專利名稱：類葉升麻苷在制備防治阿爾茨海默病藥物中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及類葉升麻苷多靶點(diǎn)防治阿爾茨海默病的用途，屬醫(yī)藥領(lǐng)域范疇。
背景技術(shù)：
阿爾茨海默病是一種原發(fā)性灰質(zhì)腦病。其特點(diǎn)是大腦皮層萎縮，并伴有神經(jīng)原纖維纏結(jié)及老年斑，病程呈進(jìn)行性發(fā)展，最后導(dǎo)致癡呆，但病因不清。腦血管性癡呆則與腦溢血、腦血栓、腦動(dòng)脈硬化等有關(guān)，目前，臨床所用藥物雖然能改善腦溢血或腦栓塞等帶來的一些癥狀，但對改善記憶或智力障礙均無效。根據(jù)聯(lián)合國估計(jì)，10年后老年人將達(dá)5. 9億，2025年增至11億。AD不僅是老年人群的最大健康殺手，還已成為現(xiàn)代社會老年人的主要致死疾病之一，嚴(yán)重威脅人類晚年精神健康和生活質(zhì)量，給社會、家庭帶來沉重的負(fù)擔(dān)和壓力，已引起社會普遍關(guān)注，成為不可忽視的社會公共衛(wèi)生難題。因此針對老年癡呆的治療藥物的研究有著重要的醫(yī)學(xué)和社會學(xué)意義。 目前阿爾茨海默病的發(fā)病機(jī)制尚未十分清楚，主要有3種假說0-淀粉樣蛋白級聯(lián)假說、Tau蛋白假說和神經(jīng)血管假說。此外，還有一些其他相關(guān)學(xué)說，如膽堿能學(xué)說、基因突變學(xué)說、神經(jīng)細(xì)胞凋亡學(xué)說、免疫異常學(xué)說、氧化應(yīng)激學(xué)說、炎性反應(yīng)學(xué)說等，但每種學(xué)說都不能圓滿的詮釋所有AD的病理現(xiàn)象?？傃灾?，阿爾茨海默病的發(fā)病機(jī)制異常復(fù)雜，涉及多條分子信號通路，包括AP、Tau蛋白及突觸異常等，各機(jī)制之間相互聯(lián)系，共同促使神經(jīng)元變性。迄今已有的治療方法皆針對某一靶點(diǎn)，臨床療效有限。類葉升麻苷為苯乙醇苷類的代表性成分，具有調(diào)節(jié)免疫、抗炎、抑制腫瘤生長、抗病毒和抗菌等廣泛的藥理學(xué)活性，類葉升麻苷也是多種藥用植物的活性成分之一，因而受到了國內(nèi)外學(xué)者的普遍關(guān)注，其多靶點(diǎn)的作用及作用機(jī)制的探討已成為近年來研究的熱點(diǎn)課題。目前，研究發(fā)現(xiàn)類葉升麻苷具有抗老年癡呆的潛能，如抗凋亡、抑制細(xì)胞遷移、減緩老化、抗氧化、抗動(dòng)脈粥樣硬化、促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)，改善記憶、抑制彈性蛋白酶活力和血小板聚集，抑制內(nèi)皮素的增加等。迄今為止，未見有類葉升麻苷多靶點(diǎn)治療阿爾茨海默病用途的相關(guān)報(bào)道。本發(fā)明針對阿爾茨海默病多發(fā)病機(jī)理的特點(diǎn)，對類葉升麻苷進(jìn)行多靶點(diǎn)作用的相關(guān)研究，最終證實(shí)類葉升麻苷具有多靶點(diǎn)防治阿爾茨海默病的用途。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供類葉升麻苷在制備防治阿爾茨海默病藥物中的用途，其中類葉升麻苷通過合成或從植物中制備得到的。通過試驗(yàn)表明采用相關(guān)藥理學(xué)試驗(yàn)進(jìn)行類葉升麻苷治療阿爾茨海默病的藥效學(xué)評價(jià)，分別從改善中樞膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)、調(diào)節(jié)谷氨酸水平、抑制3淀粉樣蛋白(A3)形成和沉積、神經(jīng)保護(hù)、抑制tau蛋白異常磷酸化、抗氧化、改善腦循環(huán)或者降低膽固醇方面，闡明類葉升麻苷多途徑、多靶點(diǎn)治療阿爾茨海默病的用途。本發(fā)明所述的一種類葉升麻苷在制備防治阿爾茨海默病藥物中的用途，該類葉升麻苷是通過多靶點(diǎn)作用防治阿爾茨海默病。
所述的類葉升麻苷的來源是從植物中制備得到或通過人工合成途徑得到。其中從植物中制備得到類葉升麻苷，是采用有機(jī)試劑提取、大孔樹脂或者柱層析分離、葡聚糖凝膠純化或者制備色譜制備或者重結(jié)晶等方法從含有類葉升麻苷的植物中獲得的。通過人工合成途徑是采用廉價(jià)、易得、低毒性、低污染的原料，經(jīng)過酯化反應(yīng)、官能團(tuán)間的轉(zhuǎn)換等方法合成得到。本發(fā)明所述的類葉升麻苷防治阿爾茨海默病，是通過改善中樞膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)、調(diào)節(jié)谷氨酸水平、抑制3淀粉樣蛋白(A3)形成和沉積、神經(jīng)保護(hù)作用、抑制tau蛋白異常磷酸化、抗氧化作用、改善腦循環(huán)以及降低膽固醇等途徑，從而實(shí)現(xiàn)多靶點(diǎn)防治阿爾茨海默病。其中所述的藥物為口服液、粉劑、片劑、膠囊劑、顆粒劑、丸劑。本發(fā)明所述的類葉升麻苷的結(jié)構(gòu)式為
HOOH HOO
\_ U hsZ / \=y
1OH
//HO 0 HO OH類葉升麻苷是指以干品重量計(jì)算類葉升麻苷含量在90-99. 9%。本發(fā)明所述的類葉升麻苷防治阿爾茨海默病的用途，通過試驗(yàn)表明類葉升麻苷能夠改善中樞膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)、調(diào)節(jié)谷氨酸水平、抑制3淀粉樣蛋白(A3)形成和沉積、神經(jīng)保護(hù)作用、抑制tau蛋白異常磷酸化、抗氧化作用、改善腦循環(huán)和降低膽固醇作用，從而達(dá)到多途徑多靶點(diǎn)治療阿爾茨海默病的目的。


圖I為本發(fā)明各組動(dòng)物腦組織海馬區(qū)鏡下觀察圖(XlO)圖。圖2為本發(fā)明各組動(dòng)物腦組織海馬區(qū)鏡下觀察圖(X40)圖。圖3為本發(fā)明類葉升麻苷對OA所致SK-N-SH細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響圖，其中I為OA模型組，2 為 5 ii g mL—1, 3 為 10 ii g mL—1,4 為 20 ii g mL—1, 5 為空白對照組。圖4為本發(fā)明類葉升麻苷對OA致神經(jīng)細(xì)胞骨架蛋白磷酸化的保護(hù)作用圖。
具體實(shí)施例方式以下具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，而不是限制本發(fā)明，不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的應(yīng)用范圍僅限于以下的實(shí)施例。實(shí)施例本發(fā)明所述的一種類葉升麻苷在制備防治阿爾茨海默病藥物中的用途，該類葉升麻苷是通過多途徑、多靶點(diǎn)作用，具體實(shí)驗(yàn)為類葉升麻苷對APP695V717I轉(zhuǎn)基因小鼠模型作用實(shí)驗(yàn)方法取同月齡同背景C57BL/6J小鼠為正常對照組，同月齡APP轉(zhuǎn)基因陰性小鼠作為陰性對照組，4月齡APP695V717I轉(zhuǎn)基因小鼠分為模型組和用藥組，持續(xù)飼養(yǎng)6個(gè)月至10月齡；采用Morris水迷宮和物體識別實(shí)驗(yàn)對小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的行為學(xué)進(jìn)行研究。采用放射免疫法、免疫組化法、免疫印跡法檢測海馬和皮層突觸素、突觸后致密物質(zhì)-95、a-突觸核蛋白(a-syn，AD病人腦內(nèi)老年斑另一核心成分)的表達(dá)，用透射電鏡觀察海馬神經(jīng)4突起內(nèi)線粒體、細(xì)胞骨架蛋白、突觸數(shù)目及突觸內(nèi)囊泡超微結(jié)構(gòu)變化，免疫熒光雙標(biāo)法檢測皮層及海馬神經(jīng)元a-syn分別與A3、泛素(Ub)及淀粉樣纖維共同定位，parkin蛋白分別與及a -syn于泛素ude共同定位。實(shí)驗(yàn)結(jié)果4月齡APP轉(zhuǎn)基因小鼠在Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中的潛伏期明顯延長；海馬CAl區(qū)神經(jīng)元突起內(nèi)超微結(jié)構(gòu)和突觸結(jié)構(gòu)基本正常，但突起內(nèi)線粒體結(jié)構(gòu)輕度腫脹并伴有部分內(nèi)嵴和外膜斷裂，突觸連接減少，突觸數(shù)密度有降低趨勢，突觸囊泡明顯減少 ’海馬 和皮層的突觸素和突觸后致密物質(zhì)-95(PSD-95)表達(dá)有降低趨勢；4月齡轉(zhuǎn)基因小鼠大腦海馬與皮層a-syn表達(dá)已明顯增加；10月齡APP轉(zhuǎn)基因小鼠在Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中潛伏期和游泳距離均明顯延長；物體識別實(shí)驗(yàn)中分辨指數(shù)也明顯下降；海馬CAl區(qū)突起內(nèi)線粒體腫脹、嵴斷裂甚至空泡化，突觸數(shù)量減少，突觸前后膜及突觸間隙結(jié)構(gòu)模糊不清，突觸后致密物質(zhì)變薄，神經(jīng)氈內(nèi)多數(shù)突觸小泡減少甚至消失；皮層和海馬CAl區(qū)、CA3區(qū)及齒狀回的突觸素表達(dá)明顯降低，皮層和海馬PSD-95蛋白表達(dá)明顯減少；10月齡轉(zhuǎn)基因小鼠大腦海馬與皮層中a-syn表達(dá)明顯增加；免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果顯示，10月齡轉(zhuǎn)基因小鼠海馬與皮層頂葉神經(jīng)元內(nèi)ct-syn、泛素分別與淀粉樣纖維存在共同定位；parkin分別與a-syn及泛素存在共同定位，提示a-syn經(jīng)由泛素-蛋白酶體途徑(UPP)降解異常，發(fā)生聚集，參與淀粉樣斑塊形成。不同劑量的類葉升麻苷灌胃給藥6個(gè)月可明顯縮短10月齡APP轉(zhuǎn)基因小鼠Morris水迷宮的潛伏期和游泳距離；提高其在物體識別實(shí)驗(yàn)中的分辨指數(shù)，減輕模型小鼠神經(jīng)元突觸損傷，使模型小鼠海馬CAl區(qū)神經(jīng)氈突起內(nèi)線粒體輪廓清晰，嵴多而明顯，突觸連接豐富，結(jié)構(gòu)基本正常，突觸前后膜及突觸間隙結(jié)構(gòu)清晰，突觸后致密物增厚，囊泡數(shù)量增加；增加APP轉(zhuǎn)基因模型小鼠皮層及海馬突觸素和PSD-95蛋白的表達(dá)。類葉升麻苷能抑制10月齡APP轉(zhuǎn)基因小鼠皮層及海馬中a-syn蛋白過表達(dá)和聚集。類葉升麻苷使a-syn降解的主要途徑-泛素-蛋白酶體途徑中的關(guān)鍵成分泛素、parkin、UCH-Ll、HSP70的表達(dá)都有所提高，提示類葉升麻苷通過促進(jìn)a-syn降解以發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。對線粒體呼吸鏈復(fù)合體IV抑制劑疊氮鈉擬AD細(xì)胞模型作用實(shí)驗(yàn)方法培養(yǎng)貼壁SH-SY5Y細(xì)胞用0. 25%胰酶消化，細(xì)胞計(jì)數(shù)后以每孔I X IO6個(gè)/ml加到細(xì)胞板上，培養(yǎng)過夜，待鋪成單層后吸除原培養(yǎng)基，分別設(shè)空白對照、正常對照、陽性對照及加入不同濃度供試品孔與SH-SY5Y細(xì)胞預(yù)孵育24h后，棄去培養(yǎng)液，加入5OmmoI I/1疊氮鈉損傷4h,測定各項(xiàng)指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用MTT法和乳酸脫氫酶(LDH)漏出率測定法測定線粒體膜電位的影響，結(jié)果疊氮鈉與培養(yǎng)的SH-SY5Y細(xì)胞共孵育后，細(xì)胞線粒體細(xì)胞色素C氧化酶活性下降，細(xì)胞存活率下降，且呈時(shí)間及劑量依賴性，細(xì)胞線粒體跨膜電位的熒光強(qiáng)度值下降，尤其是細(xì)胞突起降低最為顯著。給予不同劑量的類葉升麻苷后，損傷情況得到了顯著的改善。
類葉升麻苷對活性氧過氧化氫(H2O2)致神經(jīng)細(xì)胞損傷模型影響實(shí)驗(yàn)方法采用MEM培養(yǎng)基，在5% CO2, 37 °C的孵箱中培養(yǎng)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞，將SYSY細(xì)胞以密度為IX IO5 -mr1接種于培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞生長至90%時(shí)，制成2X105 -mr1的細(xì)胞懸液，更換無血清培養(yǎng)基，接種于培養(yǎng)皿中，分組(空白對照組、正常對照組、陽性對照組和給藥組)，給藥組細(xì)胞加入不同濃度的供試品孵育24h后，吸去培養(yǎng)基，PBS洗I次，加入H2O2 (500 u mo I L—1)損傷18h，棄去培養(yǎng)基，制成單細(xì)胞懸浮液，進(jìn)行后續(xù)測試。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用酶標(biāo)儀和流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測供試品對細(xì)胞內(nèi)SOD活性及細(xì)胞內(nèi)R0S、NO和GSH含量的影響，結(jié)果濃度為10、20、40mg kg—1的類葉升麻苷使活性氧的釋放分別降低了 40% (P < 0. 05) ,32% (P < 0.01)和 25% (P < 0. 05), NO 的釋放分別降低了29% (P < 0.01),37% (P < 0. 05)和51% (P < 0. 01)，同時(shí)不同劑量的類葉升麻苷有明顯抑制GSH降低的作用，表明類葉升麻苷能夠抑制過氧化氫誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞氧化損傷， 有神經(jīng)保護(hù)作用。采用Western-blot方法通過檢測caspase-3、caspase-9、Bcl-2和Bax的表達(dá)水平，結(jié)果類葉升麻苷三個(gè)劑量組與模型組相比較，caspase-3的含量分別減少了30% (P < 0. 01) ,89% (P < 0. 01)和 95% (P < 0. 01)，caspase-9 的含量分別減少了 77%(P < 0. 01) ,101% (P < 0. 01)和 85% (P < 0. 01)，Bcl-2 分別增加了 76% (P < 0. 01)、117% (P < 0.01)和94% (P < 0.01)，對Bax沒有影響，表明類葉升麻苷可能通過抗氧化作用抑制過氧化氫誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡，從而起到保護(hù)神經(jīng)的作用。類葉升麻苷對東莨菪堿致小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的改善作用實(shí)驗(yàn)方法將昆明種小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，經(jīng)小鼠跳臺測試去掉不符合條件的小鼠，其中包括先天愚笨的和特別聰明的，然后對經(jīng)過行為學(xué)實(shí)驗(yàn)篩選合格的72只小鼠，采用PEMS 3. I醫(yī)用統(tǒng)計(jì)軟件，以體重為指標(biāo)，隨機(jī)分為6組，每組各12只，給藥組口服給予劑量分別為30、60、120mg kg—1的類葉升麻苷以及石杉堿甲片，空白對照組、模型組給予等量的生理鹽水，在進(jìn)行小鼠行為學(xué)實(shí)驗(yàn)之前，除空白對照組外，其余各組小鼠均分別腹腔注射東莨菪堿3mg kg'腹腔注射體積為0. ImL (IOg)'空白對照組腹腔注射等容量生理鹽水。15min后按實(shí)驗(yàn)安排進(jìn)行小鼠跳臺試驗(yàn)以及水迷宮試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果模型組小鼠逃避潛伏期明顯低于空白對照組(P < 0.01)，石杉堿甲片陽性對照組可延長小鼠逃避潛伏期(P < 0. 05)，類葉升麻苷低、中、高劑量組均可顯著延長小鼠逃避潛伏期(P<0.01);此外類葉升麻苷低、中、高劑量組均能使小鼠由于學(xué)習(xí)記憶能力下降引起的跳臺錯(cuò)誤次數(shù)降低(P < 0. 01)。提示東莨菪堿破壞了小鼠被動(dòng)回避學(xué)習(xí)記憶能力，而類葉升麻苷可以翻轉(zhuǎn)東莨菪堿對小鼠被動(dòng)回避學(xué)習(xí)記憶能力的損傷。表I類葉升麻苷對小鼠跳臺成績的影響(&士S，n = 12)
權(quán)利要求
1.一種類葉升麻苷在制備防治阿爾茨海默病藥物中的用途，其特征在于類葉升麻苷是通過多靶點(diǎn)作用防治阿爾茨海默病。
全文摘要
本發(fā)明涉及類葉升麻苷在制備治療阿爾茨海默病藥物中的用途，該類葉升麻苷是通過多靶點(diǎn)作用防治阿爾茨海默病。所述的類葉升麻苷通過人工合成或從植物中得到。通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)類葉升麻苷能夠改善改善中樞膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)、調(diào)節(jié)谷氨酸水平、抑制β淀粉樣蛋白(Aβ)形成和沉積、神經(jīng)保護(hù)作用、抑制tau蛋白異常磷酸化、抗氧化作用、改善腦循環(huán)以及降低膽固醇等途徑，從而實(shí)現(xiàn)多靶點(diǎn)防治阿爾茨海默病。
文檔編號A61K31/7032GK102755341SQ201210240638
公開日2012年10月31日 申請日期2012年7月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月12日
發(fā)明者彭曉明, 閆明, 霍仕霞, 高莉, 黃毅 申請人:閆明