(diào)節(jié)元件之外的編碼可變區(qū)的基因，并用于提供了這些元件的表達(dá)載體中?？梢酝ㄟ^(guò)標(biāo)準(zhǔn)DNA克隆方法從產(chǎn)生所希望的抗體的細(xì)胞獲得可變區(qū)基因?？梢杂眠m當(dāng)?shù)腄NA探針，如包含J區(qū)DNA序列和下游序列的DNA區(qū)段來(lái)實(shí)現(xiàn)針對(duì)具體的功能上重排的可變區(qū)的基因組文庫(kù)篩選。通過(guò)測(cè)序所克隆的基因并將序列與對(duì)應(yīng)的正確剪接的mRNA 的全長(zhǎng)序列比較來(lái)達(dá)到正確克隆的鑒定和確認(rèn)。靶抗原可以是腫瘤細(xì)胞、癌細(xì)胞或其他贅生性細(xì)胞的細(xì)胞表面抗原。一般可以從產(chǎn)生免疫球蛋白的淋巴樣細(xì)胞系獲得編碼適當(dāng)?shù)目勺儏^(qū)的基因。例如，可以通過(guò)本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)體細(xì)胞雜交技術(shù)來(lái)制備產(chǎn)生對(duì)腫瘤結(jié)合的抗原或病毒抗原特異的免疫球蛋白的雜交瘤細(xì)胞系(參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4，196，沈5)。這些產(chǎn)生免疫球蛋白的細(xì)胞系以功能上重排的形式提供了可變區(qū)基因的來(lái)源。備選地，可以通過(guò)針對(duì)以所希望的親和力結(jié)合預(yù)先選擇的抗原的可變區(qū)序列篩選文庫(kù)，例如噬菌體展示文庫(kù)來(lái)衍生可變區(qū)序列。用于產(chǎn)生和篩選噬菌體展示文庫(kù)的方法公開(kāi)于例如Huse等(1989) Science 246 :1275-1281和Kang等(1991)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 :11120-11123 中。將編碼在功能上具有活性的可變區(qū)基因的DNA片段與包含編碼所希望的恒定區(qū) (或其部分)的基因的DNA片段連接。可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)基因克隆技術(shù)從產(chǎn)生抗體的細(xì)胞獲得免疫球蛋白恒定區(qū)(重鏈和輕鏈)。已克隆了兩類(lèi)人輕鏈(κ和λ)和五類(lèi)人重鏈(α、δ、 ε、Y和μ)的基因，因此可以容易地從這些克隆獲得人來(lái)源的恒定區(qū)。將編碼雜合免疫球蛋白重鏈的融合基因組裝入或插入用于摻入受體細(xì)胞的表達(dá)載體中?？梢酝ㄟ^(guò)標(biāo)準(zhǔn)基因剪接方法來(lái)實(shí)現(xiàn)將基因構(gòu)建體引入質(zhì)粒載體中?？梢詫⑶逗厦庖咔虻鞍字劓溑c對(duì)應(yīng)的免疫球蛋白輕鏈在同一細(xì)胞中共表達(dá)，使得可以同時(shí)表達(dá)和組裝完整的免疫球蛋白。為了此目的，可以將重鏈和輕鏈構(gòu)建體置于同一載體或分開(kāi)的載體中。受體細(xì)胞系一般是淋巴樣細(xì)胞。優(yōu)選的受體細(xì)胞是骨髓瘤(或雜交瘤)。骨髓瘤可以合成、組裝和分泌由所轉(zhuǎn)染的基因編碼的免疫球蛋白，且它們可以糖基化蛋白質(zhì)。示例性受體或宿主細(xì)胞包括正常情況下不產(chǎn)生內(nèi)源性免疫球蛋白的Sp2/0骨髓瘤和小鼠骨髓瘤NS/0細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染時(shí)，細(xì)胞僅產(chǎn)生由所轉(zhuǎn)染的基因構(gòu)建體編碼的免疫球蛋白。轉(zhuǎn)染的骨髓瘤可以在培養(yǎng)物中或小鼠腹膜中，其中可以從腹水回收所分泌的免疫細(xì)胞因子。可以將其他淋巴樣細(xì)胞如B淋巴細(xì)胞用作受體細(xì)胞。也可以使用非淋巴樣受體細(xì)胞，如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞。存在幾種用包含編碼嵌合免疫球蛋白鏈的核酸構(gòu)建體的載體轉(zhuǎn)染淋巴樣細(xì)胞的方法。例如，可以通過(guò)球芽融合來(lái)將載體引入淋巴樣細(xì)胞(參見(jiàn)例如Gillies等(1989) Biotechnol. 7 =798-804)。其他有用的方法包括電穿孔或磷酸鈣沉淀(參見(jiàn)例如Sambrook 等編輯(1989) “ Molecular Cloning :A Laboratory Manual, " Cold Spring Harbor Press)0其他有用的產(chǎn)生免疫細(xì)胞因子的方法包括編碼構(gòu)建體的RNA序列的制備及其在適當(dāng)?shù)捏w內(nèi)或體外表達(dá)系統(tǒng)中的翻譯。考慮用于合成編碼抗體-細(xì)胞因子融合蛋白質(zhì)的基因、用于將基因引入宿主細(xì)胞、用于在宿主中表達(dá)基因和用于收獲產(chǎn)生的融合蛋白質(zhì)的重組DNA方法是本領(lǐng)域公知和充分記載的。具體流程描述于例如Sambroo等編輯 (1989)" Molecular Cloning :A Laboratory Manual， “ Cold Spring Harbor Press 中。應(yīng)理解，可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的多種方法來(lái)產(chǎn)生化學(xué)偶聯(lián)的免疫細(xì)胞因子。例如，可以用抗體或抗體片段和細(xì)胞因子中的化學(xué)反應(yīng)性氨基酸側(cè)鏈來(lái)將抗體或抗體片段與細(xì)胞因子化學(xué)偶聯(lián)?？梢岳缤ㄟ^(guò)二硫鍵或利用同雙功能或異雙功能交聯(lián)劑來(lái)共價(jià)連接氨基酸側(cè)鏈，該交聯(lián)劑包括例如3 (-2-吡啶基硫基(pyridyylditio))丙酸_N_琥珀酰亞胺、間-馬來(lái)酰亞胺基苯甲?；?N-羥基琥珀酸酯、π7-馬來(lái)酰亞胺基苯甲?；?N-羥基磺基琥珀酰亞胺酯和1，4_ 二-[3' (2'-吡啶基硫基)丙酰胺基]丁烷，它們均可從 Pierce, Rockford, 111 商業(yè)購(gòu)得?？梢酝ㄟ^(guò)任意適宜的手段，直接(例如局部，如通過(guò)注射、植入或局部施用于組織位置)或全身地(例如腸胃外或口服)向哺乳動(dòng)物提供本發(fā)明的方法中使用的組合物。在要經(jīng)腸胃外，如通過(guò)靜脈內(nèi)、皮下、眼、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、口腔、直腸、陰道、眼眶內(nèi)、腦內(nèi)、顱內(nèi)、 脊髓內(nèi)、心室內(nèi)、鞘內(nèi)、池內(nèi)(intracistemal)、囊內(nèi)、鼻內(nèi)或通過(guò)氣溶膠施用來(lái)提供組合物時(shí)，優(yōu)選組合物包含部分水性或生理上相容的流體懸液或溶液。可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員識(shí)別和/或常規(guī)開(kāi)發(fā)制劑。
每次施用的免疫細(xì)胞因子劑量?jī)?yōu)選低于最大耐受劑量。例如，可以按低于最大耐受劑量的一半、低于最大耐受劑量的三分之一、低于最大耐受劑量的四分之一或低于最大耐受劑量的十分之一的劑量施用免疫細(xì)胞因子。最大耐受劑量(MTD)是可以在可接受的毒性水平下施用物質(zhì)的最高劑量。雖然處于可接受的毒性水平，但是按最大耐受劑量施用的物質(zhì)仍然可以產(chǎn)生不希望的副作用。免疫細(xì)胞因子產(chǎn)生的副作用的嚴(yán)重性比細(xì)胞因子單獨(dú)產(chǎn)生的副作用低。但是，已報(bào)道了使用多種免疫細(xì)胞因子的不希望的副作用，包括發(fā)燒、惡心、血管滲漏和低血壓。本發(fā)明的方法允許按低于最大耐受劑量的劑量有效使用免疫細(xì)胞因子，這具有產(chǎn)生更少的副作用的優(yōu)勢(shì)。雖然要施用的劑量將根據(jù)所使用的免疫細(xì)胞因子和其他臨床參數(shù)而改變，但在某些實(shí)施方案中，免疫細(xì)胞因子的劑量在0.01mg/kg 和 20mg/kg 之間，例如至少 0. 03-15mg/kg、0. 03_6mg/kg、0· 03-1. 5mg/kg、0. 03-0. 6mg/kg、 0. 5_20mg/kg、0. 5_15mg/kg、0. 5_10mg/kg、0. 5_6mg/kg、0. 5_5mg/kg 或 0. 5-1. 5mg/kg。所施用的免疫細(xì)胞因子劑量可以在整個(gè)治療過(guò)程中改變。例如，可以按較低的劑量更頻繁地施用細(xì)胞因子許多天、許多周或許多個(gè)月，然后按較高的劑量較不頻繁地施用許多天、許多周或許多個(gè)月。例如，可以每周三天施用約0. 0375-0. 6mg/kg的劑量連續(xù)三周，然后在隨后三周每周一天施用增加至約0. 0375-1. 5mg/kg的劑量?？梢酝ㄟ^(guò)定期的快速濃注或通過(guò)從外部?jī)?chǔ)器(例如從靜脈內(nèi)袋子(intravenous bag))或內(nèi)部(例如從生物可蝕解的植入物)的連續(xù)靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)施用來(lái)施用免疫細(xì)胞因子。但是，考慮可以通過(guò)完全處于本領(lǐng)域技術(shù)水平內(nèi)的常規(guī)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定免疫細(xì)胞因子和輻射的最佳組合、施用模式和劑量。輻射可以殺傷免疫效應(yīng)細(xì)胞。例如，照射過(guò)的腫瘤中T細(xì)胞和樹(shù)突細(xì)胞在照射后立即減少。但是，隨后T細(xì)胞水平反彈至高于基線(xiàn)水平。因此，和與放射治療的時(shí)間選擇有關(guān)的免疫細(xì)胞因子劑量給藥方案很重要。優(yōu)選這樣安排給藥，使得免疫效應(yīng)細(xì)胞在放射治療后的反彈與施用免疫細(xì)胞因子的免疫刺激作用一致。在一個(gè)實(shí)施方案中，在放射治療期間施用免疫細(xì)胞因子。在優(yōu)選實(shí)施方案中，在放射治療后施用免疫細(xì)胞因子。在放射治療期間或優(yōu)選在放射治療后施用免疫細(xì)胞因子產(chǎn)生協(xié)同抗腫瘤作用。在放射治療前施用免疫細(xì)胞因子不能產(chǎn)生在放射治療后施用免疫細(xì)胞因子時(shí)所觀察到協(xié)同抗腫瘤作用。類(lèi)似地，起始免疫細(xì)胞因子施用后將放射治療延長(zhǎng)超過(guò)五天可降低在免疫細(xì)胞因子的施用發(fā)生于放射治療結(jié)束后時(shí)所觀察到的協(xié)同作用。不希望受理論束縛，在免疫細(xì)胞因子施用后，或在一些情況下，在免疫細(xì)胞因子施用期間提供放射治療時(shí)，輻射最初的免疫抑制作用可以鈍化免疫細(xì)胞因子施用的免疫刺激作用。另一方面，免疫細(xì)胞因子施用不應(yīng)發(fā)生在放射治療后太遠(yuǎn)，以致減小協(xié)同作用。如圖1中所示的示例性給藥方案中所示，輻射和免疫細(xì)胞因子可以各自作為單劑量施用。參考圖1，在“R1”天作為單劑量施用輻射“R”。間隔1_1(其可以以小時(shí)或天量度)之后，在“IC1”天作為單劑量施用免疫細(xì)胞因子“IC”。優(yōu)選地，施用輻射和免疫細(xì)胞因子之間的間隔(間隔1-1)在0至21天之間。例如，該間隔(間隔1-1)可以是1至21天， 或2至21天，或2至14天等。此后，可以按適宜的間隔，例如每2周、每3周、每4周、每5 周、每6周、每7周、每8周、每9周、每10周、每11周、每12周等施用單劑量的免疫細(xì)胞因子。示例性給藥方案可以如下。在第1天施用單劑量的輻射，并在第4天開(kāi)始免疫細(xì)胞因子治療周期，其中按3周的間隔施用作為單劑量的免疫細(xì)胞因子。適宜數(shù)目的治療周期，例如5至10個(gè)治療周期后，將給藥間隔增加至例如至多12周的間隔。在另一實(shí)施方案中，如圖2中所示，僅在一天施用輻射，然后在多天施用免疫細(xì)胞因子。參考圖2，在“R1”天作為單劑量施用輻射“R”。間隔2-1(其可以以小時(shí)或天量度) 之后，在“IC1”天開(kāi)始施用免疫細(xì)胞因子“IC”?？梢悦刻?、隔天、每三天、每?jī)芍?、每周、連續(xù)地或按任意其他適宜的時(shí)間表施用免疫細(xì)胞因子，直至施用在“IC2”天終止。例如，可以在連續(xù)2天、連續(xù)3天、連續(xù)4天等每天施用免疫細(xì)胞因子一次。優(yōu)選地，施用輻射和開(kāi)始施用免疫細(xì)胞因子之間的間隔(間隔2-1)是0至21天(例如1至21天之間、2至21天之間、2至14天之間等)。此后，可以按適宜的間隔，例如每2周、每3周、每4周、每5周、每6 周、每7周、每8周、每9周、每10周、每11周、每12周等施用免疫細(xì)胞因子。示例性給藥方案可以如下在第1天施用單劑量的輻射，并在第4天開(kāi)始免疫細(xì)胞因子治療周期，其中按3周的間隔在連續(xù)3天每天施用免疫細(xì)胞因子一次。適宜數(shù)目的治療周期，例如5至10 個(gè)治療周期后，將給藥間隔增加至例如至多12周的間隔。還在另一實(shí)施方案中，如圖3中所示，在多天施用輻射“R”，然后僅在“IC1”一天施用免疫細(xì)胞因子“IC”。優(yōu)選在不超過(guò)14天(例如4-10天)的期間(間隔3-1)內(nèi)施用輻射。可以每天、隔天、每三天、連續(xù)地或按任意其他適宜的時(shí)間表施用輻射，直至施用在“R2” 天終止。例如，可以在連續(xù)3天、在連續(xù)4天、在連續(xù)5天等施用輻射。免疫細(xì)胞因子的施用可以發(fā)生在放射治療的起點(diǎn)“R1”后至少5天(間隔3-2)，例如5天后，6天后等。放射治療的終點(diǎn)“R2”和免疫細(xì)胞因子的施用之間的間隔(間隔3-3)可以是0天或多天，例如 1天、2天等。優(yōu)選地，放射治療的終點(diǎn)“R2”和免疫細(xì)胞因子的施用“IC1”之間的間隔(間隔3-3)是至少2天，例如2天、3天等。此后，可以按適宜的間隔，例如每2周、每3周、每4 周、每5周、每6周、每7周、每8周、每9周、每10周、每11周、每12周等施用單劑量的免疫細(xì)胞因子。示例性給藥方案可以如下。在第-7至-3天連續(xù)5天(第-7、-6、-5、-4和-3 天)施用分次劑量的輻射，并在第1天(3天后)開(kāi)始免疫細(xì)胞因子治療周期，其中按3周的間隔作為單劑量施用免疫細(xì)胞因子。適宜數(shù)目的治療周期，例如5至10個(gè)治療周期后， 將給藥間隔增加至例如至多12周的間隔。在另一實(shí)施方案中，如圖4中所示，可以在超過(guò)一天施用輻射“R”，然后在超過(guò)一天施用免疫細(xì)胞因子“IC”。優(yōu)選地，在不超過(guò)14天(例如4-10天)的期間(間隔4-1)內(nèi)施用輻射?？梢悦刻?、隔天、每三天、連續(xù)地或按任意其他適宜的時(shí)間表施用輻射，直至施用在“R2”天終止。例如，可以在連續(xù)3天、在連續(xù)4天、在連續(xù)5天等施用輻射。施用免疫細(xì)胞因子的起點(diǎn)可以存在于放射治療的起點(diǎn)后至少5天(間隔4-2)，例如5天后，6天后等。 施用免疫細(xì)胞因子的起點(diǎn)可以存在于放射治療的終點(diǎn)后至少1天(間隔4-3)。優(yōu)選地，放射治療的終點(diǎn)“R2”和施用免疫細(xì)胞因子的起點(diǎn)“IC1”之間的間隔(間隔4-3)是至少2天， 例如2天、3天等?？梢悦刻?、隔天、每三天、每?jī)芍堋⒚恐?、連續(xù)地或按任意其他適宜的時(shí)間表施用免疫細(xì)胞因子，直至施用在“IC2”天終止。例如，可以在連續(xù)2天、連續(xù)3天、連續(xù)4 天等每天施用免疫細(xì)胞因子一次。此后，可以按適宜的間隔，例如每2周、每3周、每4周、 每5周、每6周、每7周、每8周、每9周、每10周、每11周、每12周等施用免疫細(xì)胞因子。 示例性給藥方案可以如下在第-7至-3天連續(xù)5天施用分次劑量的輻射，并在第1天開(kāi)始免疫細(xì)胞因子治療周期，其中按3周的間隔在連續(xù)3天每天施用免疫細(xì)胞因子一次。適宜數(shù)目的治療周期，例如5至10個(gè)治療周期后，將給藥間隔增加至例如至多12周的間隔。
在另一實(shí)施方案中，如圖5中所示，可以在超過(guò)一天施用輻射“R”，然后在超過(guò)一天施用免疫細(xì)胞因子“IC”?？梢悦刻?、隔天、每三天、連續(xù)地或按任意其他適宜的時(shí)間表施用輻射，直至施用在R2天終止。優(yōu)選施用輻射的起點(diǎn)“R1”和施用免疫細(xì)胞因子的起點(diǎn) “IC1”之間的間隔(間隔5-1)不超過(guò)14天(例如4-10天)。免疫細(xì)胞因子施用的起點(diǎn) “IC1”可以存在于輻射施用期間的終點(diǎn)“R2”之前?？梢悦刻?、隔天、每三天、每?jī)芍堋⒚恐堋?連續(xù)地或按任意其他適宜的時(shí)間表施用免疫細(xì)胞因子，直至施用在IC2天終止。雖然這些實(shí)施方案描述了包括在輻射后施用免疫細(xì)胞因子的過(guò)程的單次治療，但構(gòu)想可以根據(jù)需要重復(fù)此治療。例如，在第二輪治療中，可以對(duì)相同或不同的腫瘤部位施用輻射和/或隨后可以施用該免疫細(xì)胞因子或不同的免疫細(xì)胞因子。與其他治療的組合可以將發(fā)明的方法與其他治療劑或方法組合進(jìn)行，以在患者中達(dá)到所希望的生物效應(yīng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，在手術(shù)切除腫瘤之前、期間或之后施用藥物組合物。完全手術(shù)去除腫瘤組織通常并發(fā)腫瘤組織侵入周?chē)M織和不確定的團(tuán)塊邊界。如本文所述，用發(fā)明的方法治療腫瘤導(dǎo)致腫瘤縮小，這將便于切除。此外，本發(fā)明的方法的手術(shù)后表現(xiàn)可以消除殘留的腫瘤細(xì)胞。與手術(shù)切除一樣，化學(xué)療法是用于大多數(shù)癌癥類(lèi)型的標(biāo)準(zhǔn)治療。因此，本發(fā)明的方法可以與基于化學(xué)藥品的療法平行、在其之前或在其之后進(jìn)行。常見(jiàn)的化療藥物包括但不限于阿霉素、天冬酰胺酶、博來(lái)霉素、白消安、順鉬、卡鉬、卡莫司汀、希羅達(dá)、苯丁酸氮芥、阿糖胞苷、環(huán)磷酰胺、喜樹(shù)堿、達(dá)卡巴嗪、更生霉素、柔紅霉素、右丙亞胺(dexrazoxane)、多西他賽、羥基紅比霉素、依托泊苷、氟尿苷、氟達(dá)拉濱、氟尿嘧啶、鹽酸吉西他濱、羥基脲、脫甲氧柔紅霉素、異環(huán)磷酰胺、伊立替康、羅氮芥、鹽酸氮芥、巰嘌呤、meplhalan,甲氨喋呤、絲裂霉素、米托坦、米托蒽酮、亞硝基脲、紫杉醇(paclitaxel)、氨羥二磷酸二鈉、噴司他丁、普卡霉素、普魯芐胼、鏈脲菌素、替尼泊苷、硫鳥(niǎo)嘌呤、噻替哌、長(zhǎng)春花堿、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春烯堿、紫杉醇(taxol)、反鉬、5-氟尿嘧啶等。發(fā)明的方法可以伴隨操作體內(nèi)激素水平來(lái)治療疾病的激素療法進(jìn)行。體內(nèi)激素水平以某種方式影響許多癌癥，這樣，與激素療法相關(guān)的典型治療，例如三苯氧胺發(fā)揮作用來(lái)降低循環(huán)激素水平和/或阻止激素與激素受體結(jié)合?？梢詫l(fā)明的方法與單克隆抗體，例如貝伐單抗(Avastin)、西妥昔單抗 (Erbitux)、吉妥珠單抗(Mylotarg)、替伊莫單抗(Zevalin)、馬妥珠單抗和利妥昔單抗 (Rituxin)的施用組合進(jìn)行。單克隆抗體通過(guò)多種機(jī)制發(fā)揮作用。例如，單克隆抗體可以與特異性腫瘤蛋白質(zhì)結(jié)合，并吸引免疫細(xì)胞至腫瘤部位。一些單克隆抗體通過(guò)阻斷否則將允許腫瘤生長(zhǎng)和擴(kuò)散的生長(zhǎng)信號(hào)來(lái)發(fā)揮作用。其他單克隆抗體與放射性粒子或化療藥物結(jié)合，并特異性地將輻射或藥物遞送至腫瘤細(xì)胞。靶組織待用本發(fā)明的方法治療的腫瘤和癌細(xì)胞的類(lèi)型包括實(shí)體瘤的所有類(lèi)型，如與以下癌癥類(lèi)型相關(guān)的實(shí)體瘤肺、頭和勁鱗狀細(xì)胞癌(SCCHN)、胰腺、結(jié)腸、直腸、食管、前列腺、 乳腺、卵巢癌、腎癌、淋巴瘤和黑素瘤。腫瘤可以與口腔和咽、消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、骨骼和關(guān)節(jié)(例如骨轉(zhuǎn)移)、軟組織、皮膚(例如黑素瘤)、乳腺、生殖系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、眼和眼眶、腦和神經(jīng)系統(tǒng)(例如神經(jīng)膠質(zhì)瘤)或內(nèi)分泌系統(tǒng)(例如甲狀腺)的癌癥相關(guān)(即定位于其中)， 且不必是原發(fā)腫瘤。與口腔相關(guān)的組織包括但不限于舌和口組織。癌癥可以出現(xiàn)在包括例如食管、胃、小腸、結(jié)腸、直腸、肛門(mén)、肝、膽囊和胰腺的消化系統(tǒng)組織中。呼吸系統(tǒng)的癌癥可以影響喉、肺和支氣管，且包括例如非小細(xì)胞肺癌。腫瘤可以出現(xiàn)在構(gòu)成雄性和雌性生殖系統(tǒng)的子宮頸、子宮體、卵巢、外陰、陰道、前列腺、睪丸和陰莖中，以及組成泌尿系統(tǒng)的膀胱、 腎、腎盂和輸尿管中腫瘤可以處于任何階段，且可以進(jìn)行其他治療。本發(fā)明的方法用于治療已證明對(duì)其他形式的癌癥療法具有抗性的腫瘤(即破壞腫瘤細(xì)胞或減小腫瘤大小)。腫瘤還可以是任意大小的。理想地，在針對(duì)癌癥治療病人中，本發(fā)明的方法導(dǎo)致腫瘤生長(zhǎng)速率降低、癌性 (腫瘤)細(xì)胞死亡和/或腫瘤大小減小。應(yīng)理解，由于例如支持細(xì)胞、血管形成、纖維基質(zhì)等的存在，在腫瘤大小無(wú)實(shí)質(zhì)性減小的情況下可以發(fā)生腫瘤細(xì)胞死亡。因此，雖然優(yōu)選減小腫瘤大小，但它不是癌癥治療中必需的。優(yōu)選地，本發(fā)明的方法將腫瘤的大小減小至少約5% (例如至少約10%、15%、 20%或25% )。更優(yōu)選地，腫瘤大小減小約30% (例如至少約35%,40%,45%,50%,55%, 60%或65%)。甚至更優(yōu)選地，腫瘤大小減小至少約70% (例如至少約75%、80%、85%、 90%或95%)。最優(yōu)選地，腫瘤徹底消除。但是，如本文所討論，雖然優(yōu)選減小腫瘤大小，但其不是必需的。全部所需是降低腫瘤的生長(zhǎng)速率。例如，腫瘤可以放慢其生長(zhǎng)速率、完全停止生長(zhǎng)、縮小或完全消除。腫瘤生長(zhǎng)速率的任何降低都足以實(shí)現(xiàn)療效。功效的評(píng)估可以以幾種方式測(cè)量本發(fā)明的方法的功效。例如，可以用腫瘤大小、復(fù)發(fā)、存活和免疫應(yīng)答的起始的測(cè)量結(jié)果(例如用基因、蛋白質(zhì)組或細(xì)胞譜分析)來(lái)測(cè)定治療功效?？梢栽谥委熐?、治療期間和治療后進(jìn)行測(cè)量來(lái)檢測(cè)本發(fā)明的方法的效力?？梢栽诨颊叩恼麄€(gè)治療過(guò)程中監(jiān)測(cè)該方法的效力。備選地，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以用下文實(shí)施例部分中所述的動(dòng)物模型或其他適宜的動(dòng)物模型來(lái)測(cè)試免疫細(xì)胞因子與輻射及可選地與其他癌癥治療的哪種組合在協(xié)同作用以增強(qiáng)已建立的腫瘤或癌細(xì)胞的免疫破壞中最有效。此外，由于鑒定了新的免疫細(xì)胞因子，本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠用這些功效測(cè)量來(lái)評(píng)估新的免疫細(xì)胞因子增強(qiáng)輻射的抗癌作用的潛能?？梢员O(jiān)測(cè)復(fù)發(fā)、存活和腫瘤大小來(lái)評(píng)價(jià)本發(fā)明的方法的功效?？梢杂帽绢I(lǐng)域已知的統(tǒng)計(jì)分析來(lái)評(píng)估復(fù)發(fā)和存活?？梢杂帽绢I(lǐng)域已知的許多成像方法來(lái)監(jiān)測(cè)人患者中的腫瘤大小，這些方法包括內(nèi)鏡檢查術(shù)、放射成像(包括X射線(xiàn))、計(jì)算層析X射線(xiàn)照相術(shù)(CT)掃描、磁共振成像(MRI)和核成像?？梢酝ㄟ^(guò)成像方法或通過(guò)測(cè)徑器或容量測(cè)量來(lái)監(jiān)測(cè)治療對(duì)動(dòng)物模型中腫瘤生長(zhǎng)的影響。還可以通過(guò)測(cè)量是否已刺激了免疫應(yīng)答來(lái)測(cè)定本發(fā)明方法的功效?？梢杂枚喾N方法測(cè)量免疫應(yīng)答的起始。在一個(gè)實(shí)例中，可以進(jìn)行基因表達(dá)譜分析來(lái)測(cè)定本發(fā)明的方法是否已刺激了對(duì)免疫功能重要的基因?？梢詫?duì)腫瘤樣品或其他樣品，如淋巴結(jié)樣品或外周血單核細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)譜分析，這些樣品的表達(dá)譜可以指示全身免疫應(yīng)答的存在或缺乏?？梢栽谥委熐?、治療期間和/或治療后從患者采集樣品。在用本方法治療之前和之后，提取來(lái)自所治療的哺乳動(dòng)物的腫瘤組織的RNA，并可以例如通過(guò)定量實(shí)時(shí)PCR來(lái)評(píng)估與免疫應(yīng)答相關(guān)的基因的表達(dá)水平擴(kuò)增從涉及免疫功能的基因轉(zhuǎn)錄的RNA來(lái)測(cè)定表達(dá)在整個(gè)治療過(guò)程中是否提高或降低。在另一實(shí)例中，治療后，可以對(duì)腫瘤進(jìn)行活組織檢查或切除，切片并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的組織學(xué)方法或通過(guò)特異性免疫組織學(xué)試劑染色，以評(píng)估聯(lián)合治療對(duì)免疫應(yīng)答的影響。例如，用蘇木精(hematoxolin)和伊紅簡(jiǎn)單染色可以顯示淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)入實(shí)體瘤中的差異，其是細(xì)胞免疫應(yīng)答的指示。此外，用針對(duì)特定種類(lèi)的免疫細(xì)胞的抗體對(duì)切片進(jìn)行免疫染色可以顯示誘導(dǎo)應(yīng)答的性質(zhì)。例如，可以用與⑶45 ( —般的白細(xì)胞標(biāo)記)、⑶4和⑶8 (用于T細(xì)胞亞類(lèi)鑒定)、⑶25 (淋巴細(xì)胞標(biāo)記)和NKl. 1 (NK細(xì)胞上的標(biāo)記)結(jié)合的抗體來(lái)評(píng)估已通過(guò)本發(fā)明的方法介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的類(lèi)型。此外，可以利用針對(duì)治療中所使用的免疫細(xì)胞因子的抗體來(lái)測(cè)量免疫細(xì)胞因子浸潤(rùn)腫瘤的程度。還可以用熒光激活細(xì)胞分選術(shù)(FACS)分析免疫效應(yīng)細(xì)胞群體來(lái)評(píng)估響應(yīng)本發(fā)明的方法而刺激的免疫應(yīng)答的類(lèi)型和程度。使用本領(lǐng)域公知的方法，將已處理的樣品，如血液樣品暴露于針對(duì)多種免疫細(xì)胞標(biāo)記，如⑶4、⑶8、⑶25、⑶44、⑶62L、⑶lib和D)(5的抗體混合物。用熒光標(biāo)記標(biāo)記各個(gè)種類(lèi)的抗體，該熒光標(biāo)記具有不同于混合物中其他種類(lèi)的抗體的發(fā)射波長(zhǎng)。然后通過(guò)FACS分選儀，如FacsARIA (BDBiosciences)處理樣品，并針對(duì)多個(gè)細(xì)胞亞群進(jìn)行分析。還可以用酶聯(lián)免疫吸附斑點(diǎn)(ELISP0T)測(cè)定來(lái)測(cè)量免疫應(yīng)答的起始。為了測(cè)定是否已刺激了給定的免疫細(xì)胞，將針對(duì)該細(xì)胞激活時(shí)所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，例如細(xì)胞因子的抗體包被在ELISP0T平板上。將來(lái)自用本發(fā)明的方法治療的小鼠的脾細(xì)胞加至平板并孵育。若細(xì)胞被激活，則它們將分泌目的蛋白質(zhì)，且該蛋白質(zhì)將被抗體捕獲。將對(duì)該蛋白質(zhì)的不同表位特異的抗體加至平板。可以用本領(lǐng)域已知的大量標(biāo)記中的任一種來(lái)標(biāo)記這些抗體。通常，抗體帶有生物素標(biāo)記，且還加入鏈霉抗生物素-HRP (辣根過(guò)氧化物酶)。然后測(cè)量標(biāo)記的存在和量來(lái)測(cè)定細(xì)胞在免疫應(yīng)答中激活的程度。備選地，可以通過(guò)例如Lode等(1998)Blood 91 :1706-1715中所述的常規(guī)細(xì)胞亞型排除研究來(lái)評(píng)估本發(fā)明的方法介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的類(lèi)型。排除抗體的實(shí)例包括與T細(xì)胞標(biāo)記⑶4和⑶8反應(yīng)的抗體，以及結(jié)合NK標(biāo)記NKl. 1和脫唾液酸GM的抗體。簡(jiǎn)言之，在開(kāi)始本方法之前按較高的劑量(例如，按約0. 5mg/小鼠的劑量)對(duì)哺乳動(dòng)物注射這些抗體，此后按一周的間隔施用，直至完成實(shí)驗(yàn)。此技術(shù)可以鑒定在哺乳動(dòng)物中引起所觀察到的免疫應(yīng)答必需的細(xì)胞類(lèi)型。在另一種方法中，可以將從已用聯(lián)合治療治療的動(dòng)物分離的脾細(xì)胞的細(xì)胞毒活性與來(lái)自其他治療組的細(xì)胞毒活性相比較。通過(guò)見(jiàn)于大多數(shù)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)中的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)機(jī)械絞碎所回收的無(wú)菌脾臟來(lái)制備脾細(xì)胞培養(yǎng)物。參見(jiàn)例如Coligan等(編輯) (1988) “ Current Protocols in Immunology, " John Wiley & Sons, Inc0 然后在含有血清、抗生素和低濃度IL-2( 10U/mL)的適宜的細(xì)胞培養(yǎng)基(例如來(lái)自GIBCO的DMEM) 中培養(yǎng)產(chǎn)生的細(xì)胞。例如，為了比較NK活性，培養(yǎng)3天通常是最適的，而為了比較T細(xì)胞細(xì)胞毒活性，培養(yǎng)5天通常是最適的?？梢酝ㄟ^(guò)用51Cr對(duì)腫瘤靶細(xì)胞(例如LLC細(xì)胞)進(jìn)行 30分鐘的放射性標(biāo)記來(lái)測(cè)量細(xì)胞毒活性。去除過(guò)量的放射性標(biāo)記后，將標(biāo)記的細(xì)胞與不同濃度的培養(yǎng)的脾細(xì)胞混合4小時(shí)。孵育結(jié)束時(shí)，通過(guò)Y計(jì)數(shù)器測(cè)量從細(xì)胞釋放的51Cr,然后用其來(lái)定量由免疫細(xì)胞誘導(dǎo)的細(xì)胞裂解的程度。以這種方式來(lái)測(cè)量傳統(tǒng)的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(或CTL)活性。批準(zhǔn)治療或?yàn)橹委煾犊畎凑毡景l(fā)明的方法，第三方，例如醫(yī)院、診所、政府實(shí)體、報(bào)銷(xiāo)方、保險(xiǎn)公司(例如健康保險(xiǎn)公司)、ΗΜ0、第三方支付者或支付或報(bào)銷(xiāo)醫(yī)療費(fèi)用的其他實(shí)體可以批準(zhǔn)治療、批準(zhǔn)為治療付款或批準(zhǔn)報(bào)銷(xiāo)治療費(fèi)用。例如，本發(fā)明涉及健康護(hù)理方法，其包括批準(zhǔn)對(duì)具有之前照射過(guò)的腫瘤或癌細(xì)胞的哺乳動(dòng)物施用免疫細(xì)胞因子，或批準(zhǔn)為施用免疫細(xì)胞因子付款或
18報(bào)銷(xiāo)。例如，該健康護(hù)理方法可以包括批準(zhǔn)按至少I(mǎi)Gy/天(例如至少2、至少3、1-4、1-10、 1-20、2-4、2-10、2-20、3-4、3-10或3-20Gy/天)的劑量，對(duì)具有之前照射過(guò)的腫瘤的哺乳動(dòng)物施用免疫細(xì)胞因子，或批準(zhǔn)為施用免疫細(xì)胞因子付款或報(bào)銷(xiāo)。本發(fā)明的健康護(hù)理方法可以包括在將在首次對(duì)腫瘤施用輻射的21天內(nèi)(例如18天內(nèi)、15天內(nèi)、12天內(nèi)或8天內(nèi)) 施用免疫細(xì)胞因子時(shí)批準(zhǔn)施用免疫細(xì)胞因子，或批準(zhǔn)為施用免疫細(xì)胞因子付款或報(bào)銷(xiāo)。在一個(gè)實(shí)施方案中，該健康護(hù)理方法可以包括批準(zhǔn)在放射治療后施用免疫細(xì)胞因子，或批準(zhǔn)為施用免疫細(xì)胞因子付款或報(bào)銷(xiāo)，其中按低于免疫細(xì)胞因子最大耐受劑量的劑量，例如按低于免疫細(xì)胞因子最大耐受劑量的一半、低于免疫細(xì)胞因子最大耐受劑量的三分之一、低于免疫細(xì)胞因子最大耐受劑量的四分之一或低于免疫細(xì)胞因子最大耐受劑量的十分之一的劑量施用免疫細(xì)胞因子。實(shí)施例實(shí)施例1 材料和方法蛋白質(zhì)從NS/0細(xì)胞系產(chǎn)生NHS-IL2LT(也稱(chēng)為Selectikine或EMD521873)并純化。從 NS/0細(xì)胞系產(chǎn)生NHS-muIL12并純化。細(xì)胞轉(zhuǎn)染CD6細(xì)胞(通過(guò)在Balb/C小鼠中直腸內(nèi)注射N(xiāo)-亞硝基_N_甲基氨基甲酸乙酯衍生的鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞系)來(lái)表達(dá)已通過(guò)PCR克隆并用反轉(zhuǎn)錄病毒載體在親本細(xì)胞中表達(dá)(Gillies 1998)的人 KS 抗原(KSA 或 EpCAM)。將 CI^6/KSA 細(xì)胞于 37°C和 7% CO2 下維持在補(bǔ)充了 10%熱滅活的胎牛血清、L-谷氨酰胺、維生素、丙酮酸鈉、非必需氨基酸、青霉素 / 鏈霉素和Geneticin (G418) (Life Technologies, Inc.)的 DMEM 中。加入 G418 來(lái)維持KSA表達(dá)。將和CI^6/KSA細(xì)胞植入雌性Balb/C小鼠。將LL/2(LLC)細(xì)胞(鼠路易斯肺癌細(xì)胞系)于37°C和7% CO2下維持在補(bǔ)充了 10%熱滅活的胎牛血清、L-谷氨酰胺、青霉素/鏈霉素(Life Technologies, Inc.)的DMEM 中。將LLC細(xì)胞植入雌性C57BL/6小鼠。將B16細(xì)胞(鼠黑素瘤細(xì)胞系)于37°C和7%0)2下維持在補(bǔ)充了 10%熱滅活的胎牛血清、L-谷氨酰胺、丙酮酸鈉、非必需氨基酸、青霉素/鏈霉素(Life Technologies, Inc.)的RPMI 1640中。將B16細(xì)胞植入雌性C57BL/6小鼠?；瘜W(xué)品和溶液將EMD521873 配制在 U8mM精氨酸、6mM 檸檬酸、2. 蔗糖、0. 05% Tween 80、pH 6. 0中。用在^Onm下的吸光度和基于已知的蛋白質(zhì)序列的12. 38mg/0D280的理論消光系數(shù)來(lái)測(cè)定稀釋溶液的蛋白質(zhì)濃度。貯存液在4°C下保存小于1個(gè)月。為了對(duì)小鼠施用，從貯存管取出配制的材料的整分試樣，用0. 9%的鹽水稀釋?zhuān)⒃谙♂尯?小時(shí)內(nèi)注射入動(dòng)物。丟棄未使用的稀釋材料。將NHS-muIL12 配制在 50mM 磷酸鈉、150mM 氯化鈉、0. 05% Tween 80、pH 7. 0 中。 為了對(duì)小鼠施用，用0. 9%的鹽水將配制的材料稀釋至0. 5mg/ml。順鉬(順式-二氯化二氨鉬(II))粉末獲自Sigma-Aldrich (目錄號(hào)P4394)。 在0. 9%的鹽水中制備0. 4mg/ml的施用溶液。方法對(duì)于腫瘤生長(zhǎng)測(cè)定，將培養(yǎng)的指數(shù)生長(zhǎng)的細(xì)胞作為在100 μ 1 PBS中的單細(xì)胞懸液肌內(nèi)注射入小鼠前腿。在使用雙腫瘤模型的實(shí)驗(yàn)中，還將細(xì)胞植入小鼠脅腹(flank)。腫瘤建立之后，起始治療(第0天)。在實(shí)驗(yàn)LLC-7中，將腫瘤植入脅腹直至建立。在第0至 9天治療小鼠，然后在第12天用存活手術(shù)切除腫瘤。此后，監(jiān)測(cè)動(dòng)物存活。在實(shí)驗(yàn)LLC-14 中，在脅腹中皮下植入腫瘤直至建立。在第0至6天和第17天治療小鼠，在研究期間每周測(cè)量腫瘤大小兩次。
下表總結(jié)了用于各個(gè)實(shí)驗(yàn)的條件表權(quán)利要求
1.免疫細(xì)胞因子在制備用于治療腫瘤的藥物中的用途，其中腫瘤之前已照射，且所述免疫細(xì)胞因子旨在用于在之前最初輻射所述腫瘤的21天內(nèi)施用。
2.權(quán)利要求1的用途，其中在首次施用所述免疫細(xì)胞因子前8-21天最初照射腫瘤。
3.權(quán)利要求1或2的用途，其中在腫瘤照射的終點(diǎn)之后1至6天后完成首次施用免疫細(xì)胞因子。
4.權(quán)利要求3的用途，其中在腫瘤照射的終點(diǎn)之后2至5天后完成首次施用免疫細(xì)胞因子。
5.權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)的用途，其中在1至14天的期間內(nèi)在多天照射腫瘤。
6.權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)的用途，其中在1至5天的期間內(nèi)在多天施用免疫細(xì)胞因子，從而形成免疫細(xì)胞因子施用的第一個(gè)周期。
7.權(quán)利要求6的用途，其中在第一個(gè)周期的終點(diǎn)之后2至12周后分別安排免疫細(xì)胞因子施用的第二個(gè)周期和其他周期。
8.權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)的用途，其中按至少I(mǎi)Gy/天的劑量一次或分次在一天或幾天照射腫瘤。
9.權(quán)利要求8的用途，其中按l_20Gy/天的劑量照射腫瘤。
10.權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)的用途，其中所述輻射后的免疫細(xì)胞因子劑量低于患者耐受的最大劑量，該患者耐受的最大劑量通過(guò)嚴(yán)重副作用在所述患者中的出現(xiàn)來(lái)定義。
11.權(quán)利要求10的用途，其中免疫細(xì)胞因子劑量低于最大耐受劑量的一半。
12.權(quán)利要求10或11的用途，其中免疫細(xì)胞因子劑量低于lmg/kg體重。
13.權(quán)利要求10或11的用途，其中免疫細(xì)胞因子劑量低于0.5mg/kg體重。
14.權(quán)利要求13的用途，其中免疫細(xì)胞因子劑量是0.lmg/kg至0. 5mg/kg。
15.權(quán)利要求1至14中任一項(xiàng)的用途，其中僅對(duì)部分腫瘤細(xì)胞進(jìn)行腫瘤的照射。
16.權(quán)利要求15的用途，其中腫瘤在體內(nèi)的位置不同于定義的所述部分腫瘤細(xì)胞的位置。
17.權(quán)利要求1至16中任一項(xiàng)的用途，其中所述免疫細(xì)胞因子分子的細(xì)胞因子是 IL-12、IL2 或 IL2(D20T)。
18.權(quán)利要求1至16中任一項(xiàng)的用途，其中免疫細(xì)胞因子是NHS-IL2(D20T)或 NHS-IL12。
19.用于治療腫瘤的免疫細(xì)胞因子，其中腫瘤之前已用l_30Gy/天照射，且免疫細(xì)胞因子旨在用于在之前最初輻射所述腫瘤后21天內(nèi)施用。
20.權(quán)利要求19的免疫細(xì)胞因子，其中在完成腫瘤照射之后1至6天后完成首次施用免疫細(xì)胞因子。
21.權(quán)利要求19或20的免疫細(xì)胞因子，其中在1至14天的期間內(nèi)在多天照射腫瘤。
22.權(quán)利要求19至21中任一項(xiàng)的免疫細(xì)胞因子，其中輻射后的免疫細(xì)胞因子劑量低于患者耐受的最大劑量的一半，該患者耐受的最大劑量通過(guò)嚴(yán)重副作用在所述患者中的出現(xiàn)來(lái)定義。
23.權(quán)利要求19至22中任一項(xiàng)的免疫細(xì)胞因子，其中僅對(duì)不同位置的部分腫瘤細(xì)胞進(jìn)行腫瘤的照射。
24.權(quán)利要求19至23中任一項(xiàng)的免疫細(xì)胞因子，其中免疫細(xì)胞因子分子內(nèi)的細(xì)胞因子是 IL12、IL2 或 IL2(D20T)。
25.權(quán)利要求19至M中任一項(xiàng)的免疫細(xì)胞因子，其中免疫細(xì)胞因子是NHS-IL2(D20T) 或 NHS-IL12。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過(guò)在放射治療后施用免疫細(xì)胞因子來(lái)治療腫瘤和癌細(xì)胞的方法。此治療組合可以在照射和非照射部位刺激免疫應(yīng)答，其用于消除已從原發(fā)腫瘤部位擴(kuò)散的癌細(xì)胞。此外，可以按低于最大耐受劑量的劑量施用免疫細(xì)胞因子，這減輕了與免疫細(xì)胞因子療法相關(guān)的副作用。
文檔編號(hào)A61K38/20GK102196815SQ200980141799
公開(kāi)日2011年9月21日 申請(qǐng)日期2009年10月21日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月21日
發(fā)明者K·J·卡倫, S·A·霍爾登, S·G·克林茲, T·威克姆, U·格納德-福格特 申請(qǐng)人:默克專(zhuān)利有限公司