專利名稱：一種包載紫杉醇的生物可降解納米復(fù)合物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種包載抗腫瘤藥物紫杉醇的生物可降解納米復(fù)合物及其制備方法。
背景技術(shù)：
研究公開了紫杉醇(Paclitaxel)是新型抗微管類的抗腫瘤藥，其通過促進(jìn)紡錘體微管蛋白的聚合而促進(jìn)微管的裝配、抑制解聚、保持微管蛋白穩(wěn)定、抑制細(xì)胞有絲分裂；即使在正常微管裝配所需要的介質(zhì)(如三磷酸鳥苷，GTP)缺失的情況下也可產(chǎn)生上述作 用，從而形成穩(wěn)定的、無功能的微管。體外實(shí)驗(yàn)證明，紫杉醇具有顯著的放射增敏作用，可能是使細(xì)胞中止于對(duì)放療敏感的G2和M期；臨床上主要用于乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌、胰腺癌、軟組織肉瘤、頭頸癌、胃癌、卵巢癌和前列腺癌等。所述紫杉醇結(jié)構(gòu)式為C47H51NO14,分子量853. 91，結(jié)構(gòu)式如下
η η ^ ,
。+1::丄、
.OH P !\V'
0H. J' V-CH3
I [//
O O但是由于紫杉醇的溶解度小于I μ g/mL，目前臨床上僅有兩種PTX制劑；其中泰素(Taxol )制劑是由聚氧乙烯蓖麻油(Cremophor EL)和無水乙醇(50 50, v/v)組成,使用前用生理鹽水或葡萄糖溶液稀釋5 20倍；盡管在一定程度上增加了藥物的溶解度，但給患者卻造成了嚴(yán)重的毒副作用如高過敏性、腎毒性、神經(jīng)毒性、嗜睡、呼吸急促和低血壓等；有研究發(fā)現(xiàn)，另一種市售PTX制劑-PTX白蛋白結(jié)合物(Abraxane)也具有較強(qiáng)的骨髓抑制作用和神經(jīng)毒性，因此PTX新劑型的開發(fā)是一個(gè)亟待解決的問題。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)選擇合適的載體可改善和解決紫杉醇的應(yīng)用缺陷。聚碳酸酯(PTMC)是生物降解醫(yī)用高分子材料的重要分支，系二元碳酸的相應(yīng)聚酯；由于其具有優(yōu)異的生物相容性、力學(xué)性能而應(yīng)用于縫合線等生物醫(yī)用領(lǐng)域。所述PTMC在體內(nèi)或者酶存在的情況下可發(fā)生溶蝕性降解而不產(chǎn)生酸性物質(zhì)，相比其他種類的聚酯具有更好的生物相容性；但是，PTMC疏水性強(qiáng)、降解速率較慢，使其在生物醫(yī)用領(lǐng)域的研究和應(yīng)用受到很大限制。目前已知，將碳酸酯(TMC)與其它含有羥基、羧基等親水性功能團(tuán)的分子共聚結(jié)合，制備兩親性嵌段共聚物，在PTMC原有良好性質(zhì)基礎(chǔ)上提高其親水性，可有效的調(diào)節(jié)PTMC的降解速率，將會(huì)有利于TMC在藥物遞釋方面的應(yīng)用；而聚乙二醇(PEG)是由環(huán)氧乙烷與水或乙二醇逐步加成聚合而得到的一類相對(duì)分子質(zhì)量較低的水溶性聚醚；PEG無毒性，無免疫原性，Mw小于50000的PEG能通過腎被排至體外，不會(huì)在體內(nèi)產(chǎn)生積蓄毒性，具有良好的生物相容性和安全性。有研究指出，將PEG引入TMC中聚合形成的兩親性嵌段共聚物(PEG-PTMC)可提高TMC的親水性，調(diào)節(jié)TMC的降解速率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種紫杉醇的納米復(fù)合物新劑型，具體涉及一種包載抗腫瘤藥物紫杉醇的生物可降解納米復(fù)合物，該納米復(fù)合物能有效地增加紫杉醇的溶解度，且可避免體內(nèi)網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞系統(tǒng)的吞噬，從而提高其在血液中的循環(huán)時(shí)間，控制納米復(fù)合物的粒徑可有效提高紫杉醇的選擇性，實(shí)現(xiàn)腫瘤組織的被動(dòng)靶向，提高紫杉醇的抗腫瘤效果。具體而言，本發(fā)明所述的包載抗腫瘤藥物紫杉醇的生物可降解納米復(fù)合物，以PEG-PTMC共聚物為載體，將紫杉醇包載在PTMC的疏水內(nèi)核中，采用乳化/溶劑蒸發(fā)法，制成紫杉醇PEG-PTMC納米復(fù)合物；該紫杉醇PEG-PTMC納米復(fù)合物能有效地增加紫杉醇的溶解
度，且載體材料的PEG長(zhǎng)鏈可起到“隱形”的作用，避免體內(nèi)網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞系統(tǒng)的吞噬，具有一定的長(zhǎng)循環(huán)效果，從而延長(zhǎng)血液中的半衰期；通過控制紫杉醇PEG-PTMC納米復(fù)合物的粒徑可實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤組織的被動(dòng)靶向作用，從而提高治療效果；所述的紫杉醇PEG-PTMC納米復(fù)合物不含Cremophor EL和乙醇。本發(fā)明中，所述的PEG-PTMC共聚物在藥物遞釋方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，可通過控制嵌段共聚物中的PEG的含量以及共聚物的總分子量，調(diào)節(jié)共聚物的載藥和釋藥特性。所述PEG-PTMC嵌段共聚物在水溶液中可通過疏水力自發(fā)形成具有核殼結(jié)構(gòu)的納米復(fù)合物，該納米復(fù)合物具有疏水嵌段組成的內(nèi)核，使其具有較高的載藥容量，可成為疏水藥物儲(chǔ)庫；其外殼具有柔韌性和親水性，可大大降低納米復(fù)合物被網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞系統(tǒng)識(shí)別和攝取的機(jī)會(huì)，在血液中具有長(zhǎng)循環(huán)的特點(diǎn)；同時(shí)，該納米復(fù)合物粒徑尺度約為納米尺度，從而可通過EPR效應(yīng)在腫瘤組織富集，實(shí)現(xiàn)腫瘤組織的被動(dòng)靶向。另外PEG-PTMC納米復(fù)合物具有一定緩釋作用，能以胞吞的方式進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)釋藥，具有一定的緩釋作用。本發(fā)明的另一目的是提供上述包載抗腫瘤藥物紫杉醇的生物可降解納米復(fù)合物的制備方法。本發(fā)明的包載抗腫瘤藥物紫杉醇的生物可降解納米復(fù)合物的制備方法，其特征在于，其包括步驟(I)將PEG-PTMC共聚物、紫杉醇溶于有機(jī)溶劑中，使PEG-PTMC共聚物和紫杉醇形成均勻的溶液I ;(2)將溶液I加入到含表面活性劑溶液中，冰浴探頭超聲，得到初乳II ；(3)將初乳II加入到低濃度的表面活性劑溶液中，攪拌固化得到乳劑III ；(4)將乳劑III在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)出去有機(jī)溶劑，即制得以PEG-PTMC共聚物為載體的紫杉醇PEG-PTMC納米復(fù)合物制劑IV ；(5)將紫杉醇PEG-PTMC納米復(fù)合物制劑IV，離心，除去表面活性劑，以注射用水重懸，得紫杉醇PEG-PTMC納米復(fù)合物混懸液V ；(6)向紫杉醇PEG-PTMC納米復(fù)合物混懸液V中加入凍干保護(hù)劑，過濾除菌；(7)冷凍干燥除去水分，制得干燥的紫杉醇PEG-PTMC納米復(fù)合物凍干劑。
本發(fā)明中，所述的PEG-PTMC共聚物，即PEGm-PTMCn,其中，m和η分別代表PEG和PTMC在嵌段共聚物中的分子量，m和η為任意大小，m通常為1000，2000，3000，3500，4000等，η通常選用的分子量范圍為3000 30000，所述材料可單獨(dú)或者混合使用；PEG_PTMC共聚物優(yōu)選PEG1000 4000-PTMC3000 30000的共聚物。本發(fā)明中，所述PEG-PTMC與紫杉醇的質(zhì)量比為10 I 1000 I。本發(fā)明所述步驟⑴中有機(jī)溶劑為二氯甲烷、三氯甲烷、四氫呋喃、乙腈、乙醚、丙酮的任意一種，優(yōu)選二氯甲烷或三氯甲烷；所述步驟(I)中PEG-PTMC共聚物和紫杉醇溶解的方法包括攪拌，超聲或者加熱； 使用上述方法可促進(jìn)PEG-PTMC共聚物和紫杉醇充分溶解；所述步驟⑵中探頭超聲功率為100 400W，超聲次數(shù)為10 50次，超聲時(shí)間為I 15S，超聲間隔時(shí)間為I IOS ;所述步驟(3)中表面活性劑溶液為膽酸鈉或聚乙烯醇；初乳固化時(shí)間為Imin IOmin ；所述步驟(4)中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溫度為25 40°C ；所述步驟(5)中離心除去表面活性劑方法為高速離心或超濾離心；其中，高速離心方法轉(zhuǎn)速為10000 30000,離心時(shí)間為15 60min ;超濾離心方法采用的超濾離心管截留分子量為3000 30000，離心時(shí)間為10 120min ；所述步驟(6)中凍干保護(hù)劑為甘露醇、乳糖、蔗糖、海藻糖、葡萄糖、麥芽糖、葡聚糖、氨基酸或聚乙二醇中的任一種，或者它們的混合物，優(yōu)選保護(hù)劑為甘露醇；每100毫升凍干溶液中所需凍干保護(hù)劑的重量在1% 15%,優(yōu)選用量10% ；所述步驟￠)中過濾除菌，為經(jīng)過O. 22 μ m的微孔濾膜過濾除菌。本發(fā)明中，采用所述的制備方法可制備得到載有紫杉醇的PEG-PTMC納米復(fù)合物及其凍干制劑。本發(fā)明利用生物可降解、生物相容性良好的兩親性PEG-PTMC共聚物構(gòu)建納米復(fù)合物，包載紫杉醇在PTMC分子鏈形成的疏水性內(nèi)核中，制備包載紫杉醇的遞釋系統(tǒng)；取制備的紫杉醇的PEG-PTMC納米復(fù)合物適量，滴于銅網(wǎng)上，用2%磷鎢酸負(fù)染，自然干燥后于透射電鏡(TEM)下觀察，結(jié)果如圖I、圖2所示，其粒徑在15 250nm之間。本發(fā)明中，所采用的方法為乳化/溶劑蒸發(fā)法，但并不局限于該方法，也可采用鹽析法、注入法或薄膜分散法制備。本發(fā)明采用MTT法考察包載紫杉醇的PEG-PTMC納米復(fù)合物對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制情況，結(jié)果表明(如圖4、圖5所示)，包載紫杉醇的PEG-PTMC納米復(fù)合物對(duì)腫瘤細(xì)胞顯示出與Taxol相當(dāng)?shù)囊种谱饔?，但空白納米材料比Taxol基質(zhì)Cremophor EL具有更好的生物相容性。本發(fā)明以荷有U87原位瘤的裸鼠為動(dòng)物模型，通過靜脈給予熒光探針DiR標(biāo)記PEG-PTMC納米復(fù)合物，以CRi活體成像儀，觀察納米復(fù)合物的體內(nèi)分布情況和腫瘤部位的被動(dòng)靶向特性，結(jié)果表明(如圖6所示)，靶向納米復(fù)合物在腦腫瘤部位的蓄積明顯高于普通納米復(fù)合物。本發(fā)明以荷有U87原位瘤的裸鼠為動(dòng)物模型，在建模后的第8，10，12天，通過靜脈分別給予等劑量的包載紫杉醇的PEG-PTMC納米復(fù)合物和Taxol注射液，以生理鹽水和空白納米粒作為空白對(duì)照，通過繪制生存曲線考察不同制劑組裸鼠的中位生存期以評(píng)價(jià)不同制劑的藥效，結(jié)果表明(如圖7所示)，包載抗紫杉醇的PEG-PTMC納米復(fù)合物與Taxol比較可顯著延長(zhǎng)荷瘤裸鼠的中位生存期。本發(fā)明的載抗腫瘤藥物紫杉醇的PEG-PTMC納米復(fù)合物及其凍干制劑，與市售的紫杉醇注射劑不同，不需Cremophor EL和乙醇增溶，僅以生物可降解的PEG-PTMC為載體；與市售的紫杉醇注射液相比，所述凍干制劑可降低藥物的毒性，減少藥物的不良反應(yīng)，增加該藥臨床應(yīng)用的安全性；且所述凍干制劑能有效的增加紫杉醇的溶解度，且載體材料含有PEG鏈可起到“隱形”的作用，避免體內(nèi)網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞系統(tǒng)的吞噬，具有一定的長(zhǎng)循環(huán)效果，從而延長(zhǎng)血液中的半衰期；同時(shí)，通過控制其粒徑可實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤組織的被動(dòng)靶向作用，從而提聞治療效果。


圖I為本發(fā)明的紫杉醇PEG-PTMC納米復(fù)合物的透射電鏡照片(X80000)，其中，制 備的紫杉醇PEG-PTMC納米復(fù)合物分散均勻，且無團(tuán)聚現(xiàn)象。圖2為本發(fā)明的紫杉醇PEG-PTMC納米復(fù)合物的粒徑分布圖。圖3為本發(fā)明的紫杉醇PEG-PTMC納米復(fù)合物和紫杉醇的差示掃描熱分析圖，其中，紫杉醇形成在PEG-PTMC納米復(fù)合物后，紫杉醇的吸熱峰消失，表明紫杉醇以分子形式或者固態(tài)溶液的形式分布在納米復(fù)合物中。圖4為本發(fā)明的包載紫杉醇的PEG-PTMC納米復(fù)合物對(duì)U87MG腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制趨勢(shì)圖，其中，結(jié)果表明，載有紫杉醇PEG-PTMC納米復(fù)合物能有效地促進(jìn)U87MG腫瘤細(xì)胞的凋亡，且納米復(fù)合物的濃度越大對(duì)細(xì)胞的凋亡量越大。圖5顯示了本發(fā)明的PEG-PTMC基質(zhì)與Cremophor EL生物相容性比較情況。圖6顯示了本發(fā)明的DiR標(biāo)記的PEG-PTMC納米復(fù)合物，在荷有U87原位瘤的裸鼠體內(nèi)的分布情況和被動(dòng)靶向特性。圖7為本發(fā)明的荷有U87原位瘤的裸鼠在給予紫杉醇不同制劑后的生存曲線圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做詳細(xì)說明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不局限于下述實(shí)施例。實(shí)施例I稱取40mg PEG(1000)-PTMC(6000)共聚物、2mg紫杉醇，加入Iml 二氯甲烷，超聲使載體材料和藥物充分溶解；將所述溶液加到5ml的2%的聚乙烯醇溶液中，冰浴探頭超聲，超聲功率為300W，超聲時(shí)間為5s，超聲間隔時(shí)間為5s，超聲次數(shù)為20次；超聲結(jié)束得到初乳，將該初乳滴加到25ml的I %的聚乙烯醇溶液中，磁力攪拌100r/min,攪拌Imin之后,在37°C下，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去二氯甲烷，即得紫杉醇PEG-PTMC納米復(fù)合物制劑。粒徑測(cè)定結(jié)果顯示，制得PEG-PTMC納米復(fù)合物的平均粒徑為96±28. Inm nm。實(shí)施例2稱取40mg PEG(3000)-PTMC(6000)共聚物、2mg紫杉醇，加入Iml 二氯甲烷，超聲使載體材料和藥物充分溶解；將所述溶液加到5ml的0. 6%的膽酸鈉溶液中，冰浴探頭超聲，超聲功率為300W，超聲時(shí)間為5s，超聲間隔時(shí)間為5s，超聲次數(shù)為20次；超聲結(jié)束得到初乳，將該初乳滴加到25ml的O. 3%的膽酸鈉溶液中，磁力攪拌100r/min，攪拌Imin之后，在37°C下，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去二氯甲烷，即得紫杉醇PEG-PTMC納米復(fù)合物制劑。粒徑測(cè)定結(jié)果顯示,制得PEG-PTMC納米復(fù)合物的平均粒徑為49±8. Inm nm。實(shí)施例3稱取40mg PEG (3000)-PTMC (9000)共聚物、2mg紫杉醇，加入Iml 二氯甲烷，超聲使載體材料和藥物充分溶解；將該溶液加到5ml的O. 6%的膽酸鈉溶液中，冰浴探頭超聲，超聲功率為300W，超聲時(shí)間為5s，超聲間隔時(shí)間為5s，超聲次數(shù)為15次；超聲結(jié)束得到初乳，將該初乳滴加到25ml的O. 3%的膽酸鈉溶液中，磁力攪拌100r/min，攪拌Imin之后，在37°C下，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去二氯甲烷，即得紫杉醇PEG-PTMC納米復(fù)合物制劑。粒徑測(cè)定結(jié)果顯示，制得PEG-PTMC納米復(fù)合物的平均粒徑為79± 18. 8nm nm。
實(shí)施例4稱取50mg PEG (2000)-PTMC (15000)共聚物、2mg紫杉醇，加入Iml 二氯甲烷，超聲使載體材料和藥物充分溶解；將該溶液加到5ml的2%的聚乙烯醇溶液中，冰浴探頭超聲，超聲功率為300W，超聲時(shí)間為5s，超聲間隔時(shí)間為5s，超聲次數(shù)為15次；超聲結(jié)束得到初乳，將該初乳滴加到25ml的I %的聚乙烯醇溶液中，磁力攪拌100r/min,攪拌Imin之后,在37°C下，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去二氯甲烷，即得紫杉醇PEG-PTMC納米復(fù)合物制劑。粒徑測(cè)定結(jié)果顯示，制得PEG-PTMC納米復(fù)合物的平均粒徑為158±30. 5nm nm。實(shí)施例5稱取40mg PEG (3000)-PTMC (12000)共聚物、2mg紫杉醇，加入Iml 二氯甲烷，超聲使載體材料和藥物充分溶解。將該溶液加到5ml的O. 6%的膽酸鈉溶液中，冰浴探頭超聲，超聲功率為300W，超聲時(shí)間為5s，超聲間隔時(shí)間為5s，超聲次數(shù)為15次；超聲結(jié)束得到初乳，將該初乳滴加到25ml的O. 3%的膽酸鈉溶液中，磁力攪拌100r/min，攪拌Imin之后，在37°C下，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去二氯甲烷，即得紫杉醇PEG-PTMC納米復(fù)合物制劑。粒徑測(cè)定結(jié)果顯示，制得PEG-PTMC納米復(fù)合物的平均粒徑為97. 4±21· 5nm nm。實(shí)施例6稱取50mg PEG(3500)-PTMC(6000)共聚物、2mg紫杉醇，加入Iml 二氯甲烷，超聲使載體材料和藥物充分溶解；將該溶液加到5ml的O. 6%的膽酸鈉溶液中，冰浴探頭超聲，超聲功率為300W，超聲時(shí)間為5s，超聲間隔時(shí)間為5s，超聲次數(shù)為20次；超聲結(jié)束得到初乳，將該初乳滴加到25ml的O. 3%的膽酸鈉溶液中，磁力攪拌100r/min，攪拌Imin之后，在37°C下，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去二氯甲烷，即得紫杉醇PEG-PTMC納米復(fù)合物制劑。粒徑測(cè)定結(jié)果顯示，制得PEG-PTMC納米復(fù)合物的平均粒徑為56±9. 8nm nm。實(shí)施例7稱取40mg PEG (4000)-PTMC (30000)共聚物、2mg紫杉醇，加入Iml 二氯甲烷，超聲使載體材料和藥物充分溶解；將該溶液加到5ml的2%的聚乙烯醇溶液中，冰浴探頭超聲，超聲功率為300W，超聲時(shí)間為5s，超聲間隔時(shí)間為5s，超聲次數(shù)為15次；超聲結(jié)束得到初乳，將該初乳滴加到25ml的I %的聚乙烯醇溶液中，磁力攪拌100r/min,攪拌Imin之后,在37°C下，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去二氯甲烷，即得紫杉醇PEG-PTMC納米復(fù)合物制劑。粒徑測(cè)定結(jié)果顯示，制得PEG-PTMC納米復(fù)合物的平均粒徑為223±79. 4nm nm。
實(shí)施例8稱取50mg PEG (3000)-PTMC (30000)共聚物、2mg紫杉醇，加入Iml 二氯甲烷，超聲使載體材料和藥物充分溶解；將該溶液加到5ml的O. 6%的膽酸鈉溶液中，冰浴探頭超聲，超聲功率為300W，超聲時(shí)間為5s，超聲間隔時(shí)間為5s，超聲次數(shù)為15次；超聲結(jié)束得到初乳，將該初乳滴加到25ml的O. 3%的膽酸鈉溶液中，磁力攪拌100r/min，攪拌Imin之后，在37°C下，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去二氯甲烷，即得紫杉醇PEG-PTMC納米復(fù)合物制劑。粒徑測(cè)定結(jié)果顯示，制得PEG-PTMC納米復(fù)合物的平均粒徑為247±30. 3nm nm。實(shí)施例9稱取40mg PEG (3000)-PTMC (6000)共聚物、2mg紫杉醇，加入Iml 二氯甲烷，超聲使載體材料和藥物充分溶解；將該溶液加到5ml的O. 6%的膽酸鈉溶液中，冰浴探頭超聲，超聲功率為200W，超聲時(shí)間為5s，超聲間隔時(shí)間為5s，超聲次數(shù)為15次；超聲結(jié)束得到初 乳，將該初乳滴加到25ml的O. 3%的膽酸鈉溶液中，磁力攪拌100r/min，攪拌Imin之后，在37°C下，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去二氯甲烷，即得紫杉醇PEG-PTMC納米復(fù)合物制劑。粒徑測(cè)定結(jié)果顯示，制得PEG-PTMC納米復(fù)合物的平均粒徑為49. 5±3. lnm。實(shí)施例10稱取40mg PEG (3000)-PTMC (6000)共聚物、2mg紫杉醇，加入Iml 二氯甲烷，超聲使載體材料和藥物充分溶解；將該溶液加到5ml的O. 6%的膽酸鈉溶液中，冰浴探頭超聲，超聲功率為150W，超聲時(shí)間為2s，超聲間隔時(shí)間為5s，超聲次數(shù)為15次；超聲結(jié)束得到初乳，將該初乳滴加到25ml的O. 3%的膽酸鈉溶液中，磁力攪拌100r/min，攪拌Imin之后，在37°C下，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去二氯甲烷，即得紫杉醇PEG-PTMC納米復(fù)合物制劑。粒徑測(cè)定結(jié)果顯示，制得PEG-PTMC納米復(fù)合物的平均粒徑為55± 10. 7nm。實(shí)施例11稱取40mg PEG (3000)-PTMC (6000)共聚物、2mg紫杉醇，加入Iml 二氯甲烷，超聲使載體材料和藥物充分溶解；將該溶液加到5ml的O. 6%的膽酸鈉溶液中，冰浴探頭超聲，超聲功率為200W，超聲時(shí)間為ls，超聲間隔時(shí)間為ls，超聲次數(shù)為30次；超聲結(jié)束得到初乳，將該初乳滴加到25ml的O. 3%的膽酸鈉溶液中，磁力攪拌100r/min，攪拌Imin之后，在37°C下，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去二氯甲烷，即得紫杉醇PEG-PTMC納米復(fù)合物制劑。粒徑測(cè)定結(jié)果顯示，制得PEG-PTMC納米復(fù)合物的平均粒徑為57±23. 5nm。實(shí)施例12稱取40mg PEG (3000)-PTMC (6000)共聚物、2mg紫杉醇，加入Iml 二氯甲烷，超聲使載體材料和藥物充分溶解；將該溶液加到5ml的O. 6%的膽酸鈉溶液中，冰浴探頭超聲，超聲功率為300W，超聲時(shí)間為5s，超聲間隔時(shí)間為5s，超聲次數(shù)為15次；超聲結(jié)束得到初乳，將該初乳滴加到25ml的O. 3%的膽酸鈉溶液中，磁力攪拌100r/min,攪拌Imin之后，在37°C下，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去二氯甲烷，即得紫杉醇PEG-PTMC納米復(fù)合物制劑。4°C，14000r/min，高速離心45min，棄去上清，以注射用水復(fù)懸，加入6%的甘露醇作為凍干保護(hù)劑，過濾除菌，裝于西林瓶中，置冰箱-80°C預(yù)凍過夜，然后放入冷凍干燥機(jī)中凍干48h，得到白色的無塌陷的紫杉醇納米復(fù)合物凍干制劑，該凍干制劑中加入Iml去離子水振搖可在30s內(nèi)完全復(fù)溶。粒徑測(cè)定結(jié)果顯示，凍干復(fù)溶后測(cè)得納米復(fù)合物的平均粒徑為130±37. 2nm。
實(shí)施例13稱取40mg PEG (3000)-PTMC (9000)共聚物、2mg紫杉醇，加入Iml 二氯甲烷，超聲使載體材料和藥物充分溶解；將該溶液加到5ml的O. 6%的膽酸鈉溶液中，冰浴探頭超聲，超聲功率為300W，超聲時(shí)間為5s，超聲間隔時(shí)間為5s，超聲次數(shù)為15次；超聲結(jié)束得到初乳，將該初乳滴加到25ml的O. 3%的膽酸鈉溶液中，磁力攪拌100r/min，攪拌Imin之后，在37°C下，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去二氯甲烷，即得紫杉醇PEG-PTMC納米復(fù)合物制劑；4°C，4000r/min，以截留分子量為3000的超濾離心管離心30min，棄去上清，以注射用水復(fù)懸，加入10%的乳糖作為凍干保護(hù)劑，過濾除菌，裝于西林瓶中， 置冰箱_80°C預(yù)凍過夜，然后放入冷凍干燥機(jī)中凍干48h，得到白色的無塌陷的紫杉醇納米復(fù)合物凍干制劑，該凍干制劑加入Iml去離子水振搖可在30s內(nèi)完全復(fù)溶。粒徑測(cè)定結(jié)果顯示，凍干復(fù)溶后測(cè)得納米復(fù)合物的平均粒徑為243±68. 3nm。實(shí)施例14包載紫杉醇PEG-PTMC納米復(fù)合物對(duì)U87MG腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)。將U87MG細(xì)胞以O(shè). 25%的胰蛋白酶消化，每孔IO4細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板。37°C下，5% CO2條件下培養(yǎng)24h ;然后棄去培養(yǎng)液，加入一定濃度的紫杉醇溶液(Taxol溶液)、包載紫杉醇PEG-PTMC納米復(fù)合物，繼續(xù)孵育72h。待孵育結(jié)束，棄去培養(yǎng)液，加入5mg/ml的MTT試劑，37°C下繼續(xù)孵育4h。待孵育結(jié)束，棄去MTT溶液，每孔加入DMSO溶劑200 μ I溶解甲臢沉淀，輕輕振搖Imin,以酶聯(lián)免疫儀在570nm測(cè)定OD值，計(jì)算細(xì)胞抑制率。結(jié)果表明包載抗腫瘤藥物紫杉醇的PEG-PTMC納米復(fù)合物對(duì)腫瘤細(xì)胞顯示出與Taxol相當(dāng)?shù)囊种谱饔?，但是空白納米材料比Taxol的基質(zhì)Cremophor EL具有更好的生物相容性。實(shí)施例15取含有5 X IO5個(gè)U87 MG細(xì)胞的懸液種植與雄性balb/c裸鼠的腦紋狀體中，在植瘤后的第8，10，12天，通過靜脈分別給予等劑量的包載抗腫瘤藥物紫杉醇的PEG-PTMC納米復(fù)合物和Taxol制劑，以生理鹽水和空白納米材料作為空白對(duì)照，通過繪制生存去曲線考察不同制劑組裸鼠的中位生存期以評(píng)價(jià)不同制劑的藥效。結(jié)果表明，包載抗腫瘤藥物紫杉醇的PEG-PTMC納米復(fù)合物與Taxol比較可顯著延長(zhǎng)荷瘤裸鼠的中位生存期。
權(quán)利要求
1.一種包載抗腫瘤藥物紫杉醇的生物可降解納米復(fù)合物，其特征在于，以PEG-PTMC共聚物為載體，紫杉醇包載在PTMC的疏水內(nèi)核中；所述的PEG-PTMC共聚物選自PEG1000 4000-PTMC3000 30000的共聚物，所述PEG-PTMC與紫杉醇的質(zhì)量比為10 I 1000 I。
2.按權(quán)利要求I所述的包載抗腫瘤藥物紫杉醇的生物可降解納米復(fù)合物，其特征在于，所述納米復(fù)合物不含Cremophor EL和乙醇。
3.一種包載抗腫瘤藥物紫杉醇的生物可降解納米復(fù)合物的制備方法，其特征在于，其包括步驟 (1)將PEG-PTMC共聚物、紫杉醇溶于有機(jī)溶劑中，使PEG-PTMC共聚物和紫杉醇形成均勻的溶液I ; (2)將溶液I加入到表面活性劑溶液中，冰浴探頭超聲，得到初乳II； (3)將初乳II加入到低濃度的表面活性劑溶液中，攪拌固化得到乳劑III； (4)將乳劑III旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)出去有機(jī)溶劑，即制得以PEG-PTMC共聚物為載體的紫杉醇PEG-PTMC納米復(fù)合物制劑IV ； (5)將紫杉醇PEG-PTMC納米復(fù)合物制劑IV，離心，除去表面活性劑，以注射用水重懸，得紫杉醇PEG-PTMC納米復(fù)合物混懸液V ； (6)向紫杉醇PEG-PTMC納米復(fù)合物混懸液V中加入凍干保護(hù)劑，過濾除菌； (7)冷凍干燥除去水分，制得干燥的紫杉醇PEG-PTMC納米復(fù)合物凍干劑。
4.按權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述步驟(I)中有機(jī)溶劑選自二氯甲烷、三氯甲烷、四氫呋喃、乙腈、乙醚或丙酮。
5.按權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(I)中有機(jī)溶劑選自二氯甲烷或三氯甲烷。
6.按權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述步驟(I)中采用攪拌，超聲或者加熱的方法溶解PEG-PTMC共聚物和紫杉醇。
7.按權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中探頭超聲功率為100 400W，超聲次數(shù)為10 50次，超聲時(shí)間為I 15S，超聲間隔時(shí)間為I 10S。
8.按權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)中表面活性劑溶液為膽酸鈉或聚乙烯醇；初乳固化時(shí)間為Imin lOmin。
9.按權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述步驟(4)中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溫度為25 40°C。
10.按權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述步驟(5)中采用高速離心或超濾離心除去表面活性劑；其中，高速離心方法中，轉(zhuǎn)速為10000 30000，離心時(shí)間為15 60min ；超濾離心方法中，超濾離心管截留分子量為3000 30000，離心時(shí)間為10 120min。
11.按權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述步驟(6)中凍干保護(hù)劑選自甘露醇、乳糖、蔗糖、海藻糖、葡萄糖、麥芽糖、葡聚糖、氨基酸或聚乙二醇中的任一種，或者它們的混合物。
12.按權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述步驟(6)中凍干保護(hù)劑為甘露醇。
13.按權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述步驟(6)中，每100毫升凍干溶液中所需凍干保護(hù)劑的重量為1% 15%。
14.按權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述步驟(6)中，每100毫升凍干溶液中所需凍干保護(hù)劑的重量為10% ；
15.按權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述步驟￠)中采用0.22 μ m的微孔濾膜過濾除菌。
全文摘要
本發(fā)明屬生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種包載紫杉醇的生物可降解納米復(fù)合物及其制備方法。本發(fā)明采用乳化/溶劑蒸發(fā)法制備紫杉醇PEG-PTMC納米復(fù)合物，以PEG-PTMC共聚物為載體，將紫杉醇包載在PTMC的疏水內(nèi)核中；所制備的紫杉醇PEG-PTMC納米復(fù)合物能有效地增加紫杉醇的溶解度，且載體材料的PEG長(zhǎng)鏈可起到“隱形”的作用，避免體內(nèi)網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞系統(tǒng)的吞噬，具有長(zhǎng)循環(huán)效果，能延長(zhǎng)血液中的半衰期；并通過控制其粒徑實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤組織的被動(dòng)靶向作用，從而提高治療效果。所述的納米復(fù)合物不含Cremophor EL和乙醇，與市售的紫杉醇注射液比較，可降低藥物的毒副作用，增加該藥臨床應(yīng)用的安全性。
文檔編號(hào)A61P35/00GK102836147SQ20111017475
公開日2012年12月26日 申請(qǐng)日期2011年6月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月25日
發(fā)明者方曉玲, 姜新義, 沙先誼 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)