專利名稱：Th1細胞因子免疫調(diào)節(jié)多肽及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物化學中的多肽技術，尤其是涉及一種來源于天然TLR2激動劑 HP-NAP的Thl細胞因子免疫調(diào)節(jié)多肽，本發(fā)明還涉及該多肽在開發(fā)Thl細胞因子免疫調(diào)節(jié)功能相關藥物中的應用。
背景技術：
人體免疫系統(tǒng)是機體防止病原體感染、清除腫瘤細胞和維持自身健康的重要防御體系，而⑶4+T輔助性淋巴細胞是執(zhí)行這一功能的重要環(huán)節(jié)。1986年Mosmarm等在研究小鼠⑶4+Th時發(fā)現(xiàn)了兩種不同類型的細胞因子產(chǎn)生克??；Thl細胞主要分泌IL-2、IFN- γ等細胞因子；而Th2細胞主要分泌IL-4、IL-10等細胞因子。Thl細胞因子可以增強殺傷性細胞的細胞毒作用，介導免疫應答，與機體抗腫瘤抗病毒有關；Th2細胞因子促進抗體產(chǎn)生， 增強體液免疫，與移植物耐受、抑制自身免疫疾病相關。HP-NAP能上調(diào)中性白細胞及單核細胞表面β 2整聯(lián)素的表達，促進中性白細胞及單核細胞與血管內(nèi)皮細胞的黏附及穿過內(nèi)皮細胞向感染部位轉(zhuǎn)移聚集。HP-NAP—旦從菌體中釋放出來，還可以穿過胃上皮細胞到達黏膜下層并激活巨噬細胞，巨噬細胞釋放的IL-6 進一步趨化和激活中性白細胞及單核細胞。2010年，Andrea Cappon等研究證實HP-NAP 可以通過促進機體釋放一些內(nèi)源性因子(IL-1 β等)延長單核細胞的壽命，并且可以通過單核細胞依賴的方式延長中性粒細胞的壽命。2006年Amedeo等報道HP-NAP是一種TLR2 (Toll-like receptor 2)激動劑，能夠誘導人中性粒細胞和單核細胞產(chǎn)生IL-12和IL-23 等細胞因子，使宿主抗原特異性⑶4+T細胞由Th2向Thl免疫反應轉(zhuǎn)變。因此HP-NAP可能成為逆轉(zhuǎn)Thl/Th2漂移，增強Thl反應的免疫調(diào)節(jié)效應分子。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種來源于天然TLR2激動劑HP-NAP的Thl細胞因子免疫調(diào)節(jié)多肽，本發(fā)明另一目的在于提供該多肽在開發(fā)Thl細胞因子免疫調(diào)節(jié)功能相關藥物中的應用。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明可采取下述技術方案
本發(fā)明所述的Thl細胞因子免疫調(diào)節(jié)多肽為16肽，其氨基酸序列為 Glu-Lys-Glu-Phe-Lys-Glu-Leu-Ser-Asn-Thr-Ala-Glu-Lys-Glu-Gly-Asp ο本發(fā)明的Thl細胞因子免疫調(diào)節(jié)多肽在制備Thl細胞因子免疫調(diào)節(jié)劑中的應用。所述免疫調(diào)節(jié)劑為惡性腫瘤、哮喘等多肽類免疫調(diào)節(jié)劑。本發(fā)明的優(yōu)點在于采用免疫信息學手段，預測天然TLR2激動劑HP-NAP最小功能結(jié)構域，采用標準的Fmoc方案進行合成，經(jīng)HPLC/MS鑒定后，用體外細胞模型驗證其對Thl 細胞因子免疫調(diào)節(jié)功能。鑒定出的Thl細胞因子免疫調(diào)節(jié)多肽序列未見文獻與專利報道， 為基于Thl細胞因子調(diào)節(jié)為機理的免疫調(diào)節(jié)藥物研發(fā)提供了制備與篩選技術。
圖1為本發(fā)明多肽的質(zhì)譜分析圖2為RT-PCR鑒定本發(fā)明多肽napP102刺激PBMCs后IFN- γ表達結(jié)果。圖3為RT-PCR鑒定本發(fā)明多肽napP102刺激PBMCs后IL-4表達結(jié)果。圖4為本發(fā)明多肽napP102與MAGE-A3共同作用后的殺傷效果。
具體實施例方式本發(fā)明所述的Thl細胞因子免疫調(diào)節(jié)多肽為16肽，記為napP102，依據(jù)天然TLR2 激動劑HP-NAP的第102 - 117位的氨基酸序列進行Fmoc固相合成，HPLC分離純化，MS進行鑒定，其氨基酸序列為
Glu-Lys-Glu-Phe-Lys-Glu-Leu-Ser-Asn-Thr-Ala-Glu-Lys-Glu-Gly-Asp ；分子量為 1853.958。本發(fā)明的Thl細胞因子免疫調(diào)節(jié)多肽在制備Thl細胞因子免疫調(diào)節(jié)劑(如惡性腫瘤、哮喘等多肽類免疫調(diào)節(jié)劑)中的應用。本發(fā)明主要采用免疫信息學手段，運用SYFPEITHI、IEDB, NetMHC2. 2數(shù)據(jù)庫對 HP-NAP的功能結(jié)構域進行預測分析，設計HP-NAP多肽序列。Kolaskar和Tongaonkar方法進行評價，篩選獲得多肽序列采用標準的Fmoc方案進行合成，經(jīng)HPLC純化后，質(zhì)譜鑒定。肽質(zhì)譜鑒定圖見圖1。本發(fā)明多肽napP102制備的基本流程為首先將一個氨基被Fmoc基團保護的氨基酸連接在不溶性固相載體Wang樹脂上，然后脫掉氨基的保護基，第一個氨基酸即連接至固相載體上；其次將氨基被Fmoc基團保護的第二個氨基酸的羧基用縮合劑活化，活化后的氨基酸再與已接在固相載體的第一個氨基酸的氨基反應形成肽鍵，此時在固相載體上就生成了一個帶有保護基的二肽。重復上述的肽鍵形成反應，使肽鏈從C端向N端生長，直至達到所需要的肽鏈長度，最后切割得到目的肽。經(jīng)HPLC純化后，其純度大于90%，質(zhì)譜分析并證實其分子量符合理論值。(參見①黃惟德、陳常慶著，多肽合成，科學出版社，1985年。 ②.N.休厄德、H. D.賈庫布克著，劉克良等譯，肽化學與生物學，科學出版社，2005年。)
人外周血單個核細胞(PBMCs)的分離誘導及RT-PCR實驗和LDH實驗檢測抽取健康供者的外周血經(jīng)密度梯度離心分離，獲得PBMCs，添加白細胞介素2 (IL-2，P印rotech公司) 誘導分化⑶4 + T細胞，進一步在體外RT-PCR實驗和LDH實驗進行驗證。方法如下
1. PBMCs的分離與誘導(1)以40ml PBS (PH 7. 2)稀釋抗凝處理后的外周血40ml ； (2)離心管中加入細1 Lymphoprep分離液(Axis-Shield公司)；(3)加8ml步驟(1)中稀釋后的外周血于4ml Lymphoprep分離液液面上；(4) 20°C離心(2000rmpX20min) ； (5)離心后，分為四層，棄去最上層，用玻璃吸管吸取第二層即白膜層(富含PBMCs); (6)吸出的白膜層用PBS CpH 7. 2)離心洗滌兩次；(7)用M孔板鋪板，細胞的濃度為IX 10 6/ml，每孔 Iml ； (8)第二天每孔加入50ug表位肽，同時設立PBS組作為陰性對照，PHA(10ug每孔)作為陽性對照。(9)第三天每孔加入50U IL-2，荷肽72h后收細胞進行RT-PCR檢測IFN- γ 和IL-4表達情況。2. RT-PCR 實驗
41)RNA的提取(1)將離心后的PBMCs，倒去培養(yǎng)液，室溫下不洗滌細胞直接加入Iml 裂解液，反復吹打使細胞完全裂解；(2)將懸液轉(zhuǎn)入1.5 ml EP管，室溫放置5 min，使核蛋白完全分離；(3)加入200 μ 1氯仿，劇烈振蕩15~30s，室溫靜置5min后，12000g，15min離心；(4)小心吸取上層水相移至新EP管中(共3層，避免吸取下面兩層)；(5)加等體積異丙醇，靜置10min，7500g，離心IOmin ； (6)棄上清，用75%乙醇洗滌，振蕩，混勻，12000g，離心 5min ;(7)棄上清，干燥 lOmin，加入 20~30μ 1，0. 01% DEPC 水溶解，55~60 "C (lOmin)，使之溶解。2)反轉(zhuǎn)錄過程
(1)在冰浴的試管中加入下列反應混合物 總 RNA: (l~5yg)5μ 1
引物0lig0(dT) (0. 5μ g/μ 1) 1μ 1 無RNase去離子水，定容至 12 μ 1
(2)輕輕混勻后離心3巧s；
(3)反應混合物在70°C水浴5min，然后離心34s ；
(4)將試管冰浴，再加入以下組分 5xReaction Buffer4 μ 1
RNase In hibiter (20U/μ 1) 1 μ 1
dNTP Mix (10 mmol/1)2 μ 1
M-MulvRT (20U/ul)1 μ 1 終體積為 20 μ 1
(5)反應混合物42°C，水浴60min ；
(6)在70°C加熱lOmin，終結(jié)反應，置冰上或冷凍保存(_20°C)。3)以cDNA為模板，應用針對IFN-γ和IL-4的特異引物(引物見表1)，進行PCR， 20ul 反應體系:2XTaq PCR MasterMix 10 μ 1 ；上、下游引物各 0. 5 μ 1 ；cDNA 0. 5 μ 1 ；ddH20 8. 5 μ 1。PCR反應參數(shù)如下
1.T=95. 0°C 0. 5min
2.T=94. 0°C30s
3.T=64. 0°C 40s -0. 7°C +0:00
R=3. 0°C /s + 0. O
4.T=72. 0°C
2
Imin REP 15 30s 0:00 Imin REP 20 IOmin
40s
5.GCTC
6.T=94. 0°C
7.T=53. 0°C
8.T=72. 0°C
9.Go to 6
10.T=72. 0°C
11.Hold on 16°C
結(jié)果見圖2與圖3，肌寸0 實驗結(jié)果顯示，候選表位11^^102能夠誘導健康供者外周血 IFN-Y的表達。
表1 =IFN- γ和IL-4的特異引物
權利要求
1.一種Thl細胞因子免疫調(diào)節(jié)多肽，其特征在于該多肽為16肽，其氨基酸序列為 Glu-Lys-Glu-Phe-Lys-Glu-Leu-Ser-Asn-Thr-Ala-Glu-Lys-Glu-Gly-Asp ο
2.根據(jù)權利要求1所述的Thl細胞因子免疫調(diào)節(jié)多肽在制備Thl細胞因子免疫調(diào)節(jié)劑中的應用。
3.根據(jù)權利要求1所述的Thl細胞因子免疫調(diào)節(jié)多肽在制備Thl細胞因子免疫調(diào)節(jié)劑中的應用，其特征在于所述免疫調(diào)節(jié)劑為惡性腫瘤、哮喘等多肽類免疫調(diào)節(jié)劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種Th1細胞因子免疫調(diào)節(jié)多肽為16肽，其氨基酸序列為Glu-Lys-Glu-Phe-Lys-Glu-Leu-Ser-Asn-Thr-Ala-Glu-Lys-Glu-Gly-Asp。本發(fā)明還公開了Th1細胞因子免疫調(diào)節(jié)多肽在制備Th1細胞因子免疫調(diào)節(jié)劑中的應用，所述免疫調(diào)節(jié)劑為惡性腫瘤、哮喘等多肽類免疫調(diào)節(jié)劑。本發(fā)明的優(yōu)點在于采用免疫信息學手段，預測天然TLR2激動劑HP-NAP最小功能結(jié)構域，采用標準的Fmoc方案進行合成，經(jīng)HPLC/MS鑒定后，用體外細胞模型驗證其對Th1細胞因子免疫調(diào)節(jié)功能。鑒定出的Th1細胞因子免疫調(diào)節(jié)多肽序列未見文獻與專利報道，為基于Th1細胞因子調(diào)節(jié)為機理的免疫調(diào)節(jié)藥物研發(fā)提供了制備與篩選技術。
文檔編號A61K38/10GK102516366SQ201210004099
公開日2012年6月27日 申請日期2012年1月9日 優(yōu)先權日2012年1月9日
發(fā)明者劉鑫, 康巧珍, 李國棟, 李黎, 汲振余, 祁元明, 翟文杰, 高艷鋒 申請人:鄭州大學