一種d型多肽介導(dǎo)的靶向脂質(zhì)體及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬藥物制劑領(lǐng)域，涉及一種D型多肽介導(dǎo)的靶向脂質(zhì)體及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明涉及一種D型多肽介導(dǎo)的靶向脂質(zhì)體，其特征在于，該靶向脂質(zhì)體的組成為：.磷脂、膽固醇、.甲氧基聚乙二醇-磷脂復(fù)合物、D型多肽介導(dǎo)的靶向高分子材料；各成分之間的摩爾比為：a：b=5：1～1：5，a：c=1000：1～1000：100，a：d=1000：0.1～1000：100。由于D型多肽與相對應(yīng)的L型多肽相比穩(wěn)定性有顯著提高，因此本發(fā)明得到的D型多肽介導(dǎo)的靶向脂質(zhì)體顯示出更好的腫瘤靶向性與抗腫瘤作用。該靶向脂質(zhì)體可用于腫瘤診斷或治療藥物的靶向遞送。
【專利說明】一種D型多肽介導(dǎo)的靶向脂質(zhì)體及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬藥物制劑領(lǐng)域，涉及靶向脂質(zhì)體制劑，具體說是一種D型多肽介導(dǎo)的靶向脂質(zhì)體。本發(fā)明專利涉及D型多肽介導(dǎo)的靶向高分子材料、D型多肽介導(dǎo)的靶向脂質(zhì)體、載藥脂質(zhì)體、制備方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]惡性腫瘤一直是困擾人類的重要疾病，目前尚無治愈癌癥的方法。常用的化學(xué)藥物療法，由于其選擇性差，毒副作用大，在應(yīng)用上受到極大的限制。因此，開發(fā)一種能將化療藥物選擇性地濃集在腫瘤組織，并且將其高效地載入腫瘤細(xì)胞的具有腫瘤靶向性的載體就具有十分重要的意義。
[0003]由于腫瘤組織對具有一定粒徑的納米顆粒(10_500nm)具有EPR(高通透性和滯留)效應(yīng)，即處在血循環(huán)中的納米顆?？杀粍影邢蛑聊[瘤組織，發(fā)揮所包載藥物的抗腫瘤作用。目前，已有多種利用此效應(yīng)用于腫瘤靶向治療的納米遞藥系統(tǒng)上市，如阿霉素脂質(zhì)體、順鉬脂質(zhì)體和紫杉醇白蛋白納米粒。同時(shí)由于腫瘤細(xì)胞或腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)有一系列特異性受體，研究者們利用其配體修飾納米遞藥系統(tǒng)，以實(shí)現(xiàn)對腫瘤組織的主動靶向遞藥。
[0004]脂質(zhì)體因具有良好的生物相容性，對被包載的藥物具有保護(hù)作用以及良好的藥動學(xué)特征被認(rèn)為是非常有前途的腫瘤靶向載體。在脂質(zhì)體表面連接配體或抗體，可以使脂質(zhì)體獲得主動靶向。其中，多肽配基以其分子量小、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)在遞藥系統(tǒng)導(dǎo)向分子中占有重要地位。目前常用的多肽配基為天然L型多肽，由于體內(nèi)存在大量蛋白多肽水解酶，L型多肽在體內(nèi)易被降解，失去靶向活性。
[0005]因此，為了克服傳統(tǒng)的L型多肽配基在生理環(huán)境下穩(wěn)定性不理想，易被酶降解的局限性，研究者開展了大量的工作以提高生物活性多肽的穩(wěn)定性，采用的策略包括多肽側(cè)鏈改造、非天然氨基酸替換、結(jié)構(gòu)環(huán)化等。最終，Chorev和Goodman等人提出的逆反化(retro-1nverso)技術(shù)為獲取穩(wěn)定性多肽提供了新的思路。通過逆反化技術(shù)獲得的D型多肽具有高度穩(wěn)定性。通過穩(wěn)定性更強(qiáng)的D型多肽介導(dǎo)有望為腫瘤主動靶向治療及其納米載體設(shè)計(jì)提供新的思路，實(shí)現(xiàn)更優(yōu)的治療效果，顯示出良好的潛在應(yīng)用價(jià)值。
[0006]Neuropilin-1 (NRP-1)是細(xì)胞表面的一種I型跨膜糖蛋白，通常表達(dá)在一些腫瘤細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞表面，是血管內(nèi)皮生長因子165 (VEGF165)的受體，在腫瘤轉(zhuǎn)移、血管新生、調(diào)節(jié)血管通透性等方面發(fā)揮重要功能。人神經(jīng)膠質(zhì)瘤臨床病理標(biāo)本中有NRP-1顯著表達(dá)，且其表達(dá)量隨神經(jīng)膠質(zhì)瘤惡性程度增加而增加，但在相應(yīng)的正常組織上皮細(xì)胞中卻沒有表達(dá)。目前已有研究者利用NRP-1受體抑制劑來抑制腫瘤血管新生從而達(dá)到抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的目的。多肽RPARPAR、RPAKPAR、RGERPPR、PVTRPPR、APARPAP等是通過噬菌體展示技術(shù)篩選得到的直鏈七肽，是NRP-1的配體，它們對NRP-1高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞和腫瘤血管表現(xiàn)出特異親和性，且具有介導(dǎo)噬菌體穿透腫瘤血管進(jìn)入腫瘤組織內(nèi)部的能力。
[0007]本發(fā)明利用逆反化技術(shù)，設(shè)計(jì)了上述這些靶向多肽對應(yīng)的D型多肽:dRdAdPdRdAdPdR, dRdPdPdRdEGdR、dRdAdPdKdAdPdR、dRdPdPdRdTdVdP, dPdAdPdRdAdPdA,并將其用于修飾脂質(zhì)體遞藥系統(tǒng)。該系統(tǒng)可通過靜脈注射給藥，利用腫瘤EPR效應(yīng)和D型多肽介導(dǎo)作用將其靶向至腫瘤部位，且能在體內(nèi)停留較長的時(shí)間。此脂質(zhì)體遞藥系統(tǒng)可用作腫瘤診斷或治療藥物的靶向遞送。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的是提供一種D型多肽介導(dǎo)的靶向高分子材料、靶向脂質(zhì)體、載藥脂質(zhì)體、制備方法及應(yīng)用。
[0009]為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
一種D型多肽介導(dǎo)的靶向脂質(zhì)體，其特征在于，該靶向脂質(zhì)體的組成為:
a.磷脂；
b.膽固醇；
c.甲氧基聚乙二醇-磷脂復(fù)合物；
d.D型多肽介導(dǎo)的靶向高分子材料；
上述各成分之間的摩爾比為:a:b=5:1~1:5，a:c=1000:1~1000:100，a:d=1000:0.1 ~1000:100。
[0010]組分a所述的磷脂為:蛋磷脂、氫化大豆磷脂酰膽堿、氫化蛋磷脂酰膽堿、二月桂酰磷脂酰膽堿、二肉豆蘧酰磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二硬脂酰磷脂酰膽堿、1-肉豆蘧酰-2-棕櫚 酰磷脂酰膽堿、1-棕櫚酰-2-硬脂酰磷脂酰膽堿、1-硬脂酰-2-棕櫚酰磷脂酰膽堿、1-棕櫚酰-2-油酰磷脂酰膽堿、1-硬脂酰-2-亞油酰磷脂酰膽堿、二油酰磷脂酰膽堿、氫化二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二硬脂酰磷脂酰膽堿、二肉豆蘧酰磷脂酸、二肉豆蘧酰磷脂酸、二棕櫚酰磷脂酸、二棕櫚酰磷脂酸、二硬脂酰磷脂酸、二肉豆蘧酰磷脂酰乙醇胺、二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺、腦磷脂酰絲氨酸、二肉豆蘧酰磷脂酰絲氨酸、二棕櫚酰磷脂酰絲氨酸、蛋磷脂酰甘油、二月桂酰磷脂酰甘油、二肉豆蘧酰磷脂酰甘油、二棕櫚酰磷脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰甘油、二油酰磷脂酰甘油、腦鞘磷脂、二棕櫚酰鞘磷脂、二硬脂酰鞘磷脂中的一種。
[0011 ] 組分c所述的甲氧基聚乙二醇-磷脂復(fù)合物中的磷脂為:二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺、氫化大豆磷脂酰乙醇胺、氫化蛋磷脂酰乙醇胺、大豆磷脂酰乙醇胺、蛋磷脂酰乙醇胺中的一種。
[0012]組分c所述的甲氧基聚乙二醇-磷脂復(fù)合物中的甲氧基聚乙二醇重均分子量為400 ~6000。
[0013]組分d所述D型多肽介導(dǎo)的靶向高分子材料由D型多肽、聚乙二醇和磷脂三部分通過共價(jià)連接而成的線性嵌段共聚物，其中D型多肽、聚乙二醇和磷脂的摩爾比為1:1:1 ;
其中所述D型多肽的氨基酸序列選自dRdAdPdRdAdPdR、dRdPdPdRdEGdR, dRdAdPdKdAdPdR、dRdPdPdRdTdVdP、dPdAdPdRdAdPdA ;所述的聚乙二醇的重均分子量為400~8000 ;所述的磷脂為二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺、氫化大豆磷脂酰乙醇胺、氫化蛋磷脂酰乙醇胺、大豆磷脂酰乙醇胺、蛋磷脂酰乙醇胺中的一種；
其中所述的D型多肽介導(dǎo)的靶向高分子材料的制備方法包括如下步驟:采用固相多肽合成法合成C端外接半胱氨酸(Cys)的D型多肽，將其溶于pH7.0的PBS溶液中，取馬來酰亞胺-聚乙二醇-磷脂復(fù)合物Mal-PEG-DSPE溶于DMF，兩者混合后攪拌反應(yīng)至Mal-PEG-DSPE反應(yīng)完全，去除過量的多肽和DMF，冷凍干燥，得到D型多肽-聚乙二醇-磷脂復(fù)合物，即D型多肽介導(dǎo)的靶向高分子材料。
[0014]所述的聚乙二醇的重均分子量為2000~5000。
[0015]本發(fā)明提供一種D型多肽介導(dǎo)的靶向脂質(zhì)體的制備方法，其特征在于，包括如下步驟:分別稱取上述各組分溶于氯仿中制備得到均勻脂質(zhì)膜，真空干燥；再加入0.155M的硫酸銨溶液，在20~_70°C水浴中震蕩得到脂質(zhì)體混懸液；再于20~70°C水浴中依次擠壓過400、200、100和50nm核孔膜，得空白脂質(zhì)體，即為D型多肽介導(dǎo)的靶向脂質(zhì)體。
[0016]本發(fā)明提供一種D型多肽介導(dǎo)的靶向脂質(zhì)體作為載藥脂質(zhì)體在制備腫瘤靶向治療藥物中的應(yīng)用；其中包載的藥物選自阿霉素、表阿霉素、柔紅霉素、紫杉醇或紫杉醇衍生物。
[0017]本發(fā)明利用逆反化技術(shù)，設(shè)計(jì)了上述這些靶向多肽對應(yīng)的D型多肽:dRdAdPdRdAdPdR, dRdPdPdRdEGdR、dRdAdPdKdAdPdR、dRdPdPdRdTdVdP, dPdAdPdRdAdPdA,并將其用于修飾脂質(zhì)體遞藥系統(tǒng)。該系統(tǒng)可通過靜脈注射給藥，利用腫瘤EPR效應(yīng)和D型多肽介導(dǎo)作用將其靶向至腫瘤部位，且能在體內(nèi)停留較長的時(shí)間。此脂質(zhì)體遞藥系統(tǒng)可用作腫瘤診斷或治療藥物的靶向遞送。
[0018]本發(fā)明利用逆反化技術(shù)，設(shè)計(jì)了多個(gè)L型靶向多肽所對應(yīng)的D型多肽:dRdAdPdRdAdPdR, dRdPdPdRdEGdR、dRdAdPdKdAdPdR、dRdPdPdRdTdVdP, dPdAdPdRdAdPdA,并將這些 D 型多肽修飾到脂質(zhì)體表面。該系統(tǒng)可通過靜脈注射給藥，利用腫瘤EPR效應(yīng)和D型多肽介導(dǎo)作用將其靶向至腫瘤部位。
[0019]與常規(guī)L型多肽介導(dǎo)的靶向脂質(zhì)體相比，由于體內(nèi)沒有D型多肽的水解酶，D型多肽比L型多肽穩(wěn)定性大大提高，從而提高其靶向效果和對腫瘤的治療效果。
[0020]與L型多肽相比，D型多肽在體外血漿中的穩(wěn)定性比相對應(yīng)的L型多肽穩(wěn)定性有顯著增加。
`[0021]本發(fā)明的脂質(zhì)體用激光散射法測定粒徑分布。其平均粒徑為5(T200nm。
[0022]本發(fā)明通過熒光示蹤脂質(zhì)體，考查腫瘤細(xì)胞對載羧基熒光素(FAM)脂質(zhì)體的體外攝取，結(jié)果證實(shí)D型多肽在體外能介導(dǎo)脂質(zhì)體進(jìn)入腫瘤細(xì)胞。
[0023]本發(fā)明通過近紅外染料DiR標(biāo)記脂質(zhì)體，將包載DiR脂質(zhì)體經(jīng)靜脈注射于腫瘤動物模型體內(nèi)，在活體成像儀下觀測，證明D型多肽修飾的脂質(zhì)體對腫瘤組織具有很好的靶向性。
[0024]此脂質(zhì)體遞藥系統(tǒng)可用作腫瘤診斷或治療藥物的靶向遞送。
[0025]于D型多肽與相對應(yīng)的L型多肽相比穩(wěn)定性有顯著提高，因此本發(fā)明得到的D型多肽介導(dǎo)的靶向脂質(zhì)體顯示出更好的腫瘤靶向性與抗腫瘤作用。該靶向脂質(zhì)體可用于腫瘤診斷或治療藥物的祀向遞送。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0026]附圖1 是 RPAKPAR 與 dRdAdPdKdAdPdR (R1-RPAKPAR)在血漿中的穩(wěn)定性。
[0027]附圖2 是 dRdAdPdKdAdPdRC-PEG-DSPE 的 1H-NMR 圖譜。
[0028]附圖3是脂質(zhì)體/DOX和dRdAdPdRdAdPdR-脂質(zhì)體/DOX粒徑分布圖。
[0029]附圖4是四種脂質(zhì)體的透射電鏡照片。[0030]附圖5是dRdAdPdRdAdPdR-脂質(zhì)體/FAM和脂質(zhì)體/FAM被PC-3腫瘤細(xì)胞攝取照片。
[0031]附圖6是dRdAdPdRdAdPdR-脂質(zhì)體/DiR和脂質(zhì)體/DiR在前列腺癌皮下瘤動物模型的活體成像圖片。
[0032]附圖7是dRdAdPdRdAdPdR-脂質(zhì)體/阿霉素(R1-RPAKPAR-LS/DOX)對前列腺癌皮下瘤的生長抑制作用。
【具體實(shí)施方式】
[0033]通過下述實(shí)施例將有助于進(jìn)一步理解本發(fā)明，但并不限制本發(fā)明的內(nèi)容。
[0034]實(shí)施例1:
D型多肽-PEG-DSPE的合成、純化和表征:
采用Boc固相多肽合成技術(shù)合成dRdAdPdRdAdPdRC多肽，將其溶于PBS溶液中(pH7.0)，取Mal-PEG-DSPE (馬來酰亞胺-聚乙二醇-磷脂復(fù)合物)溶于DMF，兩者混合后磁力攪拌反應(yīng)，HPLC (高效液相色譜法)監(jiān)測反應(yīng)，待Mal-PEG-DSPE反應(yīng)完全后停止反應(yīng)，過量的dRdAdPdRdAdPdRC和DMF通過透析(截留分子量3.5kDa)除去。冷凍干燥，得dRdAdPdRdAdPdRC-PEG-DSPE,NMR表征其結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，Mal-PEG-DSPE 圖譜在 6.67ppm處顯示Mal 的特征峰，而 dRdAdPdRdAdPdRC-PEG-DSPE 圖譜上此峰消失，說明 dRdAdPdRdAdPdRC-PEG-DSPE合成成功。
[0035]其余D 型多肽 dRdPdPdRdEGdRC、dRdAdPdKdAdPdRC、dRdPdPdRdTdVdPC、dPdAdPdRdAdPdAC按上述步驟操作，可分別獲得 dRdPdPdRdEGdRC-PEG-DSPE、dRdAdPdKdAdPdRC-PEG-DSPE、dRdPdPdRdTdVdPC-PEG-DSPE、dPdAdPdRdAdPdAC-PEG-DSPE。
[0036]實(shí)施例2:`
DRDADPDRDADPDR -脂質(zhì)體/FAM的制備和表征:
脂質(zhì)體膜材料處方組成為HSPC (氫化大豆磷脂)/Chol (膽固醇)/mPEG-DSPE (聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺復(fù)合物)(55: 45: 2，mo 1/mo I)/RdAdPdRdAdPdR修飾的PEG脂質(zhì)體膜材料處方為 HSPC/Chol/mPEG-DSPE/ dRdAdPdRdAdPdRC-PEG-DSPE (55: 45: 2: 0.5,mol/mol)。稱取上述膜材料溶于氯仿，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶媒，得均勻脂質(zhì)膜，真空干燥24小時(shí)。加入FAM水溶液水化，60°C水浴震蕩2小時(shí)，得脂質(zhì)體混懸液。在60°C水浴中，使用高壓均質(zhì)機(jī)(若脂質(zhì)體體積少于10 mL則改用微型擠出器)依次將脂質(zhì)體擠壓過400、200、100和50nm核孔膜，使其粒徑減小。然后以生理鹽水為洗脫液過葡聚糖凝膠G-50層析柱分離除去未包封的FAM，得脂質(zhì)體。脂質(zhì)體用動態(tài)光散射法和透射電子顯微鏡測定粒徑，結(jié)果顯示，平均粒徑均為90nm左右，dRdAdPdRdAdPdR修飾對其粒徑無明顯影響。
[0037]其余D型多肽按上述步驟操作，可分別獲得dRdPdPdRdEGdR-脂質(zhì)體/FAM、dRdAdPdKdAdPdR-脂質(zhì)體 /FAM、dRdPdPdRdTdVdP-脂質(zhì)體 /FAM、dPdAdPdRdAdPdA-脂質(zhì)體 /FAM。
[0038]實(shí)施例3:
DRDADPDRDADPDR -脂質(zhì)體/DiR的制備和表征:
脂質(zhì)體膜材料處方組成為HSPC (氫化大豆磷脂)/Chol (膽固醇)/mPEG-DSPE (聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺復(fù)合物)(55: 45: 2，mol/mol)/RdAdPdRdAdPdR修飾的PEG脂質(zhì)體膜材料處方為 HSPC/Chol/mPEG-DSPE/ dRdAdPdRdAdPdRC-PEG-DSPE (55: 45: 2: 0.5，mol/mol)。稱取上述膜材料溶于氯仿,加入DiR甲醇溶液(1.5mg/ml) 30 μ I,減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶媒，得均勻脂質(zhì)膜，真空干燥24小時(shí)。加入生理鹽水水化，60°C水浴震蕩2小時(shí)，得脂質(zhì)體混懸液。在60°C水浴中，使用高壓均質(zhì)機(jī)(若脂質(zhì)體體積少于10 mL則改用微型擠出器)依次將脂質(zhì)體擠壓過400、200、100和50nm核孔膜，使其粒徑減小。然后以生理鹽水為洗脫液過葡聚糖凝膠G-50層析柱分離除去未包封的DiR，得脂質(zhì)體。脂質(zhì)體用動態(tài)光散射法和透射電子顯微鏡測定粒徑，結(jié)果顯示，平均粒徑均為90nm左右，dRdAdPdRdAdPdR修飾對其粒徑無明顯影響。
[0039]其余D型多肽按上述步驟操作，可分別獲得dRdPdPdRdEGdR-脂質(zhì)體/DiR、dRdAdPdKdAdPdR-脂質(zhì)體 /DiR、dRdPdPdRdTdVdP-脂質(zhì)體 /DiR、dPdAdPdRdAdPdA-脂質(zhì)體 /DiR。
[0040]實(shí)施例4:
dRdAdPdRdAdPdR -脂質(zhì)體/DOX的制備和表征: PEG-脂質(zhì)體膜材料處方組成為HSPC (氫化大豆磷脂)/Chol (膽固醇)/mPEG-DSPE (聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺復(fù)合物)(55: 45: 2，mol/mol)/RdAdPdRdAdPdR修飾的PEG脂質(zhì)體膜材料處方為 HSPC/Chol/mPEG-DSPE/ dRdAdPdRdAdPdRC-PEG-DSPE (55: 45: 2: 0.5,mol/mol)。分別稱取上述膜材料溶于氯仿，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去氯仿，得均勻脂質(zhì)膜，真空干燥24h。加入一定體積的0.155M硫酸銨溶液，60°C水浴震蕩2h，得脂質(zhì)體混懸液。在60°C水浴中，使用高壓均質(zhì)機(jī)(若脂質(zhì)體體積少于IOmL則改用微型擠出器)依次將脂質(zhì)體擠壓過400、200、100和50nm核孔膜，得空白脂質(zhì)體。以生理鹽水為洗脫劑，將空白脂質(zhì)體洗脫通過Sephadex G_50凝膠柱更換外水相。按照藥脂比1:10 (w/w)加入阿霉素生理鹽水溶液，60°C水浴20min。以生理鹽水洗脫通過S印hadex G-50凝膠柱，除去游離藥物，得阿霉素脂質(zhì)體。脂質(zhì)體用動態(tài)光散射法和透射電子顯微鏡測定粒徑，結(jié)果顯示，平均粒徑均為90nm左右，dRdAdPdRdAdPdR修飾對其粒徑無明顯影響。
[0041 ] 其余D型多肽按上述步驟操作，可分別獲得dRdPdPdRdEGdR-脂質(zhì)體/D0X、dRdAdPdKdAdPdR-脂質(zhì)體 /D0X、dRdPdPdRdTdVdP-脂質(zhì)體 /D0X、dPdAdPdRdAdPdA-脂質(zhì)體 /D0X。
[0042]實(shí)施例5:
DRDADPDRDADPDR-脂質(zhì)體體外腫瘤細(xì)胞靶向性驗(yàn)證:
取對數(shù)生長期的單層培養(yǎng)PC-3腫瘤細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶和0.025%乙二胺四乙酸二鈉消化單層培養(yǎng)細(xì)胞，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液配成單細(xì)胞懸液，以每孔I X IO5個(gè)細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，每孔體積1ml，將培養(yǎng)板移入二氧化碳培養(yǎng)箱中，37 0C，5% 二氧化碳及飽和濕度條件下培養(yǎng)過夜，使細(xì)胞貼壁。次日，用含1%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液配制一系列不同濃度的脂質(zhì)體/FAM和dRdAdPdRdAdPdR-脂質(zhì)體/FAM溶液。將培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液吸出，加入脂質(zhì)體/FAM和dRdAdPdRdAdPdR-脂質(zhì)體/FAM的系列溶液，37°C孵育lh，吸棄上清液。用PBS溶液洗皿兩次，在激光共聚焦顯微境下觀察細(xì)胞內(nèi)化情況。結(jié)果顯示脂質(zhì)體/FAM幾乎不被攝取，而dRdAdPdRdAdPdR-脂質(zhì)體/FAM則被大量攝取，說明dRdAdPdRdAdPdR-脂質(zhì)體/FAM對腫瘤細(xì)胞具有良好的體外靶向性。
[0043]采用上述方法，驗(yàn)證其余D型多肽修飾脂質(zhì)體(dRdPdPdRdEGdR-脂質(zhì)體/FAM、dRdAdPdKdAdPdR-脂質(zhì)體 /FAM、dRdPdPdRdTdVdP-脂質(zhì)體 /FAM、dPdAdPdRdAdPdA-脂質(zhì)體 /FAM)的體外靶向性。
[0044]實(shí)施例6:
DRDADPDRDADPDR-脂質(zhì)體體內(nèi)靜脈注射后對前列腺癌皮下瘤靶向性的驗(yàn)證:將處于對數(shù)生長期的PC-3細(xì)胞胰酶消化，PBS洗滌，分散于PBS中，以I X IO7細(xì)胞(100--1)濃度皮下注射接種于裸鼠右側(cè)肩胛骨部位，SPF環(huán)境下飼養(yǎng)。取成瘤裸鼠模型6只，隨機(jī)分為兩組，分別尾靜脈注射脂質(zhì)體/DiR和dRdAdPdRdAdPdR-脂質(zhì)體/DiR，給藥后不同時(shí)間點(diǎn)將裸鼠麻醉，在活體動物成像系統(tǒng)內(nèi)掃描脂質(zhì)體/DiR和dRdAdPdRdAdPdR-脂質(zhì)體/DiR在裸鼠腫瘤組織的分布。結(jié)果顯示與脂質(zhì)體/DiR相比，dRdAdPdRdAdPdR-脂質(zhì)體/DiR在裸鼠腫瘤組織內(nèi)的分布顯著增加，表明dRdAdPdRdAdPdR的修飾實(shí)現(xiàn)了脂質(zhì)體對腫瘤的靶向遞藥。
[0045]采用上述方法，驗(yàn)證其余D型多肽修飾脂質(zhì)體(dRdPdPdRdEGdR-脂質(zhì)體/DiR、dRdAdPdKdAdPdR-脂質(zhì)體 /DiR、dRdPdPdRdTdVdP-脂質(zhì)體 /DiR、DPDADPDRDADPDA_ 脂質(zhì)體 /DiR)的體內(nèi)靶向性。
[0046]實(shí)施例7:
DRDADPDRDADPDR-脂質(zhì)體/DOX對前列腺癌皮下瘤的生長抑制作用:
將處于對數(shù)生長期的PC-3腫瘤細(xì)胞胰酶消化，PBS洗滌，分散于PBS中，以I X IO7細(xì)胞(100--1)濃度皮下注射接種于裸鼠右側(cè)肩胛骨部位，SPF環(huán)境下飼養(yǎng)。將24只已接種PC-3腫瘤細(xì)胞的裸鼠隨機(jī)分為4組(每組6只)，分別設(shè)為N.S.，D0X,脂質(zhì)體/DOX和dRdAdPdRdAdPdR-脂質(zhì)體/DOX組。將100--1相應(yīng)的制劑分別在接種后第29、35、41天經(jīng)尾靜脈注射到裸鼠體內(nèi)，阿霉素的總劑量為18mg/kg。在接種后51天，將裸鼠處死，取出皮下瘤測量體積。體積由以下公式計(jì)算得到:
V (mm3) = (d2 X D) / 2
其中d和D分別為皮下瘤的短徑和長徑，單位為mm。
[0047]采用上述方法，驗(yàn)證其余D型多肽修飾脂質(zhì)體(dRdPdPdRdEGdR-脂質(zhì)體/D0X、dRdAdPdKdAdPdR-脂質(zhì)體 /DOX、dRdPdPdRdTdVdP-脂質(zhì)體 /DOX、dPdAdPdRdAdPdA-脂質(zhì)體 /D0X)的體內(nèi)靶向性。
[0048]附圖1、RPAKPAR 與 dRdAdPdKdAdPdR (R1-RPAKPAR)在血漿中的穩(wěn)定性
由圖可見，多肽RPAKPAR在血漿中24h降解剩余15%左右，而dRdAdPdKdAdPdR則基本未被降解，說明D型多肽與對應(yīng)的L型多肽相比，穩(wěn)定性有顯著提高。
[0049]附圖2、dRdAdPdKdAdPdRC-PEG-DSPE 的 1H-NMR 圖譜
圖中A為Mal-PEG-DSPE的核磁圖譜，B為dRdAdPdKdAdPdRC-PEG-DSPE的核磁圖譜，由圖可看出，A圖顯示出馬來酰亞胺峰，而B圖中該峰消失，而其余峰基本保持不變，顯示Mal-PEG-DSPE中的馬來酰亞胺基團(tuán)已與dRdAdPdKdAdPdRC反應(yīng)。
[0050]附圖3、脂質(zhì)體/DOX和dRdAdPdRdAdPdR-脂質(zhì)體/DOX粒徑分布圖
脂質(zhì)體/FAM和dRdAdPdRdAdPdR-脂質(zhì)體/FAM粒徑分布圖，由圖可知，兩者粒徑大小及分布無顯著差異。
[0051]附圖4四種脂質(zhì)體的透射電鏡照片
由圖可見脂質(zhì)體均為球形或近球形的小單室脂質(zhì)體，外觀圓整，平均粒徑與粒度儀測定結(jié)果相近。
[0052]附圖5、dRdAdPdRdAdPdR-脂質(zhì)體/FAM和脂質(zhì)體/FAM被PC-3腫瘤細(xì)胞攝取照片 dRdAdPdRdAdPdR-脂質(zhì)體/FAM (A)和脂質(zhì)體/FAM (B)于37°C分別與腫瘤細(xì)胞作用4小
時(shí)后的熒光顯微照片，由圖可知，腫瘤細(xì)胞對dRdAdPdRdAdPdR-脂質(zhì)體/FAM的攝取量遠(yuǎn)大于脂質(zhì)體/FAM。[0053]附圖6 dRdAdPdRdAdPdR-脂質(zhì)體/DiR和脂質(zhì)體/DiR在前列腺癌皮下瘤動物模型的活體成像圖片
dRdAdPdRdAdPdR-脂質(zhì)體/DiR (左)和脂質(zhì)體/DiR (右)分別尾靜脈注射至前列腺癌皮下瘤動物模型體內(nèi)，24小時(shí)后活體成像儀檢測，由圖可知，dRdAdPdRdAdPdR-脂質(zhì)體/DiR在腫瘤組織內(nèi)的分布量遠(yuǎn)大于脂質(zhì)體/FAM，顯示出良好的腫瘤靶向性。
[0054]附圖7 dRdAdPdRdAdPdR-脂質(zhì)體/阿霉素(R1-RPAKPAR-LS/DOX)對前列腺癌皮下瘤的生長抑制作用
藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖所示，dRdAdPdRdAdPdR-脂質(zhì)體/DOX組皮下瘤體積顯著小于RPAKPAR-脂質(zhì)體/DOX組，說明 與L型多肽相比，D型多肽修飾的脂質(zhì)體在增強(qiáng)阿霉素抗腫瘤生長作用方面顯示出顯著的優(yōu)越性。
【權(quán)利要求】
1.一種D型多肽介導(dǎo)的靶向脂質(zhì)體，其特征在于，該靶向脂質(zhì)體的組成為: a.磷脂； b.膽固醇； c.甲氧基聚乙二醇-磷脂復(fù)合物； d.D型多肽介導(dǎo)的靶向高分子材料； 上述各成分之間的摩爾比為:a:b=5:1~1:5，a:c=1000:1~1000:100，a:d=1000:0.1 ~1000:100。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種D型多肽介導(dǎo)的靶向脂質(zhì)體，其特征在于，組分a所述的磷脂為:蛋磷脂、氫化大豆磷脂酰膽堿、氫化蛋磷脂酰膽堿、二月桂酰磷脂酰膽堿、二肉豆蘧酰磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二硬脂酰磷脂酰膽堿、1-肉豆蘧酰-2-棕櫚酰磷脂酰膽堿、1-棕櫚酰-2-硬脂酰磷脂酰膽堿、1-硬脂酰-2-棕櫚酰磷脂酰膽堿、1-棕櫚酰-2-油酰磷脂酰膽堿、1-硬脂酰-2-亞油酰磷脂酰膽堿、二油酰磷脂酰膽堿、氫化二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二硬脂酰磷脂酰膽堿、二肉豆蘧酰磷脂酸、二肉豆蘧酰磷脂酸、二棕櫚酰磷脂酸、二棕櫚酰磷脂酸、二硬脂酰磷脂酸、二肉豆蘧酰磷脂酰乙醇胺、二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺、腦磷脂酰絲氨酸、二肉豆蘧酰磷脂酰絲氨酸、二棕櫚酰磷脂酰絲氨酸、蛋磷脂酰甘油、二月桂酰磷脂酰甘油、二肉豆蘧酰磷脂酰甘油、二棕櫚酰磷脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰甘油、二油酰磷脂酰甘油、腦鞘磷脂、二棕櫚酰鞘磷脂、二硬脂酰鞘磷脂中的一種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種D型多肽介導(dǎo)的靶向脂質(zhì)體，其特征在于，組分c所述的甲氧基聚乙二醇-磷脂復(fù)合物中的磷脂為:二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺、氫化大豆磷脂酰乙醇胺、氫化蛋磷脂酰乙醇胺、大豆磷脂酰乙醇胺、蛋磷脂酰乙醇胺中的一種。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種D型多肽介導(dǎo)的靶向脂質(zhì)體，其特征在于，組分c所述的甲氧基聚乙二醇-磷脂復(fù)合物中的甲氧基聚乙二醇重均分子量為400~6000。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種D型多肽介導(dǎo)的靶向脂質(zhì)體，其特征在于，組分d所述D型多肽介導(dǎo)的靶向高分子材料由D型多肽、聚乙二醇和磷脂三部分通過共價(jià)連接而成的線性嵌段共聚物，其中D型多肽、聚乙二醇和磷脂的摩爾比為1:1:1 ; 其中所述D型多肽的氨基酸序列選自dRdAdPdRdAdPdR、dRdPdPdRdEGdR, dRdAdPdKdAdPdR、dRdPdPdRdTdVdP、dPdAdPdRdAdPdA ;所述的聚乙二醇的重均分子量為400~8000 ;所述的磷脂為二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺、氫化大豆磷脂酰乙醇胺、氫化蛋磷脂酰乙醇胺、大豆磷脂酰乙醇胺、蛋磷脂酰乙醇胺中的一種； 其中所述的D型多肽介導(dǎo)的靶向高分子材料的制備方法的具體步驟為:采用固相多肽合成法合成C端外接半胱氨酸(Cys)的D型多肽，將其溶于pH7.0的PBS溶液中，取馬來酰亞胺-聚乙二醇-磷脂復(fù)合物Mal-PEG-DSPE溶于DMF，兩者混合后攪拌反應(yīng)至Mal-PEG-DSPE反應(yīng)完全，去除過量的多肽和DMF，冷凍干燥，得到D型多肽-聚乙二醇-磷脂復(fù)合物，即D型多肽介導(dǎo)的靶向高分子材料。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種D型多肽介導(dǎo)的靶向脂質(zhì)體，其特征在于，所述的聚乙二醇的重均分子量為2000~5000。
7.根據(jù)權(quán)利要求1~6之一所述的一種D型多肽介導(dǎo)的靶向脂質(zhì)體的制備方法，其特征在于，包括如下步驟:分別稱取上述各組分溶于氯仿中制備得到均勻脂質(zhì)膜，真空干燥；再加入0.155M的硫酸銨溶液，在20~-70°c水浴中震蕩得到脂質(zhì)體混懸液；再于20~70°C水浴中依次擠壓過400、200、100和50nm核孔膜，得空白脂質(zhì)體，即為D型多肽介導(dǎo)的靶向脂質(zhì)體。
8.根據(jù)權(quán)利要求1~6之一所述的一種D型多肽介導(dǎo)的靶向脂質(zhì)體作為載藥脂質(zhì)體在制備腫瘤靶向治療藥物中的應(yīng)用；其中包載的藥物選自阿霉素、表阿霉素、柔紅霉素、紫杉醇或紫杉醇衍生物。`
【文檔編號】A61P35/00GK103720655SQ201210383701
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2012年10月11日 優(yōu)先權(quán)日:2012年10月11日
【發(fā)明者】閆志強(qiáng), 楊一祎, 魏岱旭, 鐘建, 何丹農(nóng) 申請人:上海納米技術(shù)及應(yīng)用國家工程研究中心有限公司