黑果枸杞多糖在制備免疫調(diào)節(jié)藥物或保健品中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及黑果枸杞多糖在制備免疫調(diào)節(jié)藥物或保健品中的應(yīng)用，所述黑果枸杞多糖是由黑果枸杞果實經(jīng)熱水提取、乙醇沉淀、脫蛋白、脫色后得到的一組分子量在80kDa～22kDa的糖蛋白復(fù)合物。本發(fā)明在動物實驗發(fā)現(xiàn)，黑果枸杞多糖可明顯提高免疫抑制小鼠脾及胸腺指數(shù)、提高免疫抑制小鼠淋巴細胞水平；增強免疫抑制小鼠遲發(fā)超敏反應(yīng)能力；增強免疫抑制小鼠抗體分泌水平。細胞實驗發(fā)現(xiàn)黑果枸杞多糖可顯著的提高小鼠脾細胞增殖率，促進小鼠巨噬細胞株RAW264.7分泌TNF-α和NO等免疫因子，證明黑果枸杞多糖具有很好的免疫活性。
【專利說明】黑果枸杞多糖在制備免疫調(diào)節(jié)藥物或保健品中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及食品保健和醫(yī)藥領(lǐng)域，具體的說是黑果枸杞多糖在制備免疫調(diào)節(jié)藥物或保健品中的應(yīng)用
【背景技術(shù)】
[0002]近年來，免疫功能低下，包括原發(fā)性及繼發(fā)性免疫功能缺陷、缺乏或受損，受到國內(nèi)外研究者的廣泛關(guān)注，因為它們本身及所誘發(fā)的各種并發(fā)癥，特別是感染，常使病人的病情加重，難以治療，并可引起嚴重的后果，甚至危及生命。因此，尋找安全的改善機體免疫功能的藥物將會挽救更多的患者，在衛(wèi)生保健行業(yè)有很好的應(yīng)用前景。
[0003]黑果枸杞(Lyciumruthenicum Murr)系爺科(Solanaceae)枸杞屬(Lycium L.),是我國西北荒漠地區(qū)一種特有的的野生植物，分布于寧夏、甘肅、青海、新疆、西藏等省。黑果枸杞果實味甜多汁，含豐富的維生素、有機酸及糖類；黑果枸杞也具有醫(yī)療保健功能，藏醫(yī)用于治療心熱病、心臟病、月經(jīng)不調(diào)、停經(jīng)等病癥。多糖廣泛存在于中藥材中，現(xiàn)代藥理學(xué)研究證明，多糖是中草藥發(fā)揮獨特療效的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。多糖可通過激活免疫細胞，促進細胞因子生成及表達，對免疫系統(tǒng)發(fā)揮多方面的免疫調(diào)節(jié)作用。黑果枸杞多糖作為黑果枸杞的一個重要組成成分，研究表明其有降血糖和抗疲勞功效，而針對黑果枸杞的免疫活性未見報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于黑果枸杞多糖在制備免疫調(diào)節(jié)藥物或保健品中的應(yīng)用，為臨床提供適合免疫功能低下 患者及亞健康人群服用的藥品或保健品。
[0005]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:
[0006]所述黑果枸杞多糖可提高小鼠脾細胞增殖率，促進小鼠巨噬細胞株RAW264.7分泌免疫相關(guān)細胞因子，提高免疫抑制小鼠的非特異性免疫、細胞免疫、體液免疫等功能。
[0007]所述黑果枸杞多糖與藥物學(xué)上可接受的藥物/保健品輔料混合形成各種形式的散劑、膏劑、粉劑、針劑、水劑或注射劑。
[0008]在使用時可采取口吸取、皮下、靜脈注射或肛腸給藥；注射液的使用可以任意選用生理鹽水、葡萄糖、穩(wěn)定劑、懸浮劑或乳化劑等。
[0009]本發(fā)明具有如下優(yōu)點:
[0010]I本發(fā)明表明黑果枸杞多糖具有免疫調(diào)節(jié)活性，黑果枸杞多糖是黑果枸杞的主要功效成分，具有多種保健功效，純天然，無副作用，可開發(fā)成免疫調(diào)節(jié)保健品。
[0011]2根據(jù)實施例1:實驗證明黑果枸杞多糖可明顯提高免疫抑制小鼠脾及胸腺指數(shù)、提高免疫抑制小鼠淋巴細胞水平；增強免疫抑制小鼠的細胞免疫功能如提高遲發(fā)超敏反應(yīng)能力；增強免疫抑制小鼠的體液免疫功能如提高抗體分泌水平。因此，黑果枸杞多糖具有較強的免疫調(diào)節(jié)活性，有望為臨床提供一種非常適合免疫功能低下人群服用的藥品。
[0012]3根據(jù)實施例3和4:實驗證明在細胞水平上，黑果枸杞可誘導(dǎo)巨噬細胞分泌TNF-α和NO等免疫因子。根據(jù)本發(fā)明實驗結(jié)論，為黑果枸杞調(diào)節(jié)免疫機理進行進一步的研究，確定其作用機理，可開發(fā)成免疫冶療藥物。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1黑果枸杞多糖誘導(dǎo)脾細胞增殖；
[0014]圖2黑果枸杞多糖對RAW264.7細胞TNF- α的激活作用；
[0015]圖3黑果枸杞多糖對RAW264.7產(chǎn)生NO的影響。
【具體實施方式】
[0016]本發(fā)明采用黑果枸杞多糖是由黑果枸杞果實經(jīng)水提法得到的一組分子量在80kDa~22kDa的糖蛋白復(fù)合物，通過整體動物實驗及細胞生物學(xué)實驗發(fā)現(xiàn)黑果枸杞具有免疫調(diào)節(jié)活性。
[0017]實施例1動物實驗評價黑果枸杞多糖的免疫活性
[0018](I)受試樣品:黑果枸杞多糖，由中國科學(xué)院大連化物所糖工程研究組制備。
[0019]黑果枸杞多糖(LRP)的制備方法:黑果枸杞果實加4倍體積的水用組織搗碎機打碎至均勻狀態(tài)，加熱超聲法(提取條件:溫度70°C，超聲波頻率40KHz，功率50W)提取2h，將提取液離心(6000r/min, IOmin),殘洛用2倍體積的水再次加熱超聲提取Ih,合并兩次提取液，濃縮，以4倍體積乙醇醇沉24h， 抽濾，沉淀用50倍體積的水溶解，將Sevage試劑[氯仿:正丁醇=4:1(V/V)]加入樣品中，所加Sevage試劑體積為樣品體積的1/5，震蕩15min，經(jīng)離心(6000r/min，10min)以去除游離蛋白形成的凝膠狀沉淀，取上層清液。滴加少量氨水(NH3 -H2O)將上層清液pH調(diào)至9，緩慢向溶液中加入3%H202，在40°C條件下攪拌6h，至顏色變?yōu)榈S色。加0.5mol/L HCl調(diào)pH至中性，透析，減壓濃縮后冷凍干燥，得到黑果枸杞多糖 LRP (Lycium ruthenicum polysaccharides) ?
[0020]黑果枸杞多糖五個主要組分(LRP1-LRP5)的制備方法:采用弱堿型陰離子交換樹脂(DEAE-纖維素)對黑果枸杞多糖進行組分分離，先用3倍柱體積0.05mol/L NaHCO3溶液平衡DEAE-52纖維素層析柱。將黑果枸杞多糖(LRP)配成20mg/mL的水溶液后上樣，依次用蒸餾水，0.05,0.1,0.25和0.5mol/L NaHCO3溶液梯度洗脫，洗脫流速為1.0mL/min，將五種洗脫流分收集后，分別減壓濃縮，透析除鹽，冷凍干燥，得到5個黑果枸杞多糖組分，即LRP1、LRP2、LRP3、LRP4 和 LRP5。
[0021](2)實驗動物:雌性昆明小鼠，清潔級動物，6~8周齡，20±2g，由大連醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，批準號為SCXK (遼)2008-0002，清潔級動物房飼養(yǎng)，溫度20±1°C，濕度40%~50%，光照12h，顆粒飼料喂養(yǎng)，自由飲水。
[0022](3)檢測項目:小鼠體重、脾臟和胸腺重；血象檢測；細胞免疫功能檢測，采用足趾腫法測定遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)；體液免疫功能檢測，測定血清半數(shù)溶血值。
[0023](4)實驗方法:將小鼠隨機分為4組(空白對照組、免疫抑制模型組、黑果枸杞多糖低劑量組、黑果枸杞多糖高劑量組)，每組5只(n=5)，除對照組外，其余各組采取連續(xù)5d皮下注射環(huán)磷酰胺80mg/kg的方法制造免疫功能低下模型，模型制備成功后，黑果枸杞多糖低劑量組(IOmg.kg-1.0-1)和黑果枸杞多糖高劑量組(30mg.kg-1.cf1)采取腹腔注射的方式給藥，空白對照組和免疫抑制模型組用生理鹽水給藥，注射量按0.lmL/10g體重計，連續(xù)給藥lOd。按照中華人民共和國衛(wèi)生部《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》進行上述項目的檢測。
[0024]實驗各組小鼠給藥IOd后，采血抗凝后用血細胞計數(shù)儀檢測小鼠血象。末次給藥前12h，動物禁食，不禁水，停藥24h后各組動物處死后，取脾臟、胸腺，稱濕重并按公式計算脾和胸腺指數(shù)。
[0025]脾指數(shù)=脾重量(mg) /體重(g)胸腺指數(shù)=胸腺重量(mg) /體重(g)
[0026]各組小鼠在給藥第3d，用2%綿羊紅細胞腹腔注射，每只小鼠注射0.2mL致敏，5d后測量右后足跖部厚度，然后在測量部位皮下注射20%綿羊紅細胞，每只小鼠20 μ L，24h后測量右后足跖部厚度，測量三次取平均值，計算足跖增加厚度(mm)，以足跖增加厚度表示DTH程度。
[0027]各組小鼠于給藥第3d，腹腔注射2%SRBC 0.2mL致敏。末次給藥后24h，處死動物，小鼠摘眼球取血，分離血清，用生理鹽水將血清稀釋200倍，將稀釋后的血清ImL置試管內(nèi)，依次加入10%的綿羊紅細胞0.5mL，補體ImL (用生理鹽水按1:10稀釋)，另設(shè)不加血清的對照管(以生理鹽水代替)。置37°C恒溫水浴鍋中保溫15min，冰浴中終止反應(yīng)，2000r/min離心lOmin。取上清夜lmL、生理鹽水3mL于試管內(nèi)，同時取10%的SRBC0.25mL于另一支試管內(nèi)，充分混勻，放置IOmin后，于540nm處分別測定各管的光密度值。
[0028]半數(shù)溶血值HC5tl=(樣品OD值/SRBC半數(shù)溶血時OD值)X稀釋倍數(shù)
[0029](4)結(jié)果:
[0030]黑果枸杞多糖對小鼠免疫器官重量的影響:從表1看出，與空白對照組相比，免疫抑制模型組小鼠脾指數(shù)、胸腺指數(shù)均低于空白對照組，差異顯著。與模型對照組比較，黑果枸杞低劑量組和高劑量組均明顯提高免疫抑制小鼠的脾指數(shù)和胸腺指數(shù)。
[0031]表1黑果枸杞多糖對小鼠臟器指數(shù)的影響(X土S，n=5)
【權(quán)利要求】
1.黑果枸杞多糖在制備免疫調(diào)節(jié)藥物或保健品中的應(yīng)用。
2.按照權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于:所述黑果枸杞多糖與藥物學(xué)上可接受的藥物/保健品輔料混合形成`各種形式的散劑、膏劑、粉劑、針劑、水劑或注射劑。
【文檔編號】A61P37/04GK103655598SQ201210337716
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2012年9月12日 優(yōu)先權(quán)日:2012年9月12日
【發(fā)明者】杜昱光, 彭強, 孟慶山, 許青松, 李曙光, 王文霞 申請人:中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所