專利名稱：預(yù)防和治療自身免疫性疾病的聯(lián)合抗原和dna疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使用含有抗原和編碼所述抗原的DNA的疫苗治療和預(yù)防變態(tài)反應(yīng)、哮喘、自身免疫性疾病和移植排斥的癥狀。
背景技術(shù)：
調(diào)節(jié)性T(Treg)細(xì)胞是耐受性的重要調(diào)節(jié)因子，其在自身免疫性疾病治療中起重要作用。特別地，誘導(dǎo)靶向變態(tài)反應(yīng)、哮喘和自身免疫性疾病抗原的抗原特異性Treg (iTreg)細(xì)胞為相關(guān)病狀提供了有效免疫調(diào)節(jié)治療策略。提供Treg細(xì)胞的已知方法是過繼轉(zhuǎn)移天然胸腺源⑶4+⑶25+ Treg(nTreg)細(xì)胞。然而，這種方法在nTreg細(xì)胞中產(chǎn)生低水平的胰島特異性Treg細(xì)胞，并且因此抑制無效。通過在外周部分的致耐受性抗原呈遞由常規(guī)⑶4+T細(xì)胞產(chǎn)生可誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T (iTreg)細(xì)胞。與天然調(diào)節(jié)性T (nTreg)細(xì)胞相反,可使用蛋白質(zhì)抗原和編碼所述相同抗原的DNA疫苗聯(lián)合免疫來誘導(dǎo)致耐受性抗原呈遞。同時暴露于蛋白質(zhì)和DNA基抗原的組合產(chǎn)生⑶40 ffiIL-10、4突細(xì)胞，所述樹突細(xì)胞以抗原特異性方式介導(dǎo)⑶4+CD25_Foxp3+iTerg細(xì)胞的誘導(dǎo)。這些iTreg將對抑制Th1和Th2誘導(dǎo)的免疫途徑，例如變態(tài)反應(yīng)、自身免疫性疾病、哮喘和移植排斥有用。然而，不知道如何設(shè)計用于抗原呈遞的抗原表位或疫苗以便最大化iTreg的誘導(dǎo)。因此，在本領(lǐng)域中需要對抗自身免疫性疾病的抗原基疫苗和抗此類疾病的有效疫苗的抗原選擇和設(shè)計的更好方法，包括其有效施用途徑。發(fā)明概述本文提供了包含抗原肽和編碼所述肽的DNA的疫苗。所述抗原肽和DNA刺激iTreg細(xì)胞。所述抗原可與病狀，例如變態(tài)反應(yīng)、哮喘或自身免疫性疾病相關(guān)。所述抗原可為屋塵螨(dermatophagoides pteronyssinus) I肽、其片段或其變體并且可與變態(tài)反應(yīng)或哮喘相關(guān)。所述抗原可為胰島素肽、髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白、髓鞘堿性蛋白和少突膠質(zhì)細(xì)胞特異性蛋白、透明帶蛋白肽、屋塵螨I肽、α-肌球蛋白肽、柯薩奇病毒B4結(jié)構(gòu)蛋白肽、A群鏈球菌(str印t0C0CCal)M5蛋白肽、(Q/R) (K/R)RAA、II型膠原蛋白肽、甲狀腺過氧化物酶、甲狀腺球蛋白、pendrin肽、乙酰膽堿受體肽、人S抗原、其片段或其變體，并且可與自身免疫性疾病相關(guān)。載體可包含編碼所述肽的DNA。所述載體可為pVAX、pcDNA3.0或provax載體。所述載體和抗原肽質(zhì)量比可為5:1和1:5 ;或1:1和2:1。本文還提供了一種疫苗接種試劑盒。所述疫苗接種試劑盒可含有疫苗施用設(shè)備和本文所述的疫苗。所述疫苗接種設(shè)備可為疫苗槍、針或電穿孔設(shè)備。本文還提供了一種治療自身免疫性疾病的方法。所述方法可包括向有需要的患者施用本文所述的疫苗。所述自身免疫性疾病可為I型糖尿病、多發(fā)性硬化、自身免疫性卵巢疾病、塵螨變態(tài)反應(yīng)、心肌炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、甲狀腺炎、重癥肌無力、自身免疫性葡萄膜炎或哮喘。如果要將所述疫苗用于治療I型糖尿病，所述疫苗的抗原可為胰島素肽、其片段或其變體。如果要將所述疫苗用于治療多發(fā)性硬化，所述疫苗的抗原可為髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白、髓鞘堿性蛋白、少突膠質(zhì)細(xì)胞特異性蛋白、其片段或其變體。如果要將所述疫苗用于治療自身免疫性卵巢疾病，所述疫苗的抗原可為透明帶蛋白肽、其片段或其變體。如果要將所述疫苗用于治療心肌炎，所述疫苗的抗原可為屋塵螨I肽、其片段或其變體。如果要將所述疫苗用于心肌炎，所述疫苗的抗原可為α-肌球蛋白肽、柯薩奇病毒B4結(jié)構(gòu)蛋白肽、A群鏈球菌Μ5蛋白肽、其片段或其變體。如果要將所述疫苗用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，所述疫苗的抗原可為肽(Q/R) (K/R)RAA、II型膠原蛋白、其片段或其變體。如果要將所述疫苗用于治療甲狀腺炎，所述疫苗的抗原可為甲狀腺過氧化物酶、甲狀腺球蛋白、pendrin肽、其片段或其變體。如果要將所述疫苗用于治療重癥肌無力，所述疫苗的抗原可為乙酰膽堿受體肽、其片段或其變體。如果要將所述疫苗用于治療自身免疫性葡萄膜炎，所述疫苗的抗原可為人S抗原、其片段或其變體。附圖簡述

圖1顯示，MHC-1I阻滯降低了⑶25_iTreg誘導(dǎo)。在抗MHC-1I阻滯mAb存在或缺乏時，與從經(jīng)聯(lián)合免疫的Balb/c小鼠純化的致耐受性樹突細(xì)胞(DC) —起培養(yǎng)從Balb/cD011.10小鼠或OVA (卵清蛋白)323_339-致敏Balb/c小鼠純化的CD4+T細(xì)胞。在第7天計數(shù)CD253Treg 細(xì)胞(CD4+CD25Toxp3+)占 CD4+CD25T 細(xì)胞的百分比，*，p〈0.05。示出了有相似結(jié)果的3次獨立實驗之一。每個點表示一只小鼠。圖2顯示，0VA323-339突變降低了對T細(xì)胞的抗原性。圖2A.0VA323_339突變總結(jié)、其預(yù)測MHC-1I結(jié)合親和力和來自四聚物競爭測定的實驗結(jié)果。如以下計算四聚物結(jié)合百分比:在競爭肽表位存在 時四聚物陽性T細(xì)胞的數(shù)量/在競爭肽表位缺乏時四聚物陽性T細(xì)胞的數(shù)量X 100%。圖2B.與呈遞指定表位的致耐受性樹突細(xì)胞(“DC”)一起共同培養(yǎng)4天的CFSE標(biāo)記的D011.10⑶4+T細(xì)胞的增殖。線性圖總結(jié)了來自3次獨立實驗的結(jié)果。**，p〈0.0l0圖3顯示，經(jīng)聯(lián)合免疫誘導(dǎo)⑶25_iTreg細(xì)胞取決于表位親和力。圖A.通過流式細(xì)胞術(shù)計數(shù)聯(lián)合免疫后在Balb/c小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)的CD25_iTreg (CD4+CD25_FoXp3+ (叉頭框P3))和 nTreg(CD4+CD25+Foxp3+)并分別計算在 CD4+CD25-和 CD4+CD25+T 細(xì)胞中 Foxp3+ 細(xì)胞的百分比。首次接受試驗的非免疫小鼠。**, p〈0.01。每個點表示一只小鼠。示出了有相似結(jié)果的3次獨立實驗之一。圖3B.經(jīng)聯(lián)合免疫誘導(dǎo)高度抑制性⑶25_iTreg細(xì)胞取決于表位抗原性。在0VA323_339存在下，與聯(lián)合免疫誘導(dǎo)的⑶25_iTreg —起共同培養(yǎng)CFSE標(biāo)記的D011.10⑶4+T細(xì)胞。通過流式細(xì)胞術(shù)，根據(jù)分裂KJ1-26+細(xì)胞與總KJ1-26+細(xì)胞之比測定增殖。**,p〈0.01。每個點表示一只小鼠。示出了有相似結(jié)果的3次獨立實驗之一。圖4顯示，過繼轉(zhuǎn)移⑶25_iTreg細(xì)胞抑制了受體小鼠的T細(xì)胞應(yīng)答。將來自經(jīng)0VA323-339> MTl或MT2聯(lián)合免疫或首次接受試驗的Balb/c的CD4+CD25_T細(xì)胞過繼轉(zhuǎn)移至首次接受試驗的Balb/c。通過用于IFA中的0VA323_339使受體致敏評估供體⑶25_iTreg的活性。圖4A.致敏后從受體中分離出CD4+T細(xì)胞。用羥基熒光素琥珀酰亞胺脂(CFSE)標(biāo)記細(xì)胞并且在培養(yǎng)物中用(^々323_339再刺激。通過CFSE稀釋鑒定分裂細(xì)胞并通過流式細(xì)胞術(shù)計數(shù)。將結(jié)果表示為占總CFSE+T細(xì)胞的百分比。示出了有相似結(jié)果的3次獨立實驗之一。圖4B.致敏后從受體中分離出CD4+T細(xì)胞并且在細(xì)胞內(nèi)對于IFN-Y免疫染色。通過流式細(xì)胞術(shù)計數(shù)IFN-Y+CD4+T細(xì)胞并計算占總CD4+T細(xì)胞的百分比。示出了有相似結(jié)果的3次獨立實驗之一。圖4C和D.再刺激T細(xì)胞上清液中的IFN- Y和IL-1O分泌。在陽性對照中用抗⑶3mAb(KT3)或KT3+IL-2+IL-4誘導(dǎo)指定細(xì)胞因子。示出了有相似結(jié)果的3次獨立實驗之一。*，ρ〈0.05，#，ρ〈0.01。圖5顯示，PlOO對T細(xì)胞的刺激比Ρ66更強(qiáng)。在培養(yǎng)物中用PlOO或Ρ66 (5 μ g/ml)再刺激來自經(jīng)蚤抗原免疫的C57BL/6小鼠的脾⑶4+T細(xì)胞。通過基于3-(4，5- 二甲基噻唑-2-基)-2，5-聯(lián)苯四唑溴化物(MTT，黃色四唑)的測定法測定T細(xì)胞增殖。分別使用伴刀豆球蛋白A(lyg/ml)和BSA(lyg/ml)作為陽性和陰性對照。*，p〈0.05。示出了有相似結(jié)果的3次獨立實驗之一。圖6顯示，經(jīng)聯(lián)合免疫誘導(dǎo)的⑶25_iTreg對皮膚反應(yīng)的減弱。圖6A.經(jīng)蚤抗原刺激的T細(xì)胞增殖。圖6B.蚤特異性皮下試驗誘導(dǎo)的體內(nèi)T細(xì)胞應(yīng)答。圖6C.皮膚切片的H&E染色。黑色箭頭指示浸潤T細(xì)胞。圖6D.肥大細(xì)胞數(shù)量和通過甲苯胺藍(lán)染色的脫粒(黑色箭頭)。圖6E.聯(lián)合免疫7天后，計數(shù)⑶25_iTreg細(xì)胞占⑶4+⑶25_1~細(xì)胞的百分比。示出了有相似結(jié)果的3次獨立實驗之一。*，p〈0.05，#，p〈0.01。圖7顯示，過繼轉(zhuǎn)移⑶25-1Treg抑制了體內(nèi)皮膚反應(yīng)。將來自經(jīng)ColOO或Co66免疫的小鼠的CD25_iTreg過繼轉(zhuǎn)移至FSAl致敏小鼠體內(nèi)。然后用蚤抗原激發(fā)受體(皮膚試驗)。分別使用組胺和PBS作為皮膚試驗的陽性和陰性對照。*，p〈0.05。示出了有相似結(jié)果的3次獨立實驗之一。圖8.聯(lián)合免疫抑制了 HDM介導(dǎo)的哮喘的發(fā)展。(A)在用塵螨提取物最后一次激發(fā)24h后通過H&E染色對 肺組織進(jìn)行組織學(xué)檢查。箭頭示出了不同細(xì)胞浸潤(白色箭頭)。(B)在最后一次激發(fā)24h后通過ELISA測試對Der-pl有特異性的IgE的水平。(C)用Flex set檢查最后一次激發(fā)24h后小鼠血清中的不同細(xì)胞因子水平。與模型組相比，*，p〈0.05**，p〈0.01，n=6只小鼠/組。圖9.聯(lián)合免疫誘導(dǎo)CD4+CD25_FOXp3+iTreg。(A)通過FACS分析第二次聯(lián)合免疫后第7天⑶4+⑶25_T細(xì)胞中的Foxp3表達(dá)。(B-C)通過在APC和刺激物的存在下，與應(yīng)答T細(xì)胞(從經(jīng)Der-pl刺激預(yù)處理的WT小鼠純化的⑶4+T細(xì)胞)一起按1:5或1:10比例共同培養(yǎng)72h檢查對iTreg(從經(jīng)聯(lián)合免疫預(yù)處理的Foxp3gfp小鼠中純化)的抑制。通過MTT方法分析增殖水平。結(jié)果代表至少3次獨立實驗。如所示*，p<0.05, **，p<0.01與對照或首次接受試驗的組不匹配，n=6只小鼠/組。圖10.1Treg的抑制能力由IL-10，而非細(xì)胞與細(xì)胞的接觸介導(dǎo)。(A)在第二次聯(lián)合免疫后第7天通過熒光活化細(xì)胞分選法(FACS)分析iTreg和nTreg的抑制性受體的表達(dá)。(B)在transwell板中，在上部腔室內(nèi)用Derpl抗原(10 μ g/ml)刺激2X IO5個新分離的⑶4+⑶25_GFP+(綠色熒光蛋白)T細(xì)胞以分泌細(xì)胞因子。用Derpl抗原(10 μ g/ml)刺激I X IO6個應(yīng)答⑶4+T細(xì)胞以在下部腔室內(nèi)擴(kuò)展。如所示在下部腔室內(nèi)添加lOyg/mL對照IgG、抗IL-10或抗TGF-β。通過MTT方法分析增殖水平。結(jié)果代表至少3次獨立實驗。如所示*，p〈0.05, **, p〈0.01與對照或首次接受試驗的組不匹配，n=6只小鼠/組。圖11.TGF-β I對于誘導(dǎo)iTreg中的Foxp3表達(dá)是必需的。(A)通過RT-PCR檢查在來自首次聯(lián)合免疫后第3天的小鼠脾臟的CDllC+樹突細(xì)胞中的細(xì)胞因子生成。甘油醛3-磷酸脫氫酶(GAPDH)的表達(dá)作為樣品的內(nèi)部對照。(B)體內(nèi)阻滯TGF-β I時⑶4+⑶25_T細(xì)胞中的叉頭框P3(Foxp3)表達(dá)。連續(xù)3天在每次聯(lián)合免疫后在病灶內(nèi)為小鼠注射單獨的抗TGF-PAbGOOyg/注射)或單獨的同種型對照抗體小鼠免疫球蛋白Gl (IgGl) 3次。在第二次聯(lián)合免疫7天后通過FACS分析GFP表達(dá)。結(jié)果代表至少3次獨立實驗。如所示*，p〈0.05, p〈0.01與對照或首次接受試驗的組不匹配，n=6只小鼠/組。圖12.1L-10對于iTreg的抑制能力很重要。(A)當(dāng)體內(nèi)阻滯IL-10時也可誘導(dǎo)CD4+CD25Toxp3+iTreg。通過 FACS 分析 CD4+CD25T1 細(xì)胞中的 Foxp3 表達(dá)。(B)在 IL-10 不足時誘導(dǎo)的iTreg抑制能力受損。與應(yīng)答T細(xì)胞一起共同培養(yǎng)從經(jīng)抗IL-1OmAb預(yù)處理的小鼠分離的iTreg。通過MTT方法分析增殖水平。(C)通過FACS評估在用抗TGF_b或抗IL-1OmAb處理后iTreg分泌的IL-10的水平。結(jié)果代表至少3次獨立實驗。如所示*，p〈0.05, p〈0.01與對照或首次接受試驗的組不匹配，n=6只小鼠/組。圖13.TGF- β I在體外誘導(dǎo)CD4+CD25.初始T細(xì)胞中的Foxp3表達(dá)。(A) Dcreg中的TGF-β和IL-10模型誘導(dǎo)iTreg。(B)與用DNA和Der-pl蛋白共同處理的樹突細(xì)胞(DC)reg 一起共同培養(yǎng)初始T細(xì) 胞7天，通過FACS評估Foxp3_GFP。(C)在不同劑量的TGF- β I存在下用板結(jié)合的抗⑶3和可溶性抗⑶28刺激從Foxp3gfp小鼠純化的初始⑶4+⑶25_T細(xì)胞72h并通過FACS評估GFP的表達(dá)。(D)在TGF-β I或IL-10的存在下如(C)刺激并培養(yǎng)⑶4+⑶25_Τ細(xì)胞72h并且通過FACS評估GFP的表達(dá)。結(jié)果代表至少3次獨立實驗。如所示*，p〈0.05, **, p〈0.01與對照或首次接受試驗的組不匹配，n=6只小鼠/組。圖14.自分泌IL-10對iTreg抑制能力有影響。(A)與分別用DNA和塵螨Pl蛋白(Der-pl) Der-pl蛋白或單抗原預(yù)處理的DC—起共同培養(yǎng)初始T細(xì)胞7天。然后通過FACS評估Foxp3-GFP。(B)如(A)從培養(yǎng)基中分離iTreg并與效應(yīng)T細(xì)胞一起共同培養(yǎng)以評估其抑制能力。(C)在用DNA和蛋白質(zhì)疫苗預(yù)處理后的不同天數(shù)通過FACS檢測⑶Il+DC表面的IL-10R表達(dá)。(D)與用DNA、Der-pl蛋白和IL-10R siRNA預(yù)處理的DC —起共同培養(yǎng)初始T細(xì)胞。通過FACS評估iTreg誘導(dǎo)。(E)如(D)從培養(yǎng)基中分離iTreg細(xì)胞并且與效應(yīng)T細(xì)胞一起共同培養(yǎng)以評估其抑制能力。通過MTT方法分析增殖水平。結(jié)果代表至少3次獨立實驗。如所示p〈0.05, p〈0.01與對照或首次接受試驗的組不匹配,n=6只小鼠/組。圖15.研究了 TGF-b和IL-10功能模型并且其涉及經(jīng)聯(lián)合免疫對iTreg的誘導(dǎo)。圖15A通過蛋白質(zhì)印跡顯示了純化⑶4+CD25TFP+iTreg和⑶4+⑶25+GFP+nTreg中活化T細(xì)胞I和2 (NFAT1和NFAT2)的核或細(xì)胞質(zhì)核因子。組蛋白或GAPDH分別用作核或細(xì)胞質(zhì)蛋白的裝填對照。(B)TGF-P和IL-10對聯(lián)合免疫的不同階段有影響。圖16.對真核和原核表達(dá)構(gòu)建體中pVAX-Der-pl表達(dá)的分析。(A)通過用Der-pl特異性引物進(jìn)行的RT-PCR分析從經(jīng)pVAX-Der-pl轉(zhuǎn)染的幼倉鼠腎細(xì)胞(BHK21細(xì)胞)分離的RNA。泳道I，DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道2，來自經(jīng)轉(zhuǎn)染BHK21細(xì)胞的RNA ;泳道3，來自經(jīng)轉(zhuǎn)染pVAX載體BHK21細(xì)胞的RNA ;泳道4，來自非轉(zhuǎn)染BHK21細(xì)胞的RNA。通過SDS PAGE⑶和蛋白質(zhì)印跡(C)進(jìn)行對大腸桿菌(E.coli)系統(tǒng)中Der-pl蛋白質(zhì)表達(dá)的測定。SDS PAGE結(jié)果 1:未誘導(dǎo) pET28a-Der-pl ；2:用 0.1mM IPTG 誘導(dǎo)的 pET28a_Der_pl ；3:用 0.5mMIPTG 誘導(dǎo)的pET28a-Der-pl ；4:用1.5mM IPTG誘導(dǎo)的pET28a_Der-pl ；5:蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)。箭頭指向目標(biāo)條帶。(C)蛋白質(zhì)印跡結(jié)果1:未誘導(dǎo)pET28a-Der-pl ；2:誘導(dǎo)的pET28a_Der-pl。圖17.對BAL中不同細(xì)胞的分析。最后一次激發(fā)24h后，收集BAL并通過CELL-DYN估計浸潤細(xì)胞(總數(shù))和嗜酸性細(xì)胞的數(shù)量。結(jié)果代表3次實驗。與模型組相比，*，ρ〈0.05**，ρ〈0.01。(η=6 只貓 / 組)。圖18.聯(lián)合免疫上調(diào)源自Foxp3gfp小鼠的⑶4+CD25_T細(xì)胞中的GFP表達(dá)。通過FACS分析在第二次聯(lián)合免疫后第7天⑶4+⑶25-T細(xì)胞中的GFP表達(dá)。結(jié)果代表至少3次獨立實驗。圖19.用mAb處理后小鼠血清中TGF-β I或IL-10的水平。(A)用ELISA試劑盒檢查在第二次聯(lián)合免疫后第3天小鼠血清中的TGF-β I水平。(B)用Flex Set檢查在第二次聯(lián)合免疫后第3天小鼠血清中的IL-10水平。結(jié)果代表至少3次獨立實驗。與模型組相比,*ρ〈0.05**, ρ〈0.01, η=6 只小鼠 / 組。圖20.TGF- β受體抑制劑抑制Foxp3誘導(dǎo)。與用DNA、Der_pl蛋白和TGF- β受體預(yù)處理的DC —起共同培養(yǎng)初始T細(xì)胞。通過FACS評估iTreg誘導(dǎo)。結(jié)果代表至少3次獨
立實驗。圖21.1L-10對由DCreg誘導(dǎo)Treg的階段無影響。用抗IL-10,通過DCreg誘導(dǎo)iTreg,并且然后在7天之后分離。通過效應(yīng)T細(xì)胞的增殖水平評估這些iTreg的抑制功能。通過MTT方法分析增殖水平。結(jié)果代表至少3次獨立實驗。圖22.研究了 IL-10R siRNA 對 DC 的影響。在用 IL-10R siRNA 或?qū)φ?siRNA 處理后第2天測定DC表面的IL-10R水平。結(jié)果代表至少3次獨立實驗。圖23.CD40低是聯(lián) 合免疫誘導(dǎo)的DCreg的標(biāo)志。A)為小鼠肌肉注射指定免疫原。第二天通過對于⑶Ilc和⑶40-PE進(jìn)行雙重染色，接著進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢查脾臟DC。為CDllc+細(xì)胞分類。將首次接受試驗的小鼠用作陰性對照。示出了有相似結(jié)果的獨立實驗。B)為純化⑶llc+DC和JAWS II細(xì)胞供給指定免疫原24h并通過流式細(xì)胞術(shù)檢查⑶40的表達(dá)。未經(jīng)處理的DC或JAWS II細(xì)胞用作陰性對照。C)為JAWS II細(xì)胞供給p0VA323+0VA323或pVAX+0VA32324h，然后與從已使其對OVA敏感的小鼠制備的CFSE-⑶4+T細(xì)胞一起共同培養(yǎng)5天。通過FACS分析Foxp3和IL-10的表達(dá)。為CD4+細(xì)胞分類。將Foxp3+或IL-10+細(xì)胞的數(shù)量計算為分類細(xì)胞的百分比。示出了有相似結(jié)果的獨立實驗。D)為JAWS II細(xì)胞供給所示熒光標(biāo)記免疫原24h，并且然后對于CD40進(jìn)行免疫染色。通過共聚焦顯微鏡術(shù)分析免疫原攝取和CD40表達(dá)的相關(guān)性(上圖)。使用Nikon EZ-C13.0OFreeViewer軟件分析平均PE熒光(下圖)。細(xì)胞數(shù)量為10個/組。圖24.DC通過網(wǎng)格蛋白和小窩介導(dǎo)的胞吞作用同時攝取DNA和蛋白質(zhì)免疫原。A)在 37°C下用 PBS、MDC(50yM)或菲律平(filipin) (10 μ g/ml)預(yù)處理 JAWS II 細(xì)胞 30 分鐘，然后供給 Cy5-p0VA323+FITC-0VA323 或 Cy5_pVAX+FITC_0VA32324h。用抗 CD40-PE 對細(xì)胞染色并通過流式細(xì)胞術(shù)分析。示出了 Cy5/FITC雙陽性細(xì)胞(分類)的CD40染色。B)示出了實驗結(jié)果總結(jié)。圖25.聯(lián)合免疫活化Cav-1介導(dǎo)的陰性途徑。在分析前2天從首次接受試驗的小鼠或用指定免疫原免疫的小鼠的脾臟DC中提取總蛋白質(zhì)或RNA。對指定蛋白質(zhì)和基因進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡(A、C和D)和RT-PCR分析。圖26.使Cav-1和Tollip沉默防止了 DCreg的誘導(dǎo)。A)為WT和Cav-1和/或Tollip 敲除 DC 供給 p0VA323+0VA323 或 pVAX+0VA32324h 并且分析 CD40 和 IL-1O 的表達(dá)。使用未供給任何免疫原的WT DC作為對照(未經(jīng)處理)。B)與來自對OVA敏感的小鼠的CFSE-CD4+T 細(xì)胞一起共同培養(yǎng)供給了 p0VA323+0VA323 或 pVAX+0VA32324h 的 DC。測定 T細(xì)胞增殖和Foxp3+和IL-10+T細(xì)胞的數(shù)量。圖27.缺乏Cav-1和/或Tollip的DC在體內(nèi)并無致耐受性。將缺乏Cav-1和/或Tollip的JAWS II細(xì)胞過繼轉(zhuǎn)移至同系小鼠體內(nèi)(第O天)。然后在第O和7天用IFA中的OVA使小鼠免疫。在第14天，試驗DTH反應(yīng)。在第15天，測定T細(xì)胞增殖、T細(xì)胞中Foxp3的表達(dá)和上清液中的ILlO水平。圖28.聯(lián)合免疫誘導(dǎo)的DCreg改善炎癥性支氣管炎。A)實驗設(shè)計:在第O和7天經(jīng)腹膜內(nèi)為Balb/c小鼠注射0.1ml的lmg/ml OVA/明礬復(fù)合物并且隨后在第14、16和18天在氣管內(nèi)用IOOyg OVA激發(fā)以建立“模型”。在第14、16和18天使對照小鼠經(jīng)氣管內(nèi)接受PBS并且指定為“虛假”對照。在第21天，將5 X 105個來自同系供體小鼠的⑶I Ic+細(xì)胞經(jīng)靜脈轉(zhuǎn)移至模型小鼠體內(nèi)，每天一次，連續(xù)3天。(n=3只/組)。轉(zhuǎn)移之前，用或不用菲律平預(yù)處理從首次接受試驗的小鼠的脾臟純化的供體CDllc+細(xì)胞并且隨后用pOVA+OVA或pVAX+OVA共同處理24h。在最后轉(zhuǎn)移后第14天，取血清樣品以分析IgE或細(xì)胞因子生成的水平。制作肺組織切片以評估疾病嚴(yán)重程度。B)在過繼轉(zhuǎn)移指定DC后通過ELISA分析抗原特異性IgE的水平。C)在轉(zhuǎn)移指定DC之前通過CBA檢查IL-4和IL-5的生成。D)通過H&E染色檢查肺部切片并且在光學(xué)顯微鏡下以X 100和X200放大倍數(shù)記錄。圖29.聯(lián)合免疫誘導(dǎo)的DCreg改善自身免疫性卵巢疾病。A)實驗設(shè)計:在爪墊上為C57BL/6小鼠注射乳化于CFA中的mZP3蛋白以誘導(dǎo)A0D。14天后，將5X 105個JAWS II細(xì)胞經(jīng)靜脈轉(zhuǎn)移至這些經(jīng)誘導(dǎo)的AOD小鼠體內(nèi)，每天一次，連續(xù)3天。(n=6只/組)。轉(zhuǎn)移之前，為JAWS II細(xì)胞供給pcD-mZP3+mZP3或pcD_0VA+mZP324h，接著在37°C下進(jìn)行絲裂霉素C (Mitomycin C)處理(50 μ g/ml) 20分鐘。在最后轉(zhuǎn)移后第14天,取血清以分析細(xì)胞因子生成并且固定卵巢并切片用于評估疾病嚴(yán)重程度。B)通過CBA分析IFN-Y、TNF-α和IL-5的生成。示出了有相似結(jié)果的實驗。*，C)通過對來自每只動物的組織切片的病理分析評估疾病的程度。圖中的每個點表示一只動物。D)在最后轉(zhuǎn)移后第14天，對于CD4、Foxp3和IL-1O進(jìn)行三重染色每個受體的脾細(xì)胞并通過流式細(xì)胞術(shù)分析。為CD4+細(xì)胞分類。圖30.阿米洛利(amiloride)對JAWS II細(xì)胞中CD40表達(dá)的影響。在37°C下用阿米洛利(5mM)預(yù)處理JAWS II細(xì)胞10分鐘，并且然后用Cy5-p0VA323+FITC_0VA323或Cy5-pVAX+FITC-0VA323共同處理24h。用抗CD40-PE對細(xì)胞染色并通過流式細(xì)胞術(shù)分析。圖31.對JAWS II細(xì)胞中Cav-1和Tollip的調(diào)節(jié)。為JAWS II細(xì)胞供給指定免疫原24h。然后提取總蛋白或RNA并通過蛋白質(zhì)印跡㈧或RT-PCR⑶分析。圖32.通過 RNAi 對 Cav-1 和 Tollip 的沉默。A)用 Cav-1 或 Tollip 特異性 siRNA轉(zhuǎn)染JAWS II細(xì)胞。在24h時，通過實時RT-PCR檢測Cav-1和Tollip的mRNA水平。B)為WT和Cav-1敲除DC供給p0VA+0VA或pVAX+0VA24h。通過蛋白質(zhì)印跡檢測NF- κ B的易位。

圖33.最后DC過繼轉(zhuǎn)移后第14天對卵巢組織的組織學(xué)檢查。在光學(xué)顯微鏡下以X 40和X 100放大倍數(shù)觀察樣品。實心箭頭指無炎癥性細(xì)胞浸潤的卵泡；空心箭頭指有炎癥性細(xì)胞浸潤的卵泡。圖34顯示了編碼流感核蛋白(“NP”)和M2抗原的質(zhì)粒表達(dá)載體和相應(yīng)線性表達(dá)盒的圖譜。線性表達(dá)盒PcrNP或pcrM2含有CMV啟動子、用于剪接的內(nèi)含子、具有終止密碼子和多腺苷酸化信號的NP或M2的全長基因。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及這樣的發(fā)現(xiàn)，通過施用抗原和編碼所述抗原的DNA疫苗的組合有效誘導(dǎo)抗特異性抗原的iTreg細(xì)胞。這種誘導(dǎo)比單獨的抗原或DNA疫苗好很多。本發(fā)明還涉及這樣的發(fā)現(xiàn)，如果抗原對致耐受性樹突細(xì)胞(DC)上表達(dá)的II類MHC有高親和力，可進(jìn)一步提高iTreg細(xì)胞誘導(dǎo)的效率。提供的疫苗含有對II類MHC有高親和力的肽抗原和表達(dá)所述肽的DNA的組合，并且這些疫苗可誘導(dǎo)能夠抑制自身免疫性疾病和變態(tài)反應(yīng)的iTreg群。因為iTreg細(xì)胞有抗原特異性并且因此更有效地抑制抗原特異性T細(xì)胞功能，所以iTreg誘導(dǎo)處理伴有比其它處理方法更少的副作用。本文提供了包含抗原肽和編碼所述肽的DNA的疫苗。所述肽的IC5tl為ΙΟΟηΜ，并且對II類MHC的IC5tl可為50nM或更低。II類MHC可在致耐受性樹突細(xì)胞上表達(dá)。所述DNA可包含能夠表達(dá)所述肽的表達(dá)載體。所述載體可選自本領(lǐng)域中的可用載體，并且可包括pVAX、pcDNA3.0或provax。所述肽可為選自以下的蛋白質(zhì)中所含的氨基酸序列:胰島素、FSA1、Der-pl、髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白(M0G)、髓鞘堿性蛋白(MBP)、蛋白脂質(zhì)蛋白(PLP)、髓磷脂相關(guān)少突膠質(zhì)細(xì)胞堿性蛋白(MOBP)、少突膠質(zhì)細(xì)胞特異性蛋白(OSP)、葡萄糖6-磷酸酶、透明帶1、2或3、人肌球蛋白、柯薩奇病毒B4結(jié)構(gòu)蛋白VP1、VP2、VP3或VP4、A群鏈球菌M5蛋白、II型膠原蛋白、甲狀腺過氧化物酶、甲狀腺球蛋白、Pendrin、乙酰膽堿受體α亞單位、人S抗原和人IRBP。胰島素肽可包含氨基酸序列 MRLLPLLALLA(SEQ ID NO:5)或 SHLVEALYLVCGERG(SEQ IDNO: 191)。MOG 肽可包含選自 HPIRALVGDEVELP(SEQ ID NO:36), VGffYRPPFSRVVHLYRNGKD(SEQ ID NO:37), LKVEDPFYWVSPGVLVLLAVLPVLLL (SEQ ID NO:38)、M0G1-22 (SEQ ID NO: 17)、M0G34-56 (SEQID N0:18)和M0G64-96(SEQ ID NO: 19)的氨基酸序列。甲狀腺球蛋白肽可包含選自NIFEXQVDAQPL(SEQ ID NO: 155), YSLEHSTDDXASFSRALENATR(SEQ ID NO: 156)、RALENATRDXFIICPIIDMA(SEQ ID NO: 157)、LLSLQEPGSKTXSK(SEQ ID NO:158)和EHSTDDXASFSRALEN(SEQ ID NO: 159)的氨基酸序列，其中X為3，5，3’，5’-四碘甲腺原氨酸(甲狀腺素)。TPO肽可包含選自 LKKRGILSPAQLLS(SEQ ID NO: 160) ,SGVIARAAEIMETSIQ(SEQID NO: 161)、PPVREVTRHVIQVS(SEQ ID NO: 162)、PRQQMNGLTSFLDAS (SEQ IDNO: 163) , LTALHTLffLREHNRL (SEQ ID NO: 164) , HNRLAAALKALNAHff (SEQ IDNO: 165)、ARKVVGALHQIITL(SEQ ID NO:166), LPGLffLHQAFFSPffTL(SEQ IDNO: 167) , MNEELTERLFVLSNSST (SEQ ID NO:168)、LDLASINLQRG (SEQ ID NO:169)、RSVADKILDLYKHPDN(SEQ ID NO: 170)和 IDVWLGGLAENFLP(SEQ ID NO: 171)的氨基酸序列。Pendrin 肽可包含選自 QQQHERRKQERK(SEQ ID NO: 172)和 PTKEIEIQVDWNSE (SEQID NO: 173)的氨基酸序列。葡萄糖6-磷酸酶肽可包含選自IGRP13 _25(QHLQKDYRAYYTF)(SEQ ID NO:8),IGRP23_35(YTFLNFMSNVGDP) (SEQ ID NO:9),IGRP226 _ 238 (RVLNIDLLffSVPI)(SEQ ID NO: 10)、I GRP247 _ 259 (DffIHIDTTPFAGL) (SEQ ID NO: 11), G6Pase_ a 228 _240 (KGLGVDLLffTLEK) (SEQ ID NO: 12)、G6Pase_ a 249 _261 (EffVHIDTTPFASL) (SEQ IDNO: 13)、UGRP218_ 230 (FTLGLDLSffSISL) (SEQ ID NO: 14)和 UGRP239 _251 (EffIHVDSRPFASL)(SEQ ID NO: 15)的氨基酸序列。PLP 肽可包含選自 PLP30-49 (SEQ ID NO: 28),PLP40-60 (SEQ ID NO:29)、PLP180-199 (SEQ ID NO:30)、PLP184-199 (SEQ ID N0:31)和PLP190-209(SEQ ID NO:32)的氨基酸序列。MBP 肽可包含選自 MBP66-88 (SEQ ID N0:21)、MBP85-99 (SEQ ID NO: 22)、MBP86-105 (SEQ ID NO: 23)、MBP143-168 (SEQ ID NO: 24)、MBP83-97 (SEQ ID NO: 25)和 MBP85-96 (SEQ ID NO:26)的氨基酸序列。透明帶 3 肽可包含選自 ZP3330-342 (NSSSSQFQIHGPR) (SEQ ID N0:42)、ZP3 335-342 (QFQIHGPR) (SEQ IDN0:43)和ZP3 330-340 (NSSSSQFQIHG) (SEQ ID N0:44)的氨基酸序列。人肌球蛋白肽可包含選自 SLKLMATLFSTYASADTCDSGKGKGGKKKG(氨基酸 614-643 ;其中 Ac 為乙?；?(SEQID NO:46)、GQFIDSGKAGAEKL(氨基酸 735-747) (SEQ ID NO:47)和 DECSELKKDIDDLE(氨基酸947-960) (SEQ ID NO: 48)的α-肌球蛋白肽?？滤_奇病毒Β4結(jié)構(gòu)蛋白肽選自表 I。群鏈球菌 Μ5 肽可包含選自 ΝΤ4 (GLKTENEGLKTENEGLKTE) (SEQ ID NO: 94)、ΝΤ5(KKEHEAENDKLKQQRDTL)(SEQ ID NO:95)、Β1Β2(VKDKIAKEQENKETIGTL)(SEQ IDNO: 96)、Β2 (TIGTLKKILDETVKDKIA) (SEQ ID NO: 97)、Β3Α (IGTLKKILDETVKDKLAK)(SEQ ID NO:98)和 C3 (KGLRRDLDASREAKKQ) (SEQ ID NO:99)的氨基酸序列和選自表2的肽。所述肽可包含氨基酸序列(Q/R) (K/R)RAA(SEQ ID NO: 190) 0 II型膠原蛋白肽可包含選自II型膠原蛋白的殘基263-270(SEQ ID NO: 152)、184-198 (SEQ IDNO: 153)和359-369(SEQ ID NO: 154)的氨基酸序列。AChR肽可包含選自人AChRα亞單位的氨基酸 37-429、149-156、138-167、149-163、143-156、1-181 和 1-437 的氨基酸序列。人 S 抗原可包含選自肽 19(181-VQHAPLEMGPQPRAEATWQF-200) (SEQ ID NO: 183)、肽35(341-GFLGELTSSEVATEVPFRLM-356) (SEQ ID NO: 184)和肽36 (351-VATEVPFRLMHPQPEDPAKE-370 (SEQ ID NO: 185)的氨基酸序列。所述DNA可包含能夠表達(dá)所述肽的表達(dá)載體。所述載體選自pVAX、pcDNA3.0 和 provax。本文還提供了治療I型糖尿病的方法，所述方法包括向有需要的患者施用疫苗，其中所述疫苗可包含胰島素肽。 治療I型糖尿病的方法包括向有需要的患者施用疫苗，其中所述疫苗可包含抗原胰島素肽和編碼胰島素肽的DNA，并且其中所述肽對II類MHC的IC5tl為50nM或更低。II類MHC可在致耐受性樹突細(xì)胞上表達(dá)。所述肽可由氨基酸序列MRLLPLLALLA (SEQ ID NO: 5)或 SHLVEALYLVCGERG (SEQ ID NO: 191)組成。本文進(jìn)一步提供了治療多發(fā)性硬化的方法，所述方法包括向有需要的患者施用疫苗，其中所述疫苗可包含多發(fā)性硬化自身抗原肽和編碼所述肽的DNA，并且其中所述肽對II類MHC的IC5tl為50nM或更低。所述疫苗可包含髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白(MOG)、髓鞘堿性蛋白(MBP)、蛋白脂質(zhì)蛋白(PLP)、髓磷脂相關(guān)少突膠質(zhì)細(xì)胞堿性蛋白(MOBP)或少突膠質(zhì)細(xì)胞特異性蛋白(OSP);并且所述肽為MOG的肽。同樣，所述肽可由選自HPIRALVGDEVELP、VGffYRPPFSRVVHLYRNGKD 和 LKVEDPFYWVSPGVLVLLAVLPVLLL 的氨基酸序列組成。本文還提供了治療自身免疫性卵巢疾病的方法,所述方法包括向有需要的患者施用疫苗，其中所述疫苗可包含透明帶蛋白肽。本文進(jìn)一步提供了治療屋塵螨變態(tài)反應(yīng)的方法，所述方法包括向有需要的患者施用疫苗，其中所述疫苗可包含抗原屋塵螨I肽。本文還提供了治療哮喘的方法，所述方法包括向有需要的患者施用疫苗，其中所述疫苗包含Der-p1、卵清蛋白或其它變應(yīng)原。
本文進(jìn)一步提供了治療心肌炎的方法，所述方法包括向有需要的患者施用疫苗，其中所述疫苗可包含α-肌球蛋白肽、柯薩奇病毒B4結(jié)構(gòu)蛋白肽或A群鏈球菌M5蛋白肽。本文還提供了治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的方法，所述方法包括向有需要的患者施用疫苗，其中所述疫苗可包含肽(Q/R) (K/R)RAA(SEQ ID NO: 190)或II型膠原蛋白肽。本文進(jìn)一步提供了治療甲狀腺炎的方法，所述方法包括向有需要的患者施用疫苗，其中所述疫苗可包含甲狀腺過氧化物酶(TPO)、甲狀腺球蛋白或Pendrin肽。本文還提供了治療重癥肌無力的方法，所述方法包括向有需要的患者施用疫苗，其中所述疫苗可包含乙酰膽堿受體肽。本文進(jìn)一步提供了治療自身免疫性葡萄膜炎的方法，所述方法包括向有需要的患者施用疫苗，其中所述疫苗可包含人S抗原肽。本文還提供了治療屋塵螨變態(tài)反應(yīng)的方法，所述方法包括向有需要的患者施用疫苗，其中所述疫苗可包含抗原屋塵螨I肽和編碼所述肽的DNA，并且其中所述肽對II類MHC的IC5tl為50nM或更低。1.定義本文使用的術(shù)語僅僅是為了描述特殊實施方案的目的而非旨在限制。如說明書和所附權(quán)利要求中所使用，除非上下文另有明確指示，單數(shù)形式“一個(a)”、“一種(an)”和“所述(the) ”包括復(fù)數(shù)指示物。對于本文數(shù)值范圍的敘述，明確涵蓋了其間有相同精確程度的每個區(qū)間值。例如，對于6-9的范圍而言，除6和9外還涵蓋數(shù)值7和8，并且對于范圍6.0-7.0而言，明確涵蓋了數(shù)值 6.0,6.1,6.2,6.3,6.4,6.5,6.6,6.7,6.8,6.9 和 7.0。“肽”或“多肽”為連接的氨基酸序列并且可為天然的、合成的或天然和合成的修改
或組合。當(dāng)提到保護(hù)動物免于疾病時,“治療(treatment) ”或“治療(treating) ”指預(yù)防、抑制、壓制或完全消除疾病。 預(yù)防疾病牽涉在疾病發(fā)作之前向動物施用本發(fā)明的組合物。抑制疾病牽涉在疾病誘導(dǎo)后，但是在其臨床表現(xiàn)之前向動物施用本發(fā)明的組合物。壓制疾病牽涉在疾病的臨床表現(xiàn)之后向動物施用本發(fā)明的組合物?！按篌w上相同”可指第一和第二氨基酸序列在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、
14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100 個氨基酸的區(qū)域上至少 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99% 相同?！白凅w”可指因氨基酸的插入、缺失或保守性取代而使氨基酸序列不同，但是保持至少一種生物活性的肽或多肽?！吧锘钚浴钡拇硇詫嵗ū惶禺愋钥贵w結(jié)合或引起免疫應(yīng)答的能力。變體也可指氨基酸序列與具有保持至少一種生物活性的氨基酸序列的參考蛋白質(zhì)大體上相同的蛋白質(zhì)。在本領(lǐng)域中認(rèn)為氨基酸的保守性取代，即用具有相似性質(zhì)(例如，親水性、帶電區(qū)的程度和分布)的不同氨基酸置換氨基酸通常牽涉小量電荷。可通過考慮氨基酸的親疏水性指數(shù)部分鑒定這些小量電荷。見Kyte等，J.Mol.Biol.157:105-132(1982)。氨基酸的親疏水性指數(shù)基于對其疏水性和電荷的考慮。在本領(lǐng)域中已知，可取代具有相似親疏水性指數(shù)的氨基酸并且仍保持蛋白質(zhì)功能。一方面，取代親疏水性指數(shù)為±2的氨基酸。氨基酸的親水性也可用于揭示將產(chǎn)生保持生物功能的蛋白質(zhì)的取代。在肽的情況下對氨基酸親水性的考慮允許計算所述肽的最大局部平均親水性，是已經(jīng)報道的與抗原性和免疫原性極其相關(guān)的有用方法，如通過引用全部并入本文的美國專利號4，554，101中所討論。正如本領(lǐng)域中所了解，取代具有相似親水性值的氨基酸可產(chǎn)生保持生物活性，例如免疫原性的肽?？捎糜H水性值在相互的±2范圍內(nèi)的氨基酸進(jìn)行取代。氨基酸的疏水性指數(shù)和親水性值均受所述氨基酸的特殊側(cè)鏈影響。與觀測一致，如疏水性、親水性、電荷、大小和其它性質(zhì)所揭示，了解到可與生物功能相容的氨基酸取代取決于氨基酸的相對相似性，并且特別是那些氨基酸的側(cè)鏈。2.疫苗本文提供了由抗原和編碼所述抗原的DNA組成的疫苗。所述疫苗可誘導(dǎo)抑制抗原特異性T細(xì)胞功能的抗原特異性iTreg細(xì)胞。疫苗中抗原和編碼所述抗原的DNA的組合有效誘導(dǎo)iTreg細(xì)胞抗特異性抗原，比包含單獨的抗原或其相應(yīng)DNA的疫苗好得多。所述疫苗進(jìn)一步增強(qiáng)II類MHC呈遞和表達(dá)以進(jìn)行iTreg細(xì)胞誘導(dǎo)。a.抗原所述疫苗可包含自身免疫性疾病抗原或其變體和編碼所述抗原的DNA。所述抗原可為自身抗原，并且可誘導(dǎo)抑制抗原特異性T細(xì)胞功能的抗原特異性iTreg細(xì)胞。用序列匹配DNA和蛋白質(zhì)抗原聯(lián)合免疫在體外和體內(nèi)誘導(dǎo)⑶Ilc+CD40ffiIL-1O+表現(xiàn)型的調(diào)節(jié)性DC(DCreg)，其轉(zhuǎn)而介導(dǎo)抗原特異性耐受性。常規(guī)DC(DC)為可廣泛分類為⑶llc+ra8a+和⑶llc+ra8a_亞型的特化抗原呈遞細(xì)胞(APC)，二者在免疫性或耐受性的誘導(dǎo)中均有顯著功能可塑性，這取決于其成熟情況。未成熟的DC(iDC)可通過將初始T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為⑶4+FoXp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)提高耐受性。來自疫苗的DNA構(gòu)建體和序列匹配蛋白的信號可以協(xié)同方式作用以活化將正常DC轉(zhuǎn)化為DCreg的調(diào)節(jié)信號。DNA和蛋白質(zhì)抗原聯(lián)合免疫通過使同一 DC主要經(jīng)小窩介導(dǎo)的胞吞作用同時攝取DNA和蛋白質(zhì)免疫原來 誘導(dǎo)DCreg。這一事件下調(diào)Cav-1的磷酸化而上調(diào)Tollip,其轉(zhuǎn)而發(fā)起上調(diào)SOCSl而下調(diào)NF-κ B和STAT-1a的下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。NF-κ B的下調(diào)解釋了聯(lián)合免疫誘導(dǎo)的DCreg的⑶40低和IL-10+表現(xiàn)型。可在體外于原代DC和DC系中通過為其供給DNA和蛋白質(zhì)免疫原短至24h來產(chǎn)生DCreg。體外產(chǎn)生的DCreg可能通過誘導(dǎo)抗原特異性CD25-1Treg，對治療炎癥性和自身免疫性疾病有效。Cav-1是形成小窩的關(guān)鍵蛋白。Cav-1還通過區(qū)室化許多信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子來調(diào)節(jié)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。Cav-1、Tollip和IRAK-1形成復(fù)合體以抑制靜息狀況期間IRAK-1的激酶活性。一旦磷酸化，Cav-1就從復(fù)合體中分離，導(dǎo)致細(xì)胞溶質(zhì)中的IRAK-1磷酸化和下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)的活化，包括NF-κ B25易位。DNA和蛋白質(zhì)的同時攝取下調(diào)了 Cav-1的磷酸化，從而防止NF-κΒ活化。因此，DNA抗原和序列匹配蛋白質(zhì)抗原可將正常DC轉(zhuǎn)化為DCreg。為獲得DCreg表現(xiàn)型和功能需要相同DC并且同時攝取事件引發(fā)上調(diào)SOCSl而下調(diào)NF-κ B和STAT-1 α的Cav-1和Tollip相互依賴型信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。Tollip在先天反應(yīng)的抑制和靜息狀態(tài)的維持中起重要作用。DNA和蛋白質(zhì)抗原的同時攝取上調(diào)了 Tollip并且Tollip或Cav-1的沉默部分防礙了 DC向DCreg的分化，表明Tollip可能在下調(diào)NF-κ B中獨立于Cav-1作用。iTreg細(xì)胞可為⑶4+⑶25+并且也表現(xiàn)出Foxp3的高表達(dá)。iTreg細(xì)胞能夠特異性防止在無一般免疫抑制時受有害免疫性的干擾?？赏ㄟ^高劑量的白細(xì)胞間素2 (IL-2)誘導(dǎo)iTreg細(xì)胞的增殖。iTreg細(xì)胞能夠憑借活化的⑶4+效應(yīng)T細(xì)胞上⑶80和⑶86配體的存在抑制效應(yīng)T細(xì)胞。一旦iTreg細(xì)胞被T細(xì)胞受體配體活化，抗原呈體細(xì)胞的存在在效應(yīng)T細(xì)胞的抑制中可必要或不必要?？乖碳ず螅琲Treg細(xì)胞可回到排出抗原的淋巴結(jié)內(nèi)并且可通過以與初始T細(xì)胞相同的速率的細(xì)胞分裂進(jìn)行積聚。iTreg細(xì)胞的產(chǎn)生可需要在皮質(zhì)上皮細(xì)胞上表達(dá)II類MHC。受體可受MHC限制，并且iTreg細(xì)胞可對抗原有特異性?？赡芡ㄟ^基于IL-10的機(jī)制誘導(dǎo)iTreg細(xì)胞以參與旁觀者介導(dǎo)的調(diào)節(jié)。iTreg細(xì)胞引起炎癥性Tifa和細(xì)胞減少。iTreg抑制可通過與抗原呈遞細(xì)胞相互作用而發(fā)生，包括例如在肺部或其它器官中的DC和上皮細(xì)胞，其中通過減少其外出分子SlPl的表達(dá)保留抗原特異性iTreg細(xì)胞。相互作用上調(diào)了抗原特異性APC的趨化IP-10的表達(dá)，其將CXCR3+炎癥性T細(xì)胞捕獲至上皮細(xì)胞(即TH1、TK1等)內(nèi)。這些捕獲T細(xì)胞的20%經(jīng)歷細(xì)胞凋亡，并且然后少數(shù)轉(zhuǎn)化為表達(dá)ILlO和TGF- β的Treg細(xì)胞。因此，炎癥性T細(xì)胞在氣管，如肺部中減少，并且病狀例如哮喘得到改善?？乖膳c變態(tài)反應(yīng)、哮喘或自身免疫性疾病相關(guān)?？乖捎绊懖溉閯游铮霾溉閯游锟蔀槿?、黑猩猩、狗、貓、馬、牛、小鼠或大鼠?？乖珊趤碜圆溉閯游锏牡鞍踪|(zhì)中，所述哺乳動物可為人、黑猩猩、狗、貓、馬、牛、豬、綿羊、小鼠或大鼠。(I)FSAl所述抗原可為蚤變應(yīng)原FSAl的肽或其變體，其可具有FSAl的氨基酸66_80或氨基酸 100-114。(2) Der-p I
所述抗原也可為Der-pl的肽或其變體。Der-pl可具有基因庫登記號EU092644的序列，其內(nèi)容通過引用并入本文。這種抗原可能與哮喘和/或變態(tài)反應(yīng)有關(guān)。(3) I型糖尿病所述抗原可為牽涉于I型糖尿病的自身抗原或其變體。所述抗原可為胰島素的肽，并且可為胰島素原。胰島素原抗原可具有序列MALWMRLLPLLALLALWGPDPAAAFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTRREAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN(SEQ ID NO: 192)，其可由基因庫登記號NM_000207中所含的序列編碼，其內(nèi)容通過引用并入本文。所述抗原可為人B9-23。胰島素抗原也可具有序列MRLLPLLALLA (SEQ ID NO: 5),SHLVEALYLVCGERG (SEQ IDN0:191)或 LYLVCGERG (SEQ ID NO: 6)。所述抗原也可為 Wong SF,TRENDS在Molecular Medicine, 2005; 11 (10)中公開的胰島素抗原，其內(nèi)容通過引用并入本文。胰島素抗原可具有氨基酸序列GIVEQCCTSICSLYQ(SEQ ID N0:7)。所述抗原可為葡萄糖6-磷酸酶(G6P)的序列，如Journal of Immunology,2006;176:2781-9中所述，其內(nèi)容通過引用并入本文。G6P抗原可具有IGRP13_25(QHLQKDYRAYYTF) (SEQ ID NO:8)、IGRP23_35(YTFLNFMSNVGDP) (SEQ ID NO:9)、IGRP226 _ 238 (RVLNIDLLffSVPI) (SEQ ID NO: 10)、IGRP247 ^ 259 (DffIHIDTTPFAGL) (SEQID NO; 11), G6Pase- a 228 _ 240 (KGLGVDLLffTLEK) (SEQ ID NO: 12)、G6Pase_ a 249 _261 (EffVHIDTTPFASL) (SEQ ID NO: 13)、UGRP218_23CI(FTLGLDLSWSISL(SEQ ID NO: 14)
UGRP239 _251 (EffIHVDSRPFASL) (SEQ ID NO: 15)的序列。所述抗原也可為谷氨酸脫羧酶或熱休克蛋白的肽。(4)多發(fā)性硬化
所述抗原可為牽涉于多發(fā)性硬化(MS)的自身抗原。所述抗原可為髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白(MOG)、髓鞘堿性蛋白(MBP)、蛋白脂質(zhì)蛋白(PLP)、髓磷脂相關(guān)少突膠質(zhì)細(xì)胞堿性蛋白(MOBP)或少突膠質(zhì)細(xì)胞特異性蛋白(OSP)的肽或其變體。MBP抗原可為 MBP66-88(SEQ ID NO: 21)、MBP85-99 (SEQ ID NO: 22)、MBP86-105 (SEQ ID NO:23),MBP143-168(SEQ ID NO: 24)、MBP83-97 (SEQ ID NO:25)或 MBP85-96 (SEQ ID N0:26)。PLP 抗原可為 PLP30-49 (SEQ ID NO: 28)、PLP40-60 (SEQ ID NO: 29)、PLP180-199 (SEQID NO:30), PLP184-199(SEQ ID NO: 31)或 PLP190-209 (SEQ ID NO:32) MOG 抗原可為M0G1-22 (SEQ ID NO: 17)、M0G34_56 (SEQ ID NO: 18)或M0G64-96 (SEQ ID N0:19)QM0G 抗原也可具有序列 HPIRALVGDEVELP (SEQ ID NO: 36) ,VGffYRPPFSRVVHLYRNGKD (SEQ ID N0:37)或LKVEDPFYWVSPGVLVLLAVLPVLLL (SEQ ID NO: 38) JS抗原也可具有 Schmidt S，Mult Scler.,1999;5(3):147-60中描述的序列，其內(nèi)容通過引用并入本文。(5)自身免疫性卵巢疾病所述抗原可為牽涉于自身免疫性卵巢疾病的自身抗原。所述抗原可為透明帶(ZP)1、2或3中所含的肽。ZP肽可具有NCBI參考序列NP_003451.1(SEQ ID NO:39),NP_009086.4 (SEQ ID NO:40)或 NP_997224.2 (SEQ ID N0:41)的序列。ZP 抗原可為具有序列 ZP3330 - 342(NSSSSQFQIHGPR)(SEQ ID NO:42)、ZP3335 - 342(QFQIHGPR)(SEQ IDNO:43)或 ZP3330 - 340 (NSSSSQFQIHG) (SEQ ID NO:44)的 ZP3 肽。ZP 抗原可為 LouY，TheJournal of Immunology, 2000; 164:5251 - 7中公開的肽,其內(nèi)容通過引用并入本文。(6)心肌炎所述抗原可為牽涉于心肌炎的自身抗原。所述抗原可為Smith SC, Journal ofImmunology, 1991; 147 (7):2141-7中所述的肽,其內(nèi)容通過引用并入本文。所述抗原可為人肌球蛋白中所含的肽，其可具有基因庫登記號CAA86293.1(SEQ ID NO:45)的序列。所述抗原可為α -肌球蛋白中所含的肽，并且可具有序列Ac-SLKLMATLFSTYASADTGDSGKGKGGKKKG (氨基酸 614 - 643 ;其中 Ac 為乙酰基)(SEQ ID NO: 46)、GQFIDSGKAGAEKL (氨基酸 735-747)(SEQ ID NO: 47)或 DECSELKKDIDDLE (氨基酸 947-960) (SEQ ID NO: 48)，如 Pummerer, CL，J.Clin.1nvest.1996; 97:2057-62中所公開，其內(nèi)容通過引用并入本文。所述抗原也可為具有下列序列之一的柯薩奇病毒B4結(jié)構(gòu)蛋白肽。表I
權(quán)利要求
1.一種能夠抑制自身免疫性疾病的疫苗，包含抗原肽和編碼所述肽的DNA，其中所述抗原肽/DNA刺激iTreg細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的疫苗，其中所述抗原與選自變態(tài)反應(yīng)、哮喘和自身免疫性疾病的病狀相關(guān)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的疫苗，其中所述抗原與變態(tài)反應(yīng)或哮喘相關(guān)并且選自屋塵螨I肽、其片段及其變體。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的疫苗，其中所述抗原與自身免疫性疾病相關(guān)并且選自胰島素肽、髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白、髓鞘堿性蛋白和少突膠質(zhì)細(xì)胞特異性蛋白、透明帶蛋白肽、屋塵螨I肽、α -肌球蛋白肽、柯薩奇病毒B4結(jié)構(gòu)蛋白肽、A群鏈球菌Μ5蛋白肽、(Q/R) (Κ/R) RAA, II型膠原蛋白肽、甲狀腺過氧化物酶、甲狀腺球蛋白、pendrin肽、乙酰膽堿受體肽、人S抗原、其片段及其變體。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的疫苗,其中載體包含所述DNA。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的疫苗,其中所述載體選自pVAX、pcDNA3.0和provax。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的疫苗，其中所述載體和抗原肽的質(zhì)量比選自5:1和1: 5;和 1:1 和 2: I。
8.一種疫苗接種試劑盒,包含疫苗施用設(shè)備和根據(jù)權(quán)利要求1所述的疫苗。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的試劑盒，其中所述疫苗施用設(shè)備選自疫苗槍、針和電穿孔設(shè)備。
10.一種治療自身免疫性疾病的方法，包括向有需要的患者施用根據(jù)權(quán)利要求1所述的疫苗。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述自身免疫性疾病為I型糖尿病。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述抗原選自胰島素肽、其片段或其變體。
13.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述自身免疫性疾病為多發(fā)性硬化。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述抗原選自髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白、髓鞘堿性蛋白和少突膠質(zhì)細(xì)胞特異性蛋白。
15.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述自身免疫性疾病為自身免疫性卵巢疾病。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述抗原選自透明帶蛋白肽、其片段及其變體。
17.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述自身免疫性疾病為塵螨變態(tài)反應(yīng)。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述抗原選自屋塵螨I肽、其片段及其變體。
19.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述自身免疫性疾病為心肌炎。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述抗原選自α-肌球蛋白肽、柯薩奇病毒B4結(jié)構(gòu)蛋白肽、A群鏈球菌Μ5蛋白肽、其片段及其變體。
21.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述自身免疫性疾病為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述抗原選自肽(Q/R)(K/R)RAA、II型膠原蛋白肽、其片段及其變體。
23.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述自身免疫性疾病為甲狀腺炎。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中所述抗原選自甲狀腺過氧化物酶、甲狀腺球蛋白、pendrin肽、其片段及其變體。
25.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述自身免疫性疾病為重癥肌無力。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中所述抗原選自乙酰膽堿受體肽、其片段及其變體。
27.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述自身免疫性疾病為自身免疫性葡萄膜炎。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述抗原選自人S抗原、其片段及其變體。
29.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述自身免疫性疾病為哮喘。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中所述抗原選自屋塵螨I肽、其片段及其變體。
全文摘要
本發(fā)明涉及使用含有抗原和編碼所述抗原的DNA的聯(lián)合疫苗治療和預(yù)防變態(tài)反應(yīng)、哮喘、自身免疫性疾病和移植排斥的癥狀。
文檔編號A61K39/35GK103200959SQ201180045538
公開日2013年7月10日 申請日期2011年9月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月27日
發(fā)明者王賓, 耿爽, 靳津 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)