疫苗的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及疫苗。具體地，標準劑量的脊髓灰質炎疫苗包括40D抗原單位的滅活1型脊髓灰質炎病毒(Mahoney)，8D抗原單位的滅活2型脊髓灰質炎病毒(MEF-1)以及32D抗原單位的滅活3型脊髓灰質炎病毒(Saukett)。本發(fā)明教導降低劑量的滅活脊髓灰質炎病毒能夠維持足夠的或提高的抗脊髓灰質炎保護水平。
【專利說明】疫苗
[0001]本申請是申請日為2007年9月7日的中國專利申請200780041465.X “疫苗”的
分案申請。
【技術領域】
[0002]本發(fā)明涉及用于預防脊髓灰質炎的疫苗領域，尤其涉及用于預防脊髓灰質炎、白喉、破傷風和百日咳疾病的聯(lián)合疫苗。
【背景技術】
[0003]為了使賦予抗多種病原體的保護所需的免疫次數(shù)最少、降低給藥成本和增加接受率和覆蓋率，聯(lián)合疫苗(其提供抗多種病原體的保護)是非常理想的。許多資料記載的抗原競爭(或干擾)現(xiàn)象使多組分疫苗的開發(fā)復雜化?？乖蓴_是指觀察到施用多種抗原經(jīng)常導致針對某些抗原的應答相對于這些抗原單獨施用時的應答減小。
[0004]已知聯(lián)合疫苗可預防百日咳桿菌(Bordetella pertussis),破傷風桿菌(Clostridium tetani),白喉桿菌(Corynebacterium diphtheriae),和可選的預防滅活的脊髓灰質炎病毒(IPV)和/或乙肝病毒和/或B型嗜血桿菌(Haemophilus)感染(參見例如 TO93/24148，W097/00697 和 W02000/030678)。
[0005]在多年研究后，在疫苗領域內被視為有效的標準劑量的脊髓灰質炎疫苗包括40D抗原單位的滅活I型脊髓灰質炎病毒(Mahoney)，8D抗原單位的滅活2型脊髓灰質炎病毒(MEF-1)以及32D抗原單位的滅活3型脊髓灰質炎病毒(Saukett)(例如Infanrix-1PV?)。
[0006]本發(fā)明人令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，降低劑量的IPV能夠維持足夠的或提高的抗脊髓灰質炎保護水平。這種疫苗具有重要的優(yōu)點，包括為需要該疫苗的個體提供更高劑量的IPV疫苗的能力。

【發(fā)明內容】

[0007]因此，本發(fā)明提供各種降低劑量的IPV疫苗(其可以只含有IPV組分或可以含有IPV組分以及其他抗原)。
[0008]因此，一方面本發(fā)明提供一種本發(fā)明的IPV疫苗，其包含劑量大于IOD抗原單位并小于20D抗原單位(例如11，12，13，14，15，16，17，18或19D抗原單位)的滅活I型脊髓灰
質炎病毒。
[0009]在一個實施方案中，本發(fā)明提供一種本發(fā)明的IPV疫苗，其包含劑量為8-20D抗原單位(例如8,9,10，11，12，13，14，15，16，17，18，19或20D抗原單位)的滅活3型脊髓灰質
炎病毒。
[0010]在另一個 實施方案中，本發(fā)明提供一種本發(fā)明的IPV疫苗，其包含劑量為2-4D抗原單位(例如2、3或4D抗原單位)的滅活2型脊髓灰質炎病毒。
[0011]在另一個實施方案中，本發(fā)明提供一種本發(fā)明的IPV疫苗，其還包含白喉類毒素和/或破傷風類毒素和/或采用滅活全細胞Pw疫苗或非細胞百日咳抗原形式的百日咳疫苗。
[0012]在另一方面，本發(fā)明提供一種本發(fā)明的IPV疫苗，其是不含硫柳汞的DTP-1PV聯(lián)合疫苗，包含劑量為10-36D抗原單位的滅活I型脊髓灰質炎病毒。
[0013]在另一個實施方案中，本發(fā)明提供一種本發(fā)明不含硫柳汞的DTP-1PV聯(lián)合疫苗，其包含劑量為2-7D抗原單位(例如5、6或7D抗原單位)的滅活2型脊髓灰質炎病毒。
[0014]在另一個實施方案中，本發(fā)明提供一種本發(fā)明不含硫柳汞的DTP-1PV聯(lián)合疫苗，其包含劑量為8-29D抗原單位(例如21、22、23、24、25、26、27、28或29D抗原單位)的滅活3型脊髓灰質炎病毒。
[0015]在另一個實施方案中，本發(fā)明的疫苗還可以包含選自下列組的一種或多種抗原:乙肝表面抗原，b型流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)抗原，A型腦膜炎球菌(Neisseria meningitidis)抗原，C型腦膜炎球菌抗原，W型腦膜炎球菌抗原，Y型腦膜炎球菌抗原，B型腦膜炎球菌bleb或抗原，甲肝抗原和傷寒沙門氏菌((Salmonella typhi))抗原，尤其是來自所述細菌的莢膜糖。
[0016]還提供本發(fā)明制備疫苗的方法。
[0017]定義
[0018]術語“疫苗”可選的可以用“免疫原性組合物”替換，反之亦然。
[0019]“D抗原單位”(還稱為“國際單位”或IU):脊髓灰質炎病毒的D抗原形式誘導保護性中和抗體。本文提及的D抗原單位(例如在本發(fā)明的疫苗中)是在終疫苗配制前在每個未吸附初始IPV抗原類型中測得的總D抗原單位，所述終疫苗被添加到配制疫苗的每人劑量中(通常終體積為0.5mL)。測量D抗原單位的可靠方法是本領域公知的，例如由歐洲藥典(European Pharmacopoeia)公開。例如，可以按照下文實施例1 ( “通過ELISA的D抗原定量”)描述的ELISA試驗測量D抗原單位。歐洲藥典提供試驗樣品(European Pharmacopoeia Biological ReferencePreparation(歐洲藥典生物參考制品)，獲自Ph.Eur.Secretariat,例如CodeP2160000),以便在制造商之間將該方法標準化(Pharmeuropa Speciallssue, Bio96_2)。因此D抗原單位值在本領域是公知的。
[0020]本文的術語“劑量”通常是本發(fā)明疫苗的一次施用量，其通常是一次注射量。典型的人劑量是0.5mL。當然在疫苗施用方案中可以施用各種劑量。
[0021]本文中術語“IPV”或包含這些組分的疫苗旨在表示滅活的脊髓灰質炎病毒I型(例如作為優(yōu)選使用的Mahoney,或Statens Serum Institut出售的Brunhilde,稱為DiTeKiPol)、2型(例如MEF-1)或3型(例如Saukett)，或這些類型的兩種或全部三種的組合。用于本發(fā)明目的完整(或標準)劑量(分別是1、2和3型IPV的40-8-32D) IPV疫苗的實例可以是Poliorix? (GSK Biologicals S.A.)。因此,當在本文描述IPV標準劑量的X%存在于本發(fā)明疫苗時，它表示分別等于1、2和/或3型IPV的40、8和/或32D抗原單位(在每個初始IPV抗原類型中測定)的X%的D抗原單位被配制到每劑量的所述疫苗中。
[0022]術語“脂多糖”(LPS)和“脂寡糖”(LOS)是可以互換的。
[0023]在本說明書自始至終，術語“糖”表示多糖或寡糖，并且包括這兩者。莢膜糖抗原可以是全長多糖，或其可以擴展到疫苗領域公知的細菌‘分級的糖(sized-saccharides) ’和‘寡糖’(其天然具有較 低數(shù)量的重復單位，或其是為了便于操縱在大小方面減小的多糖，但仍能夠在宿主中誘導保護性的免疫應答)(參見例如EP497525)。
[0024]本文的術語“核酸”包括單鏈或雙鏈脫氧核糖核酸(DNA)，或單鏈或雙鏈核糖核酸(RNA)，或其混合物。
[0025]在本發(fā)明疫苗范圍內的術語來自病原體的“組分”或“給予對這種病原體保護的組分”旨在表示來自該病原體的一種或多種抗原。
[0026]本文的術語“大概”或“大約”旨在表示指定值的±10%，但應當符合有效范圍。【專利附圖】

【附圖說明】
[0027]圖1.含有IPV劑量的DTPwSF-HB-1PV “制備方法3”的相對效力(RP)的衍變。
[0028]在體內檢測降低劑量IPV的制劑“制備方法3”的效力，與參照制劑(Poliorix制劑和DTPaIPVHB)進行比較。按照標準IPV劑量(對于1/2/3型來說是40/8/32D抗原單位)的100%、50%、25%和12.5%劑量測量IPV的RP。
[0029]圖2.DTPwSF-HB-1PV制劑相對效力(RP)衍變的流程圖。
[0030]在體內檢測兩種制劑“制備方法3”和“制備方法4”的降低劑量IPV的效力，與參照制劑(Poliorix制劑和DTPaIPVHB)進行比較。與只含25% IPV的安慰劑相比，檢測含25%標準IPV劑量(對于1/2/3型是40/8/32D抗原單位)的“制備方法3”和“制備方法4” 的 RP。
[0031]圖3.在開始和第8個月時1、2和3型IPV的相對效力。
[0032]檢測IPV 的相對效力[相對于 DTPaHBIPV (Pediarix)(圖 3a)或 Poliorix (圖 3b)]以確定Hib組分是否影響IPV效力，并評價不同IPV劑量條件下IPV隨時間的穩(wěn)定性。
圖4顯示用于白喉類毒素吸附的制備方法。
圖5顯示用于破傷風類毒素吸附的制備方法。
圖6顯示用于Pw吸附的制備方法。
圖7顯示用于HBsAg吸附的制備方法。
圖8是白喉類毒素的吸附流程圖。
圖9是破傷風類毒素的吸附流程圖。
圖10顯示HBsAg的吸附步驟。
圖11是Pw吸附的流程圖。
圖12是DTPw-HBV疫苗的制備流程圖。
【具體實施方式】
[0033]本發(fā)明提供一種疫苗(例如聯(lián)合疫苗)，其包含來自脊髓灰質炎病毒(IPV)和可選的白喉桿菌(D)、破傷風桿菌(T)、百日咳桿菌(P)或乙肝的抗原。
[0034]本發(fā)明的抗原
[0035]IPV疫苗組分
[0036]本發(fā)明的疫苗可以由I型IPV或2型IPV或3型IPV組成，或由I和2型IPV組成，或由I和3型IPV組成，或由2和3型IPV組成，或由1、2和3型IPV組成。
[0037]制備滅活脊髓灰質炎病毒(IPV)的方法是本領域公知的。在一個實施方案中，就如疫苗本領域常見的，IPV包括1、2和3型，可以是用甲醛滅活的沙克脊髓灰質炎疫苗(參見例如，Sutter 等人，2000, Pediatr.Clin.North Am.47:287 ；Zimmerman &Spannl999, Am Fam Physician59:113 ;Salk 等人，1954, Official Monthly Publicationof the AmericanPublic Health Association44(5):563 ；Hennesen,1981,Develop.Biol.Standard47:139 ；Budowsky,1991, Adv.Virus Res.39:255)。
[0038]在一個實施方案中，IPV是不吸附的(例如如果存在其他組分，在與這些組分混合之前)。在另一個實施方案中，本發(fā)明的IPV組分可以吸附到鋁鹽諸如氫氧化鋁(例如如果存在其他組分，在與這些組分混合之前或之后)。在另一個實施方案中，本發(fā)明的IPV組分可以吸附到鋁鹽諸如磷酸鋁。在另一個實施方案中，IPV組分可以吸附到氫氧化鋁和磷酸鋁的混合物。如果是吸附的，一種或多種IPV組分可以單獨吸附或一起吸附成混合物?？梢酝ㄟ^如W02004/039417描述的特定干燥過程穩(wěn)定IPV。
[0039]脊髓灰質炎病毒可以在細胞培養(yǎng)物中生長。所述細胞培養(yǎng)物可以是VERO細胞系或PMKC，其是源自猴腎的連續(xù)細胞系?？梢苑奖愕卦谖⑤d體中培養(yǎng)VERO細胞。在病毒感染之前及期間培養(yǎng)VERO細胞可能需要使用來自牛的原料諸如小牛血清，并且該原料應該獲自沒有牛海綿狀腦炎(BSE)的來源。培養(yǎng)可能還涉及諸如乳白蛋白水解物等材料。在增殖后，可以利用諸如超濾、透析過濾和層析法等技術純化病毒粒子。在給患者施用前，病毒必須被滅活，這可以通過用甲醛處理來實現(xiàn)。
[0040]病毒可以單獨增殖、純化和滅活，然后將其混合得到濃縮的初始混合物用于IPV疫苗用途，或添加到吸附的白喉和破傷風抗原及百日咳組分用于包含DTPw-1PV或DTPa-1PV的疫苗。
[0041]本發(fā)明疫苗中的抗原將以“免疫有效量”存在，即給個體施用所述量(以單劑量或作為連續(xù)劑量的一部分的形式)能夠有效治療或預防疾病。劑量治療可以是單劑量方案或多劑量方案(例如包括加強劑 量)。
[0042]現(xiàn)在脊髓灰質炎疫苗的標準劑量傾向于包括40D抗原單位的滅活I型脊髓灰質炎病毒，8D抗原單位的滅活2型脊髓灰質炎病毒，以及32D抗原單位的滅活3型脊髓灰質炎病毒(例如 Infanrix-1PV?)。
[0043]但是，本發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)可以使用降低劑量的IPV獲得良好免疫應答。在一個實施方案中，本發(fā)明的IPV疫苗劑量可以包含10-36D抗原單位的I型IPV(例如11-32、12-28、13-24、14-20或15-19D抗原單位)。在另一個實施方案中，本發(fā)明的IPV疫苗劑量可以包含劑量為10-20 D抗原單位的I型IPV，或劑量大于10D抗原單位并小于20D抗原單位。在另一個實施方案中，本發(fā)明的疫苗劑量可以包含I型IPV的標準40D抗原單位劑量的26-49%、30-45%、33-40%、35-37%，或大約或精確的三分之一(等于大約10.4-19.6、12-18、13.2-16、14-14.8或13.3D抗原單位)。在另一個實施方案中，本發(fā)明的IPV疫苗劑量可以包含11-32抗原單位，12-28D抗原單位，13-24D抗原單位或14-20D抗原單位的I型IPV。
[0044]可選擇地，本發(fā)明的IPV疫苗劑量可以包含10-19.5抗原單位，12-19D抗原單位，14-18.抗原單位或15-17D抗原單位的I型IPV ;例如大約或精確的16D抗原單位的I型IPV。
[0045]在另一個實施方案中，本發(fā)明的疫苗可以包含小于4D抗原單位、2-4D抗原單位(等于25-50%的標準8D抗原單位劑量)或大約或精確的3D抗原單位的2型IPV (等于
37.5%的標準8D抗原單位劑量)。[0046]在另一個實施方案中，本發(fā)明的疫苗可以包含大約或精確的三分之一的標準8D抗原單位劑量的2型IPV (等于大約2.7D抗原單位)。
[0047]在另一個實施方案中，本發(fā)明的疫苗可以包含2-7D抗原單位的2型IPV。在另一個實施方案中，本發(fā)明的IPV疫苗劑量可以包含3-6D抗原單位或4-ro抗原單位的2型IPV。
[0048]可選擇地，本發(fā)明的IPV疫苗劑量可以包含2-4.5D抗原單位、2.5_4D抗原單位或
3-3.5D抗原單位的2型IPV。 [0049]在另一個實施方案中，本發(fā)明的疫苗可以包含8-20D抗原單位，大于8但小于20D抗原單位，9-19D抗原單位，10-18D抗原單位，11-17D抗原單位，12-16D抗原單位，或13-1?抗原單位的3型IPV ;例如大約或精確的14D抗原單位的3型IPV(等于25-62.5%,
28.125-59.375%,31.25-46.875%或 43.75%的標準 32D 抗原單位劑量)。
[0050]在另一個實施方案中，本發(fā)明的疫苗可以包含大約或精確的三分之一的標準32D抗原單位劑量的3型IPV (等于大約10.7D抗原單位)。
[0051]在另一個實施方案中，本發(fā)明的IPV疫苗劑量可以包含8-29D抗原單位，9-26D抗原單位，10-23D抗原單位，11-20D抗原單位，12-17D抗原單位，或13-14D抗原單位的3型IPV。
[0052]可選擇地，本發(fā)明的IPV疫苗劑量可以包含8-19.抗原單位，9-19D抗原單位，10-18.5D抗原單位，11-18D抗原單位，12-17.5D抗原單位，13-17D抗原單位，或14-16D抗原單位；例如大約或精確的MD抗原單位。
[0053]DTP疫苗組分
[0054]DTP疫苗是公知的用于預防或治療白喉、破傷風和百日咳桿菌(B.pertussis)疾病的疫苗。本發(fā)明的疫苗可以包含白喉、破傷風和/或百日咳組分。
[0055]白喉抗原通常是白喉類毒素。白喉類毒素(DT)制品被大量文獻記載?？梢允褂萌我夂线m的白喉類毒素。例如，可以通過從白喉桿菌的培養(yǎng)物純化毒素，繼之以化學脫毒制備DT，但可選的通過純化所述毒素的重組或遺傳脫毒類似物來制備(例如，CRM197，或其他突變體，如 US4, 709，017、US5, 843，711，US5, 601，827 和 US5, 917，017 中的描述)。在一個實施方案中，每0.5mL劑量中DT以5-50、7-30Lf或大約或精確的7.5Lf或25Lf的量存在。在另一個實施方案中，每0.5mL劑量中DT以小于5Lf或l_4Lf或大約或精確的2Lf的低劑量存在。在一個實施方案中，本發(fā)明的白喉類毒素可以吸附到鋁鹽諸如氫氧化鋁上。在另一個實施方案中，本發(fā)明的白喉類毒素可以吸附到鋁鹽諸如磷酸鋁上。在另一個實施方案中，白喉類毒素可以吸附到氫氧化鋁和磷酸鋁的混合物上。
[0056]本發(fā)明的破傷風抗原通常是破傷風類毒素。制備破傷風類毒素(TT)的方法是本領域公知的。在一個實施方案中，通過從破傷風桿菌的培養(yǎng)物中純化毒素，繼之以化學脫毒來制備TT，但可選的通過純化所述毒素的重組或遺傳脫毒類似物來制備(例如EP209281中所述)?？梢允褂萌我夂线m的破傷風類毒素。“破傷風類毒素”可以包括全長蛋白的免疫原性片段(例如Fragment C-參見EP478602)。在一個實施方案中，每0.5mL劑量中TT以
2.5-30Lf、3-20Lf、5-15Lf或精確的或大約IOLf的量存在。在一個實施方案中，本發(fā)明的破傷風類毒素可以吸附到鋁鹽諸如氫氧化鋁上。在另一個實施方案中，本發(fā)明的破傷風類毒素可以吸附到鋁鹽諸如磷酸鋁上。在另一個實施方案中，破傷風類毒素可以吸附到氫氧化鋁和磷酸鋁的混合物上。[0057]本發(fā)明的百日咳組分可以是非細胞的(Pa)(其中使用純化的百日咳抗原)或全細胞的(Pw)(其中使用滅活的全細胞百日咳作為百日咳組分)。Pw可以通過數(shù)種已知的方法(包括不含萊的方法)滅活。這類方法可以包括加熱(例如55-65°C或56-60°C共5-60分鐘或10-30分鐘，例如60°C共30分鐘)，甲醛(例如0.1%在37°C，24小時)，戊二醛(例如0.05%在室溫，10分鐘)，丙酮-1 (例如在室溫下處理三次)或丙酮-1I (例如在室溫下處理三次并在37°C進行第四次處理)滅活(參見例如Gupta等人，1987，J.Biol.Stand.15:87 ;Gupta等人，1986, Vaccine, 4:185)。制備適合本發(fā)明的滅活、全細胞百日咳桿菌(Pw)的方法公開于W093/24148，其也是產生DT-TT-Pw-H印B疫苗的合適制備方法。在過去，硫柳汞被用于滅活的全細胞百日咳桿菌的制備(見下文)。但是，在一個實施方案中，它不被用于本發(fā)明疫苗的制備步驟。
[0058]通常使用的Pw 劑量為 5-5010U、7-4010U、9-3510U、11-3010U、13-2510U、15-2110U或大約或精確的2010U。
[0059]非細胞的Pa疫苗也是公知的，可以包括以下2種或更多種抗原:百日咳類毒素(PT)，絲狀血細胞凝集素(FHA)，百日咳桿菌粘附素(pertactin) (PRN)，凝集原2&3。在一個實施方案中，Pa疫苗包含PT、FHA和PRN。本發(fā)明的試劑盒或疫苗可以包括通過公知的甲醛處理方法或通過突變(PT衍生物)脫毒的PT。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)蛋白SI亞基內殘基的取代導致該蛋白保留PT的免疫和保護性質，但毒性降低或沒有毒性(EP322533)。在EP322533權利要求中描述的脫毒突變體是本發(fā)明DT脫毒突變體的實例。這種突變體可以使用低于20-25 μ g的劑量。
[0060]在一個實施方`案中，每0.5mL劑量中使用的PT量為2-50 μ g、5-40 μ g、10-30 μ g或精確的或大約25 μ g。在另一個實施方案中，每0.5mL劑量中使用的PT量為2.5或8 μ g。
[0061]在一個實施方案中，每0.5mL劑量中使用的FHA量為2_50 μ g、5_40 μ g、10-30 μ g或精確的或大約25 μ g。在另一個實施方案中，每0.5mL劑量中使用的FHA量為精確的或大約 2.5 或 8 μ g。
[0062]在一個實施方案中，每0.5mL劑量中使用的PRN量為0.5-20 μ g、0.8-15 μ g、
2-10μ g或精確的或大約8 μ g。在另一個實施方案中，每0.5mL劑量中使用的PRN量為精確的或大約0.8或2.5 μ g。
[0063]在一個實施方案中，本發(fā)明的百日咳組分可以吸附到鋁鹽諸如氫氧化鋁上。在另一個實施方案中，本發(fā)明的百日咳組分可以吸附到鋁鹽諸如磷酸鋁上。在另一個實施方案中，百日咳組分可以吸附到氫氧化鋁和磷酸鋁的混合物上。例如在一個實施方案中，至少PRN吸附到氫氧化鋁上，并且PT/FHA吸附到氫氧化鋁、磷酸鋁或這兩者的混合物上。
[0064]其他抗原
[0065]本發(fā)明的疫苗制劑，任選的還包含DTP (DTPw或DTPa)，還可以包括選自以下的一種或多種抗原:乙肝表面抗原，b型流感嗜血桿菌抗原，A型腦膜炎球菌抗原，C型腦膜炎球菌抗原，W-135型腦膜炎球菌抗原，Y型腦膜炎球菌抗原，B型腦膜炎球菌bleb或純化抗原，甲肝抗原，傷寒沙門氏菌抗原和RTS，S。通常可以使用這些病原體的莢膜糖或LOS抗原?？乖ǔＲ灾辽倜糠NI P g/mL的濃度存在,例如1-20 μ g/mL、2_15 μ g/mL、2.5-10 μ g/mL、
3-8μ8/?Λ*4-6μ8/?Λ。通常，任意抗原的濃度將足以引發(fā)抗該抗原的免疫應答。優(yōu)選的單個抗原的保護效果不因為它們的混合而被去除，但是事實上免疫原性(例如ELISA滴度)可能被減弱。
[0066]在本發(fā)明的一個實施方案中，其他抗原可以吸附到鋁鹽諸如氫氧化鋁上。在另一個實施方案中，本發(fā)明的其他抗原可以吸附到鋁鹽諸如磷酸鋁上。在另一個實施方案中，其他抗原可以吸附到氫氧化鋁和磷酸鋁的混合物上，或可以是不吸附的。
[0067]當使用莢膜糖或LOS抗原時，其可以被綴合到包含T輔助表位的載體蛋白，以便增強免疫原性。本發(fā)明也可以包括游離的“載體蛋白”。
[0068]作為在本發(fā)明組合物中使用蛋白抗原的替換，可以使用編碼所述抗原的核酸。因此本發(fā)明組合物的蛋白組分可以被編碼該蛋白的核酸(例如DNA，其可以采用質粒的形式)取代。類似地，本發(fā)明的組合物可以包括模擬糖抗原諸如模擬位或抗個體基因型抗體的蛋白。這些可以取代單獨的糖組分，或對它們進行補充。[0069]乙肝抗原
[0070]乙肝表面抗原(HBsAg)制品被大量文獻記載。參見例如，Hartford等人，1983，Develop.Biol.Standard54:125, Gregg 等人，1987, Biotechnology5:479, EP0226846,EP0299108。它可以按照如下方法制備。一種方法涉及從慢性乙肝攜帶者的血漿純化微粒形式的抗原，因為大量HBsAg在肝臟中合成，并在HBV感染期間釋放到血流中。另一種方法涉及通過重組DNA方法表達該蛋白?？梢酝ㄟ^在釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、畢赤酵母、昆蟲細胞(例如Hi5)或哺乳動物細胞中表達來制備HBsAg?？梢詫BsAg插入質粒，并通過啟動子諸如“GAPDH”啟動子(來自甘油醛-3-磷酸膠氫酶基因)控制其在質粒中的表達。所述酵母可以在合成培養(yǎng)基中培養(yǎng)。然后通過包括諸如沉淀、離子交換層析和超濾等步驟的方法純化HBsAg。純化后，可以將HBsAg進行透析(例如用半胱氨酸)?？梢允褂梦⒘Ｐ问降腏ffisAg。
[0071]如本文使用的表述“乙肝表面抗原”或“HBsAg”包括任意HBsAg抗原或其顯示HBV表面抗原的抗原性的片段。應了解除HBsAg S抗原226氨基酸序列(參見Tiollais等人，1985，Nature317:489及其中的參考文獻)之外，如果需要，本文描述的HBsAg可以包括上述參考文獻和EP0278940描述的pre_S序列的全部或部分。尤其是，HBsAg可以包括一種包含氨基酸序列的多肽，相對于ad血清型的乙肝病毒的開放閱讀框，所述氨基酸序列包含殘基133-145后面是HBsAg的L蛋白的殘基(該多肽被稱作L* ;參見EP0414374)。本發(fā)明范圍內的JffisAg還可以包括EP0198474 (Endotronics)描述的preSl_preS2_S多妝或其類似物，諸如EP0304578 (McCormick and Jones)描述的那些。本文描述的HBsAg還可以涉及突變體，例如W091/14703或EP0511855A1描述的“逃逸突變體(escape mutant) ”，尤其是145位的氨基酸取代是從甘氨酸變?yōu)榫彼岬腍BsAg。
[0072]HBsAg可以采用顆粒形式。所述顆?？梢园ㄖT如單獨的S蛋白或可以是復合顆粒(諸如L*，S)，其中L*如上所述，S表示HBsAg的S蛋白。所述顆粒有利地采用在酵母中表達的形式。
[0073]在一個實施方案中，HBsAg是 EngerixB?(GlaxoSmithKlineBiologicals S.A.)中使用的抗原，其在W093/24148中被進一步描述。
[0074]在一個實施方案中，每5mL劑量中HBsAg以5_20 ii g、8_15 ii g或大約或精確的IOu g的量存在。
[0075]乙肝表面抗原可以吸附到磷酸鋁上，這可以在與其他組分混合前完成(描述于W093/24148)。乙肝組分應當基本上不含硫柳汞(無硫柳汞的HBsAg的制備方法先前已經(jīng)公開于 EP1307473)。
[0076]b型流感嗜血桿菌抗原
[0077]W097/00697已經(jīng)描述了包含來自B型流感嗜血桿菌抗原的疫苗。本發(fā)明的疫苗可以使用任意合適的B型流感嗜血桿菌抗原。所述抗原可以是與載體蛋白(Hib)綴合的來自B型流感嗜血桿菌的莢膜糖(PRP)。所述糖是核糖、核糖醇和磷酸酯的聚合物。Hib抗原可以任選的如W097/00697所述吸附到磷酸鋁上，或如W002/00249所述是不吸附的，或還沒有經(jīng)歷特定的吸附步驟。
[0078]本文中“未吸附到鋁佐劑鹽上”的抗原是指例如抗原在新鮮鋁佐劑鹽上的明確或專一吸附步驟不參與配制組合物的步驟。
[0079]Hib可以綴合到任何載體，所述載體提供至少一個T輔助表位(其實例在下文描述)，其可以是破傷風類毒素、白喉類毒素、CRM-197(白喉毒素突變體)或蛋白D。
[0080]Hib可以被凍干，并可以臨用前重建(例如用稀釋劑，任選的包含本發(fā)明疫苗的其他抗原成分)。
[0081]在一個實施方案中，每511^劑量中!1讓以5-2(^8、8-15 4 8或大約或精確的10 μ g糖的量存在。
[0082]在另一個實施方 案中，Hib以W002/00249所述的低劑量(例如l_6yg、2_4yg或大約或精確的2.5 μ g糖)存在。
[0083]腦膜炎球菌A、C、W或Y型抗原
[0084]本發(fā)明的疫苗還可以包括細菌的莢膜糖，其選自:A型腦膜炎球菌(MenA，任選的與載體蛋白綴合)，C型腦膜炎球菌(MenC，任選的與載體蛋白綴合)，W-135型腦膜炎球菌(MenW，任選的與載體蛋白綴合)和Y型腦膜炎球菌(MenY，任選的與載體蛋白綴合)。
[0085]本發(fā)明的疫苗可以包括來自腦膜炎球菌不同株的一種或多種抗原，如下文的詳細描述，其可以單獨使用或以2、3或4種組分的任意組合形式使用:
[0086]MenA, MenC, Menff, MenY,或 MenA+MenC, MenA+Menff, MenA+MenY, MenC+Menff,MenC+MenY, Menff+MenY 或 MenA+MenC+MenW, MenA+MenC+MenY, MenA+Menff+MenY,MenC+Menff+MenY 或 MenA+MenC+MenW+MenY。
[0087]在一個實施方案中，本發(fā)明的腦膜炎球菌組分可以吸附到鋁鹽諸如氫氧化鋁上。在另一個實施方案中，本發(fā)明的腦膜炎球菌組分可以吸附到鋁鹽諸如磷酸鋁上。在另一個實施方案中，腦膜炎球菌組分可以吸附到氫氧化鋁和磷酸鋁的混合物上。在一個實施方案中，腦膜炎球菌組分可以不吸附到佐劑諸如鋁佐劑鹽上。
[0088]B型腦膜炎球菌型bleb或抗原
[0089]本發(fā)明的疫苗還可以包括MenB組分，諸如外膜囊泡或bleb (在W001/09350、W003/105890、W004/014417或W004/014418中描述)或綴合的MenB莢膜糖(或其衍生物)抗原(例如參見W096/40239)或游離或綴合的L2或L3或L2和L3腦膜炎球菌的LOS (根據(jù)TO2004/014417)。在一個實施方案中，本發(fā)明的MenB組分可以吸附到鋁鹽諸如氫氧化鋁上。在另一個實施方案中，本發(fā)明的MenB組分可以吸附到鋁鹽諸如磷酸鋁上。在另一個實施方案中，MenB組分可以吸附到氫氧化鋁和磷酸鋁的混合物上。在一個實施方案中，MenB組分可以不吸附到佐劑諸如鋁佐劑鹽上。[0090]傷寒沙門氏菌抗原
[0091]本發(fā)明的疫苗還可以包括來自傷寒沙門氏菌的Vi糖，其可以是注冊的產品Typherix?，描述于EP1107787，或其綴合物(例如與本文描述的載體蛋白)。可以按照W02007/000343的描述進行綴合步驟。在一個實施方案中，本發(fā)明的Vi糖可以吸附到鋁鹽諸如氫氧化鋁上。在另一個實施方案中，本發(fā)明的Vi糖可以吸附到鋁鹽諸如磷酸鋁上。在另一個實施方案中，Vi糖可以吸附到氫氧化鋁和磷酸鋁的混合物上。在一個實施方案中，Vi糖可以不吸附到佐劑諸如鋁佐劑鹽上。
[0092]甲肝抗原
[0093]能夠預防甲肝的組分可以是滅活的減毒甲肝疫苗，諸如稱為Havrix?的產品(GlaxoSmithKline Biologicals S.A.的注冊商標)，其是源自甲肝病毒(HAV)的 HM-175株的滅活減毒疫苗(參見“InactivatedCandidate Vaccines for Hepatitis A(甲肝的滅活候選疫苗)”，F(xiàn).E.Andre 等人，1980, Prog.Med.Virol.37 -J2 和產品專題文章“Havrix”，由 SmithKline Beecham Biologicals 在 1991 年出版)。Flehmig 等人(1990, Prog.MedVirol.37:56)綜述了甲肝的臨床狀況、病毒學、免疫學和流行病學，并描述了開發(fā)抗這類常見病毒感染的疫苗的方法。如本文使用的表述“HAV抗原”是指能夠在人體中刺激針對HAV的中和抗體的任何抗原。在一個實施方案中，HAV抗原包含滅活的減毒病毒顆粒，或在另一個實施方案中，HAV抗原可能是HAV衣殼或HAV病毒蛋白，其可以方便地通過DNA重組技術獲得。在一個實施方案中，本發(fā)明的甲肝組分可以吸附到鋁鹽諸如氫氧化鋁上。在另一個實施方案中，本發(fā)明的甲肝組分可以吸附到鋁鹽諸如磷酸鋁上。在另一個實施方案中，甲肝組分可以吸附到氫氧化鋁和磷酸鋁的混合物上。
[0094]瘧疾抗原
[0095]本發(fā)明的疫苗還可以包括瘧疾抗原。瘧疾抗原可以是RTS，S(CS和HBsAg的雜合蛋白-描述于US6，306, 625和EP0614465)。在一個實施方案中，RTS, S可以用于本發(fā)明的疫苗以替代HBsAg。其他瘧疾抗原也可用于本發(fā)明的疫苗，包括CS蛋白，RTS, TRAP, B2992的 16kD 蛋白，AMA-1，MSPl，任選的包括 CpG(W02006/029887，W098/05355, W001/00231)。
[0096]在一個實施方案中，本發(fā)明的瘧疾抗原可以吸附到鋁鹽諸如氫氧化鋁上。在另一個實施方案中，本發(fā)明的瘧疾抗原可以吸附到鋁鹽諸如磷酸鋁上。在另一個實施方案中，瘧疾抗原可以吸附到氫氧化鋁和磷酸鋁的混合物上。在一個實施方案中，瘧疾抗原用水包油乳液和/或類脂A衍生物(諸如MPL)和/或甾醇(諸如膽固醇)和/或生育酚(諸如α_生育酚)作為佐劑。在另一個實施方案中，瘧疾抗原可以不吸附到佐劑諸如鋁佐劑鹽上。
[0097]綴合物
[0098]本發(fā)明的細菌莢膜糖綴合物可以包括任何包含至少一個T輔助表位的載體肽、多肽或蛋白。使用的載體蛋白可以選自:破傷風類毒素，白喉類毒素，CRM197，重組白喉毒素(如 US4, 709，017、W093/25210、W095/33481 或 W000/48638 中任一所述)，來自肺炎鏈球菌(S.pneumoniae)的肺炎球菌溶血素(任選的化學脫毒，或脫毒突變體)(參見例如W02004/081515及其引用的參考文獻)，來自腦膜炎球菌的OMPC (EP0372501)，和來自流感嗜血桿菌的蛋白D(PD) (EP594610)。其他載體可以包括合成肽(EP0378881 ；EP0427347),熱休克蛋白(W093/17712 ;W094/03208)，百日咳蛋白(W098/58668 ;EP0471177)，細胞因子(W091/01146)，淋巴因子(W091/01146)，激素(W091/01146)，生長因子(W091/01146)，包含來自各種病原體來源抗原的多種人CD4+T細胞表位的人工蛋白(Falugi等人，2001，Eur.J.1mmunol.31:3816)，肺炎球菌表面蛋白 PspA(W002/091998)，鐵攝取蛋白(W001/72337),艱難梭菌(C.difficile)的毒素A或B (W000/61761)，肺炎球菌PhtD (W000/37105)，肺炎球菌 PhtDE (例如 TO01/98334&TO03/054007)，PhtX,等等。
[0099]所有糖都可以在相同載體上，尤其是來自一個特定生物體的所有糖，例如MenA、MenC, Menff和MenY糖都可以全部綴合到TT、DT或CRM-197上。但是，由于已知的載體抑制作用，如果將本發(fā)明每種組合物中包含的糖抗原(“n”個抗原)與超過一種載體綴合的話可能是有利的。因此所述糖的(n-1)個可以在一種載體類型上攜帶(單獨的)，1個在不同載體上，或(n-2)個在一種載體類型上，2個在不同的載體上，等等。例如，在包含4個細菌糖綴合物的疫苗中，1、2或所有4個可以與不同的載體綴合。但是，蛋白D可用于組合物中的各種(2、3、4或更多個)糖并且沒有顯著的載體抑制作用。Hib可以TT、DT或CRM197綴合物的形式存在，MenA、MenC、MenY和MenW可以是IT、DT、CRM197或PD綴合物。Vi可以TT、DT或CRM197綴合物的形式存在。蛋白D是一種有用的載體，因為它提供一種能夠預防流感嗜血桿菌的其他抗原。在一個實施方案中，所有糖都與相同的載體蛋白綴合。
[0100]例如通過利用碳化二亞胺(例如EDAC)縮合化學(考慮到Vi重復亞基包含羧基)的方法可以將Vi與載體蛋白綴合。這可以通過以下反應實現(xiàn):(i) Vi的COOH和蛋白的NH2之間的單碳化二亞胺反應或(ii)雙碳化二亞胺反應，其發(fā)生在Vi的COOH和接頭分子的NH2以及蛋白的COOH和同質雙功能接頭分子的NH2之間，或Vi的COOH和異質雙功能接頭分子的NH2以及蛋白的NH2和異質雙功能接頭分子的COOH之間。
[0101]綴合可用于游離 載體蛋白的連接。在一個實施方案中，當指定的載體蛋白在本發(fā)明組合物中以游離和綴合形式存在時，未綴合的形式不超過整個組合物中載體蛋白總量的5%，或在另一個實施方案中未綴合的形式按重量計小于2%。
[0102]可以使用任何已知的方法(例如,Likhite,美國專利4，372, 945和Armor等人,美國專利4，474，757)，在必要時利用任何合適的接頭，將糖與載體蛋白連接。
[0103]在綴合之前,糖通常被活化或功能化?；罨梢陨婕埃?，氰化(cyanylating)試劑諸如CDAP(1-氰基-二甲基氨基吡啶f翁四氟硼酸鹽)(W095/08348&W096/29094)。氰化(cyanylating)反應可以在相對溫和的條件下進行，這可以避免堿性敏感糖的水解。這種合成允許直接綴合到載體蛋白。其他合適的技術使用碳化二亞胺，酰肼，活性酯，降冰片烷，對硝基苯甲酸，N-羥基琥珀酰亞胺酯，S-NHS, EDC或TSTU。
[0104]可以利用任何已知的步驟，諸如US4，882，317和US4，695，624描述的步驟，完成通過接頭基團的連接。一類連接涉及糖的還原性胺化，將所獲氨基與已二酸接頭基團的一個末端綴合(EP0477508, Porro 等人，1985，Mol.1mmunol.22:907，EP0208375)，然后將蛋白與己二酸接頭基團的另一末端綴合。其他接頭包括B-丙酰胺基(W000/10599)，硝基苯基-乙胺(Gever 等人，1979，Med.Microbiol.1mmunol.165:171)，酰鹵鹽(US4, 057，685)，糖苷鍵(US4, 673，574 ;US4, 761，283 ;US4, 808，700)，6_ 氨基己酸(US4, 459，286)，ADH(US4, 965，338)，C4到C12基團(US4, 663，160)，等等。作為使用接頭的替代方法，可以使用直接連接。與蛋白的直接連接可以包括糖的氧化，繼之以所述蛋白的還原性胺化，諸如US4, 761，283和US4, 356，170中的描述或直接CDAP反應。[0105]綴合后，可以分離游離和綴合的糖。存在很多適合這類分離的方法，包括疏水層析，切向超濾，透析過濾，等等(還可參見Lei等人，2000, DevBiol.(Basel).103:259 ；W000/38711 ；US6, 146，902)。在一個實施方案中，如果疫苗包含游離和綴合兩種形式的指定糖，未綴合形式在整個組合物中按重量計不超過該糖總量的20% (例如< 15%, < 10%,(5%,^ 2%,^ 1% )。
[0106]能夠為宿主提供保護的糖量(有效量)可以由技術人員確定。在一個實施方案，每劑量將包括0.1-100 μ g的糖，在另一個實施方案中每劑量將包括0.1-50 μ g，在進一步的實施方案中每劑量將包括0.1-10 μ g，仍在另一個實施方案中每劑量將包括1-5 μ g。
[0107]佐劑
[0108]本發(fā)明的疫苗可以包括藥學上可接受的賦形劑諸如合適的佐劑。合適的佐劑包括鋁鹽諸如氫氧化鋁或磷酸鋁，但也可以是鈣鹽、鐵鹽或鋅鹽，或可以是?；野彼?MPL)的不溶性懸浮液，或?；?，或可以是陽離子或陰離子衍生的糖，聚磷腈，可生物降解的微球，單磷酸類脂A (MPL)，類脂A衍生物(例如具有減弱的毒性)，3-0_脫酰MPL，quil A,皂苷，QS21，生育酚(EP0382271)，弗氏不完全佐劑(Difco Laboratories, Detroit, MI)，Merck Adjuvant65 (Merck and Company, Inc., Rahway, NJ), AS-2 (Smith-Kline Beecham,Philadelphia, PA), CpG寡核苷酸,生物粘附劑和粘膜粘附劑，微粒，脂質體，聚氧乙烯醚制劑，聚氧乙烯酯制劑，胞壁酰肽或咪唑并喹啉(例如咪喹莫特及其同系物)。在本發(fā)明中適合作為佐劑的人類免疫調節(jié)劑包括細胞因子諸如白介素(例如IL-1，IL-2，IL-4，IL-5，IL-6，IL-1, IL-12，等等)，巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)，腫瘤壞死因子(TNF)，粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CS F)也可以作為佐劑使用。
[0109]在本發(fā)明的一個實施方案中，所述制劑的佐劑組合物主要誘導THl型的免疫應答。高水平的THl型細胞因子(例如IFN- Y、TNF α、IL-2和IL-12)傾向于促進誘導針對所施用抗原的細胞介導的免疫應答。在應答主要是THl型的實施方案中，THl型細胞因子的水平將增加到高于ΤΗ2型細胞因子水平的程度。利用標準分析可以輕易地評價這些細胞因子的水平。對于細胞因子家族的綜述，可以參見Mosmann and Coffman, 1989, Ann.Rev.1mmunol.7:145。
[0110]因此，主要促進THl應答的合適佐劑系統(tǒng)包括，類脂A的衍生物(例如具有減弱的毒性)，單磷酸類脂A (MPL)或其衍生物，尤其是3-脫氧-酰化單磷酸類脂A (3D-MPL)，以及單磷酸類脂A的組合，任選的3-脫氧?；瘑瘟姿犷愔珹以及鋁鹽。增強系統(tǒng)涉及單磷酸類脂A和皂苷衍生物的組合，尤其是W094/00153公開的QS21和3D-MPL的組合，或W096/33739公開的致反應性較低的組合物，其中QS21用膽固醇猝滅。包括溶于水包油乳液的QS21、3D-MPL和生育酚的尤其有效的佐劑描述于W095/17210。所述疫苗還可以包括皂苷，其可以是QS21。所述制劑還可以包括水包油乳液和生育酚(W095/17210)。包含寡核苷酸的非甲基化CpG(W096/02555)還是THl應答的優(yōu)選誘導物，并且適用于本發(fā)明。
[0111]本發(fā)明的疫苗還可以包含上述一種或多種本發(fā)明佐劑的組合。
[0112]本發(fā)明的任何佐劑可以吸附到本發(fā)明的IPV組分或與其組合。
[0113]當涉及氫氧化鋁或磷酸鋁時，所有氫氧化鋁和/或磷酸鋁的參考都按照Hem andWhite (Pharm Biotechnol.1995 ；6:249-276)的描述。
[0114]在一個實施方案中，磷酸鋁也可以被稱作羥基磷酸鋁。在另一個實施方案中，磷酸鋁在pH為7.4時帶有負電荷。通常，磷酸鋁的等電點(pi)是5-7或6-7或大約或精確的5。在另一個實施方案中，磷酸鋁中磷酸:鋁的摩爾比例為0.3-0.9或0.3-0.6或0.8-0.9。
[0115]在一個實施方案中，氫氧化鋁在pH為7.4時帶有正電荷。通常，氫氧化鋁的pi是
8-11、9-11、10-11或大約或精確的11。
[0116]通常，每0.5mL 劑量中鋁的總量是 200-1000 μ g，300-900 μ g，400-800 μ g，500-700 μ g或大約或精確的630 μ g Al3+。這適用于所有氫氧化鋁或所有磷酸鋁?？蛇x擇地，Al3+含量可能來自以下比例的氫氧化鋁和磷酸鋁的混合物:1: 8-8: 1、1: 4-4: 1、3: 8-8: 3、1: 2-2:1或1:1的磷酸鋁:氫氧化鋁。在一個實施方案中，使用的磷酸鋁:氫氧化鋁比例為 12: 1-4: 1,11: 1-5: 1,10: 1-6: 1，9: 1-7:1 或 8:1。
[0117]盡管大部分鋁在混合形成聯(lián)合疫苗前以預吸附抗原的形式提供，一些鋁可以在制備本發(fā)明的聯(lián)合疫苗期間以游離形式添加，例如在本文描述的PH調節(jié)步驟前。通常，每0.5mL劑量中游離鋁的含量可以是0-300 μ g, 50-250 μ g, 75-200 μ g, 100-150 μ g或大約或精確的115yg的A13+。游離的Al3+可以全部是Al (OH) 3或全部是AlPO4，或以下比例的 Al (OH)3 和 AlPO4 的混合物(w: w Al3+: Al3+):1: 1-1: 6，1: 1.1-1: 5，
I: 1.2-1: 4,1: 1.3-1: 3,1: 1.4-1: 2，例如 23/92 或 69/46 或 6: 1-1: 1，
5: 1-1.1: 1,4: 1-1.2: 1,3: 1-1.3: 1,2: 1-1.4: I，例如 46/69 或 92/23。
[0118]可選的本發(fā)明疫苗的某些組分可以不是特意吸附到佐劑尤其是鋁鹽上。
[0119]IPV可以不吸附或吸附到Al (OH)3或Al (OH)3和AlPO4的混合物上。DT可以吸附到Al (OH)3或AlPO4上，TT可以·吸附到Al (OH)3或AlPO4上，Pw可以吸附到AlPO4上或與其混合，PRN可以吸附到Al (OH)3上，F(xiàn)HA可以吸附到Al (OH)3上，PT可以吸附到Al (OH)3上，HB可以吸附到AlPO4上，Hib可以吸附到AlPO4上或不吸附，Men ACWY可以吸附到Al (OH)3或AlPO4上或不吸附，MenB組分可以吸附到Al (OH)3或AlPO4上或不吸附，Vi可以吸附到Al (OH) 3或AlPO4上或不吸附，H印A可以吸附到Al (OH) 3或AlPO4上。
[0120]預吸附到鋁鹽上的抗原可以在混合前單獨預吸附。在另一個實施方案中，在與其他佐劑混合前可以將抗原的混合物預吸附。在一個實施方案中，IPV可以分別吸附或作為
1、2和3型IPV的混合物吸附，或當與吸附的D和T組分混合時吸附。
[0121]“吸附的抗原”的含義是例如表示大于20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%或90%的吸附。
[0122]如本文使用的術語“磷酸鋁”和“氫氧化鋁”包括適合作為疫苗佐劑的所有形式的氫氧化鋁或磷酸鋁。例如，磷酸鋁可以是不溶性磷酸鋁的沉淀物(無定形的，半結晶的或結晶的)，其任選的但不是唯一的通過混合可溶性鋁鹽和磷酸鹽來制備?！皻溲趸X”可以是不溶性氫氧化鋁的沉淀物(無定形的，半結晶的或結晶的)，其任選的但不是唯一的通過中和鋁鹽溶液來制備。尤其合適的是可以從商品化來源獲得的各種形式的氫氧化鋁和磷酸鋁凝膠，諸如Brenntag Biosector (Denmark)提供的Alhydrogel (氫氧化招，溶于水的3%懸浮液)和Adjuphos (磷酸招,溶于鹽水的2%懸浮液)。
[0123]本發(fā)明疫苗的非免疫組分
[0124]除了上文提及的抗原和佐劑組分之外，本發(fā)明的疫苗通常包括一種或多種“藥學上可接受的載體或賦形劑”，其包括自身不誘導對接受所述組合物的個體有害的抗體生成的任何賦形劑。合適的賦形劑通常是大的、代謝緩慢的大分子諸如蛋白，糖，聚乳酸，聚乙醇酸，多聚氨基酸，氨基酸共聚物，蔗糖(Paoletti等人，2001，Vaccine, 19:2118)，海藻糖(W000/56365)，乳糖和類脂聚集物(諸如油滴或脂質體)。這類載體對本領域普通技術人員來說是公知的。所述疫苗還可以包含稀釋劑，諸如水，鹽水，甘油，等等。此外，還可以存在輔助劑，諸如濕潤劑或乳化劑，PH緩沖劑，等等。無菌無熱原的、磷酸鹽緩沖的生理鹽水是一種典型載體。關于藥學上可接受賦形劑的深入討論可以參見參考文獻Gennaro，2000，Remington: The Science and Practice of Pharmacy,20th 版，ISBN:0683306472。
[0125]本發(fā)明的組合物可以是凍干的或采用水性形式，即溶液或懸浮液。這一類的液體制劑允許直接從組合物的包裝形式進行施用，無需在水介質中重建，因此適用于注射。組合物可以存在于小瓶中，或它們可以存在于預填充的注射器中。所述注射器可以提供針頭或不提供針頭。注射將包括單劑量的組合物，而小瓶可以包括單劑量或多劑量(例如2個劑量)。在一個實施方案中，所述劑量是用于人的。在另一個實施方案中，所述劑量用于成人，青年，初學走路的孩子，嬰兒或小于I歲的人，可以通過注射施用。
[0126]本發(fā)明的液體疫苗還適于從凍干形式重建其他疫苗。當疫苗用于臨用前重建時，本發(fā)明提供一種試劑盒，其可以包括兩個小瓶，或可以包括預填充的注射器和一個小瓶，具有在注射前用于重建小瓶中內含物的注射器內含物。
[0127]本發(fā)明的疫苗可以包裝成單位劑量形式或多劑量形式(例如2個劑量)。對于多劑量形式來說，小瓶優(yōu)于預填充注射器。有效的劑量體積可以按慣例確定，單用于注射的組合物的典型人劑量是0.5mL體積。
[0128]在一個實施方案中，本發(fā)明疫苗的pH為6.0-8.0，在另一個實施方案中，本發(fā)明疫苗的pH為6.3-6.9，例如6.6 ±0.2?？梢詫⒁呙缭谶@個pH進行緩沖?？梢酝ㄟ^使用緩沖液維持穩(wěn)定的pH。如果組合物包含氫氧化鋁鹽，可以使用組氨酸緩沖液(W003/009869)。組合物應當是無菌和/或無熱原的。
[0129]本發(fā)明的組合物對于人類來說應該是等滲的。
[0130]本發(fā)明的疫苗可以包括抗微生物劑，尤其是當包裝為多劑量形式時。應當避免硫柳汞因為這導致IPV組分效力的損失。也可以使用其他抗微生物劑，諸如2-苯氧乙醇或對羥苯甲酸(甲基、乙基、丙基對羥苯甲酸)。任何防腐劑優(yōu)選的是以低水平存在的。防腐劑可以外源添加，和/或可以是初始抗原的組分，其被混合形成所述組合物(例如作為百日咳抗原的防腐劑存在)。
[0131]在一個實施方案中，本發(fā)明的疫苗是不含硫柳汞或基本上不含硫柳汞的?！安缓蛄被颉盎旧喜缓蛄北硎咀罱K制劑中不存在足以對IPV組分的效力產生負面影響的硫柳汞。例如，如果在Pw或乙肝表面抗原純化過程中使用硫柳汞，其應當在與IPV混合前被基本上去除。終疫苗中的柳硫汞含量應當?shù)陀?.025 ii g/ ii g蛋白，0.02 ii g/ ii g蛋白，0.01 ii g/ii g蛋白或0.001 ii g/ii g蛋白，例如0 Ii g/ii g蛋白。在一個實施方案中，既不添加硫柳汞，也不在任何組分的純化中使用硫柳汞。對于乙肝來說參見例如EP1307473，對于Pw步驟來說參見上文，其中滅活是在無硫柳汞存在的情況下完成的。
[0132]本發(fā)明的疫苗可以包括去污劑例如Tween(聚山梨醇酯)，諸如TweenSO。去污劑通常是以低水平存在，例如< 0.01%。
[0133]本發(fā)明的疫苗可以包括指定張力的鈉鹽(例如氯化鈉)。所述組合物可以包括氯化鈉。在一個實施方案中，本發(fā)明組合物中氯化鈉的濃度范圍是0.1到100mg/mL(例如l-50mg/mL, 2-20mg/mL, 5-15mg/mL),在另一個實施方案中，氯化鈉的濃度是10±2mg/mLNaCl,例如大約9mg/mL。
[0134]本發(fā)明的疫苗通常包括緩沖液。磷酸鹽或組氨酸緩沖液是典型代表。
[0135]本發(fā)明的疫苗可以包括溶液中游離的磷酸鹽離子(例如通過使用磷酸鹽緩沖液)，以便有利于抗原的不吸附。在一個實施方案中，本發(fā)明組合物中游離磷酸鹽離子的濃度為0.1-10.0mM，或在另一個實施方案中，其濃度為l_5mM，或在進一步的實施方案中其濃度為2.5mM。
[0136]本發(fā)明疫苗的性質
[0137]在一個實施方案中，將本發(fā)明的疫苗以下述方式配制為給宿主體內施用的疫苗，在該方式中組合物的單項組分被配制為使得單項組分的免疫原性基本上不被該組合物的其他單項組分損害。“基本上不被損害”表示在免疫時，獲得的抗各個組分的抗體滴度大于該抗原單獨施用時所獲滴度的60 %、70 %、80 %或90 %，或95-100 %。因此，在優(yōu)選的實施方案中，與聯(lián)合疫苗中其他組分的單獨施用相比，不存在對聯(lián)合疫苗中其他組分的(顯著)不利影響(按照保護性效果來說)。
[0138]疫苗制劑
[0139]在一個實施方案中，將本發(fā)明的疫苗配制為給宿主體內施用的疫苗，這樣的話它們在可接受比例的人類受試者中為各個抗原組分提供高于血清保護標準的抗體滴度。這是評價疫苗在整個群體中效果的一個重要試驗。具有相關抗體滴度(超過該滴度就認為宿主被血清轉化為抗該抗原)的抗原是公知的，并且所述滴度由機構(諸如WHO)公開。在一個實施方案中，受試者統(tǒng)計上顯著的樣品中超過80%是血清轉化的，在另一個實施方案中，受試者統(tǒng)計上顯著的樣品中超過90%是血清轉化的，在進一步的實施方案中，受試者統(tǒng)計上顯著的樣品中超過93%是血清轉化的，仍在另一個實施方案中，受試者統(tǒng)計上顯著的樣品中96-100%是血清轉化的。
[0140]每種疫苗劑量中抗原的量是經(jīng)過選擇，能夠在典型疫苗中誘導免疫防護應答而且沒有顯著不良副作用的量。這種量將取決于使用的特異免疫原而不同。通常預期每個劑量將包括1-1000 μ g的全部免疫原，或1-100 μ g，或1-40 μ g，或1-5 μ g。特定疫苗最合適的量可以通過研究確定，所述研究涉及觀察受試者的抗體滴度和其他反應。初次接種過程可以包括2-3次劑量的疫苗，間隔1到2個月，例如按照WHO對于DTP免疫的推薦(即在生命的第一年)。加強劑量可以在生命的第二年和/或之后的年份進行。
[0141]通過血清中和試驗測定的大鼠中Polio效力
[0142]出于本發(fā)明的目的，用于IPV定量評價本發(fā)明包含IPV疫苗的疫苗效力的分析應當利用單劑量疫苗進行，并且應當通過測定試驗疫苗幾何平均滴度(GMT)對參照疫苗GMT的比例來實施，最后其被記錄為相對反應(RR)或相對效力(RP)。參照GMT可以是由分別包含40-8-32D抗原單位的1-2-3型IPV的任何IPV疫苗獲得的GMT，也可以是由已知疫苗Poliorix?獲得的GMT。通常,如下進行RP試驗:
[0143]通過血清中和試驗確定大鼠中1、2和3型脊髓灰質炎病毒的效力:
[0144]?給10只健康大鼠(Sprague-Dawley(OFA)或任何事先批準的品系)的組肌內接種試驗樣品或參考材料的稀釋物(1/1.25 ；1/3.125 ；1/7.81)(溶于磷酸鹽水緩沖液)。如果必要，通過接種未稀釋的疫苗和前面提及的3種稀釋物將稀釋范圍擴展到4種稀釋物。10只接種稀釋劑的大鼠被用作陰性對照。每周一次觀察大鼠以檢測任何異常反應。接種后20到22天，對每只動物進行深度麻醉，采血并收集血清以通過血清中和試驗進行分析。
[0145]?為了進行血清中和試驗，通過在56°C的水浴中溫育30分鐘滅活血清。利用合適的稀釋介質在微板上制備血清的3種系列稀釋物，每種對應一種脊髓灰質炎類型。將板在4°C保存。
[0146]對于3種脊髓灰質炎病毒類型，將預定量的病毒(30-300CCID5(i)添加到血清稀釋物中。3種病毒懸浮液根據(jù)它們各自的滴度進行稀釋。最終稀釋物被稱為“工作稀釋物”。將各個工作稀釋物添加到相應的微板。然后將板密封，在37°C ±1°C溫育16小時。然后添加Hep-2細胞，將微板在37°C 土1°C溫育7天。在考馬斯藍染色后利用倒置顯微鏡記錄病毒的細胞致病變作用(CPE)?？辜顾杌屹|炎抗體的存在抑制病毒的生長以及相應CPE的出現(xiàn)?？辜顾杌屹|炎病毒滴度(1、2和3型)等于沒有任何CPE的最終稀釋度的倒數(shù)。在每組中，記錄具有中和抗體的動物，并測定每個血清樣品中針對不同類型脊髓灰質炎病毒的抗體滴度。中和抗體滴度用血清樣品最高稀釋度(完全抑制脊髓灰質炎病毒對ifep-2細胞的細胞致病作用)的倒數(shù)的log2表示。
[0147]?還測定每組大鼠中每個稀釋度和每種病毒類型的幾何平均滴度(GMT)。
[0148]本發(fā)明疫苗的包裝
[0149]本發(fā)明的疫苗可以包裝到各種類型的容器中，例如小瓶，注射器，等等。多次劑量瓶通常將包括可再密封的塑料瓶口，通過該瓶口無菌針頭可以插入吸取一次劑量的疫苗，當針頭被移出后可以再次密封該瓶口。
[0150]所述疫苗可以在不同的容器中(例如2或3)提供。所述容器中的內含物可以在給宿主通過單次注射施用前臨 時混合，或可以將其同時在不同的位點施用。如果試劑盒是同時施用(在兩個或更多個容器中)，則所述疫苗或各個疫苗的劑量通常是0.5mL。
[0151]在本發(fā)明這方面的一個實施方案中，提供包含兩種多價疫苗的試劑盒，所述疫苗在宿主中提供抵抗疾病的保護，所述疾病由脊髓灰質炎病毒，百日咳桿菌，破傷風桿菌，白喉桿菌以及任選的乙肝、B型流感嗜血桿菌、A型腦膜炎球菌、C型腦膜炎球菌、W型腦膜炎球菌、Y型腦膜炎球菌、B型腦膜炎球菌、傷寒沙門氏菌、甲肝或瘧疾中的一種或多種引起。
[0152]所述試劑盒包含第一容器，其包含:
[0153](I) (a)本發(fā)明滅活的脊髓灰質炎病毒(IPV)，
[0154](b)白喉類毒素(DT或D)(參見上文)，
[0155](C)破傷風類毒素(TT或T)(參見上文)，
[0156](d)滅活全-細胞百日咳桿菌(Pw)或2種或更多種非細胞百日咳組分(Pa)(參見上文)，
[0157](e)任選的乙肝表面抗原OfepB或HB)(參見上文)，
[0158](f)任選的載體蛋白與B型流感嗜血桿菌(Hib)莢膜糖的綴合物(參見上文)，
[0159](g)任選的載體蛋白與A型腦膜炎球菌(MenA)莢膜糖或C型腦膜炎球菌(MenC)莢膜糖的綴合物的其中一種或兩種(參見上文)，和
[0160]第二容器包含:
[0161](2A) (a)載體蛋白與A型腦膜炎球菌(MenA)莢膜糖、C型腦膜炎球菌(MenC)莢膜糖、W型腦膜炎球菌(MenW)莢膜糖和/或Y腦膜炎球菌(MenY)莢膜糖的綴合物(參見上文本發(fā)明各種Men糖組合)，和
[0162](b)任選的載體蛋白與B型流感嗜血桿菌(Hib)莢膜糖的綴合物；或
[0163](2B) (a)任選的載體蛋白與B型流感嗜血桿菌(Hib)莢膜糖的綴合物，和
[0164](b)任選的載體蛋白與傷寒沙門氏菌Vi糖的綴合物。
[0165]所述試劑盒任選的可以包括第三容器，其包含:
[0166](3) (a)任選的乙肝表面抗原
[0167](b)任選的載體蛋白與傷寒沙門氏菌Vi糖的綴合物
[0168]在這兩種情況下所述容器都還可以包括H印A抗原和/或MenB抗原和/或RTS，S和/或肺炎鏈球菌抗原。
[0169]在這兩種情況下，相同抗原不應該在兩個容器中都存在。
[0170]在一個實施方案中，第一容器除了組分a)、b)、c)、d)之外，還具有組分e)、f)、g)、e) +f)、e) +g)、f) +g)或 e) +f) +g)。
[0171]在一個實施方案中，第一容器中的疫苗可以是液體，第二容器中的疫苗可以是液體或凍干的(例如存在已知的穩(wěn)定賦形劑諸如蔗糖或海藻糖)。
[0172]所述試劑盒的容器可以單獨包裝，或任選的包裝在一起。在一個實施方案中，所述試劑盒提供用于施用兩個或更多個容器中疫苗的一系列說明書。
[0173]在一個實施方案中，當試劑盒中的容器包含某個糖綴合物時，在該試劑盒的其他容器中不存在相同的綴合物。
[0174]發(fā)明人相信以上述方式提供的試劑盒有利地以最佳方式將各種抗原呈遞給宿主的免疫系統(tǒng)。所述試劑盒給執(zhí)業(yè)醫(yī)師提供最佳的免疫宿主的方法，該方法具有以下一個或多個優(yōu)點:對全部抗原的保護效果，最小的反應原性，最小的載體抑制干擾，最小的佐劑/抗原干擾，或最小的抗原/抗原干擾。按此方式用最少次數(shù)(2次)施用就可實現(xiàn)這些目標，任選的發(fā)生在同一次就醫(yī)時。
[0175]在一個實施方案中，第一和第二容器中的疫苗在不同的位點同時施用(如下文“本發(fā)明疫苗的施用”中所述)，在一個選擇性實施方案中，本發(fā)明人設想可將第一和第二容器中的內含物混合(任選的臨用前)，然后作為單劑疫苗施用。
[0176]制備本發(fā)明的疫苗
[0177]本發(fā)明還提供一種制備疫苗制劑的方法，包括將疫苗組分與藥學上可接受的賦形劑混合的步驟。
[0178]在本發(fā)明的一個實施方案中，提供本文所述疫苗在用于疾病的治療或預防的藥物中的用途，所述疾病由脊髓灰質炎病毒及任選的百日咳桿菌，破傷風桿菌，白喉桿菌，乙肝病毒，流感嗜血桿菌，A型腦膜炎球菌，C型腦膜炎球菌，W型腦膜炎球菌，Y型腦膜炎球菌，傷寒沙門氏菌、甲肝或甲肝的感染引起。
[0179]在本發(fā)明的另一個實施方案中，提供本發(fā)明的疫苗在制備用于疾病的治療或預防的藥物中的用途，所述疾病由脊髓灰質炎病毒及任選的百日咳桿菌，破傷風桿菌，白喉桿菌，乙肝病毒，流感嗜血桿菌，A型腦膜炎球菌，C型腦膜炎球菌，W型腦膜炎球菌，Y型腦膜炎球菌，傷寒沙門氏菌、甲肝或甲肝的感染引起。
[0180]此外，還提供一種免疫人類宿主抵抗疾病的方法，所述疾病由脊髓灰質炎病毒及任選的百日咳桿菌，破傷 風桿菌，白喉桿菌，乙肝病毒，流感嗜血桿菌，A型腦膜炎球菌，C型腦膜炎球菌，W型腦膜炎球菌，Y型腦膜炎球菌，傷寒沙門氏菌或甲肝引起，該方法包括給宿主施用免疫保護劑量的本發(fā)明疫苗。
[0181]每種疫苗劑量中抗原的量是經(jīng)過選擇，能夠在典型疫苗中誘導免疫防護應答而且沒有顯著不良副作用的量。這種量將根據(jù)使用的特異免疫原及其如何被呈遞而不同。在一個實施方案，每劑量將包括0.1-1OOyg的糖，在另一個實施方案中每劑量將包括
0.1-50 μ g，在進一步的實施方案中每劑量將包括0.1-10 μ g，仍在另一個實施方案中每劑量將包括1-5 μ g糖。
[0182]在一個實施方案中，所述疫苗中蛋白抗原的含量范圍是1-100μ g，在另一個實施方案中，所述疫苗中蛋白抗原的含量范圍是5-50yg，在進一步的實施方案中，所述疫苗中蛋白抗原的含量范圍是5-25 μ g。
[0183]疫苗制品一般描述于Vaccine Design (疫苗設計)[“The subunit andadjuvantapproach”(eds Powell M.F.&Newman M.J.)(1995)PlenumPress New York]。Fullerton描述了脂質體內的包裹(美國專利4，235，877)。例如Likhite (美國專利4，372，945)和Armor等人(美國專利4，474，757)公開了蛋白與大分子的綴合。Dalsgaard等人(1977,Acta Vet Scand.18:349)公開了 Quil A 的使用。3D-MPL獲自 Ribi immunochem,USA,并公開于英國專利申請?zhí)?220211和美國專利4，912，094。QS21公開于美國專利5，057，540。
[0184]在本發(fā)明的另一個實施方案中，提供一種多價疫苗，其包括本發(fā)明滅活的脊髓灰質炎病毒(IPV)及任選的滅活全細胞百日咳桿菌(Pw)，破傷風類毒素(TT)，白喉類毒素(DT)，載體蛋白與B型流感嗜血桿菌莢膜糖的綴合物(Hib-任選的與TT、DT或CRM197綴合)，其中每0.5mL劑量的初始疫苗中綴合物的量是1-8 μ g，并且所述綴合物的免疫原性等于或被改善超過包括更大量綴合物的這類組合物。任選的，還可以包括乙肝表面抗原。
[0185]在一個實施方案中，每0.5mL劑量的初始疫苗中綴合物的量小于10 μ g(所述綴合物中的糖)，在另一個實施方案中綴合物的量是1-7，在另一個實施方案中綴合物的量是2-6 μ g，或在進一步的實施方案中是約2.5、3、4或5 μ g。
[0186]應理解某些組分諸如DTPw組分，可以在添加吸附的HBsAg或其他組分前單獨組
入
口 ο
[0187]還提供制備本發(fā)明疫苗的方法，其包括將I型IPV、2型IPV和/或3型IPV與藥學上可接受的賦形劑混合的步驟。利用其他抗原制備本發(fā)明初始疫苗的典型步驟將向D和T組分的混合物中添加IPV組分，即DT組分與IPV組分混合。這種混合順序允許在添加Pa或Pw組分前調節(jié)組合物的離子強度和/或pH(例如pH < 7)。通常，先添加預吸附到AlPO4上的HB (如果其被包括在組合物中)，然后添加預吸附到Al (OH)3或AlPO4上的DT，隨后添加預吸附到Al (OH) 3或AlPO4上的TT，然后添加任選的預吸附到Al (OH) 3上的IPV，隨手調節(jié)pH到例如ρΗ5.9-7.2，或ρΗ6-7，或ρΗ6.2-6.8，或ρΗ6.4-6.6，然后添加預吸附到AlPO4上的Pw。任選的,可以在該步驟的任一點添加Hib、V1、MenA、MenC、MenW、Men Y、MenB和/或H印A抗原。在一個實施方案中，可以在pH調節(jié)前添加Hib、V1、MenA、MenC、MenW、Men Y、MenB和/或H印A抗原。在一個實施方案中，本發(fā)明的一種或多種抗原吸附到磷酸鋁或氫氧化鋁或這兩者的混合物上。在另一個實施方案中，本發(fā)明的抗原與藥學上可接受的賦形劑和/或佐劑混合。
[0188]在一個實施方案中，按照以下順序制備本發(fā)明的疫苗組合物:添加預吸附的HBsAg，繼之以預吸附的白喉類毒素，繼之以預吸附的破傷風類毒素和IPV，然后在添加預吸附的Pw前調節(jié)pH到大約6.5。
[0189]在另一個實施方案中，按照以下順序制備本發(fā)明的疫苗組合物:添加預吸附的HBsAg，繼之以IPV，繼之以預吸附的HBsAg，繼之以預吸附的白喉類毒素，在添加預吸附的Pw前調節(jié)pH到大約6.5。
[0190]通常，可以如下所述制備根據(jù)本發(fā)明任意方面的聯(lián)合疫苗組合物:將IPV、DTPw,HepB, MenA, MenC, Menff, MenY, MenB, V1、甲肝或其他組分預吸附到合適的佐劑上，尤其是氫氧化鋁或磷酸鋁或這兩者的混合物。在提供足夠相應組分完整和穩(wěn)定吸附的時間之后，在合適的條件下組合不同的組分。在與DTPw疫苗混合之前,!!;^、^^、]^]^、]^]^、]^!^和/或MenY綴合物可以吸附到或可以不吸附到鋁佐劑鹽上。
[0191]在一個實施方案中，在15。。到30°C之間(例如19。。到27°C之間，或23±4°C )制備本發(fā)明的疫苗。
[0192]本發(fā)明疫苗的施用
[0193]本發(fā)明提供一種在哺乳動物中激發(fā)免疫應答的方法，包括施用有效量的本發(fā)明疫苗的步驟。所述疫苗可以是預防性施用(即預防感染)。所述免疫應答優(yōu)選的是保護性的，并且優(yōu)選的包括抗體。所述方法可以激發(fā)加強應答。
[0194]在初次接種后，受試者可以接受有足夠間隔的一次或數(shù)次加強(后續(xù)的)免疫。定量治療可以是單劑量方案或多劑量方案。多劑量可用于初次免疫方案和/或加強免疫方案。初始劑量方案(其可以在生命的第一年進行)后可以跟隨加強劑量方案。初免接種之間(例如4-16周之間)以及初免和加強之間的合適周期可以按照常規(guī)來確定。
[0195]在一個實施方式中，·哺乳動物是人。當疫苗用于預防性用途時，人優(yōu)選的是兒童(例如初學走路的嬰兒)或少年；當疫苗用于治療性用途時，人優(yōu)選的是成人。預期用于兒童的疫苗也可給成人施用，例如用于評價安全性，劑量，免疫原性等等。
[0196]本發(fā)明的疫苗制劑可以用于保護或治療易受感染的哺乳動物，通過直接給患者施用所述疫苗。直接遞送可以通過以下方式實現(xiàn):腸胃外給藥(肌內，腹腔內，皮內，皮下地，靜脈內，或向組織的細胞間隙)；或通過直腸，口服，陰道，局部，透皮，鼻內，眼，耳，肺部或其他粘膜施用。在一個實施方案中，通過肌肉注射到大腿或上臂進行施用。注射可以通過針頭(例如皮下注射針頭)，但可選擇地也可使用無針頭注射。典型的肌內劑量是0.5mL。
[0197]細菌感染影響身體的各個區(qū)域，因此本發(fā)明的組合物可以被制備成各種形式。例如，所述組合物可以被制備為可注射的，例如液體溶液或懸浮液。所述組合物可以制備用于肺部施用諸如吸入器，利用細粉或噴霧劑。所述組合物可以被制備為栓劑或陰道栓劑。所述組合物可以被制備用于鼻、耳或眼施用，諸如噴霧劑、滴劑、凝膠或粉末(參見例如Almeida
&Alpar, 1996, J Drug Targeting, 3:455 ;Bergquist 等人，1998, APMIS, 106:800)。成功的DTP疫苗鼻內施用已經(jīng)被報道(Ryan等人，1999, Infect.1mmun.,67:6270 ；Nagai等人，2001，Vaccine,19:4824)。
[0198]在一個實施方案中，第一和第二(以及合適的情況下第三)容器的疫苗被同時施用到不同位點，而在一個選擇性的實施方案中，本發(fā)明人設想第一和第二容器的內含物可以混合(任選的臨用前)，然后作為單疫苗施用。
[0199]本發(fā)明可以用于引發(fā)全身性和/或粘膜免疫。[0200]一種檢測治療性治療效果的方法涉及在施用本發(fā)明組合物后監(jiān)測細菌感染。一種檢測預防性治療效果的方法涉及在施用所述組合物后監(jiān)測抗所述抗原的免疫應答。通過將本發(fā)明的組合物給試驗受試者(例如12-16月大的兒童，或動物模型-W001/30390)施用可以測定它們的免疫原性，然后確定標準免疫參數(shù)。通常在施用所述組合物后大約4周測定這些免疫應答，并與施用所述組合物之前測定的值進行比較。不是在患者中評價真正的保護效果，用于評價DTP疫苗效果的標準動物和體外模型以及保護關聯(lián)是公知的。
[0201]在各種情況下，本發(fā)明人預期本文術語“包括”、“包含”和“含有”可以任選的分別與術語“由...組成”、“由...構成”和“由...組成的”替換。這不改變這些術語的通常含義，其旨在提供所述替換的基礎，而不是使它們含義相同。
[0202]所有引用的參考文獻和出版物都在此引入作為參考。
[0203]實施例
[0204]提供的實施例只是用于說明目的，而不是用于限制本發(fā)明的范圍。
[0205]實施例1:對低劑量IPV制劑的測試
[0206]對于實施例1的所有制劑，除了 IPV(其被添加但沒有吸附)以外，在制備前通過添加鋁鹽使抗原吸附，。
[0207]D、T、Pw和HBsAg 的吸附方法見圖4_圖7。
[0208]
[0209]
[0210]
[0211]
[0212]
[0213]
[0214]
[0215]
[0216]
[0217]
[0218]
[0219]
[0220]檢測了數(shù)種不同的制劑:
[0221]?白喉類毒素、破傷風類毒素、百日咳全細胞和乙肝表面抗原的組合:DTPwSF_HB作為參照(DTPwSF表示其是不含硫柳汞的制劑)，按照制備方法I (表5)配制。
[0222]# GlaxoSmithKline Biologicals S.A.產丨丨丨丨丨丨Poliorix? (IPV 是獨立不吸附的)作為標準劑量的未吸附參照，按照制備方法2(表5)配制。
[0223]?白喉類毒素、破傷風類毒素、百日咳全細胞、乙肝表面抗原和滅活脊髓灰質炎病毒的組合:在Pw前向DTPwSF-HB-1PV中添加IPV，按照制備方法3 (表5)配制。
[0224]?白喉類毒素、破傷風類毒素、百日咳全細胞、乙肝表面抗原和滅活脊髓灰質炎病毒的組合:剛好在T吸附之后向DTPwSF-HB-1PV中添加IPV。這種添加方法允許IPV吸附到Al (OH)3上。該疫苗按照制備方法4(表5)配制。
[0225]安慰劑只包含鋁鹽、IPV和其它抗原的緩沖液。因為IPV是該安慰劑的唯一抗原，所以不存在吸附競爭。因此，IPV是完全吸附的。該疫苗按照制備方法5(表5)配制。
[0226]利用制備方法2、3、4和5配制的疫苗被制備為IPV劑量范圍介于40/8/32IU/0.5mL 的標準 IPV 劑量的 12.5%和 100%。
[0227]
【權利要求】
1.一種包含滅活的I型脊髓灰質炎病毒的疫苗，其中滅活的I型脊髓灰質炎病毒的劑量大于IOD抗原單位并小于20D抗原單位。
2.一種包含滅活的I型脊髓灰質炎病毒的疫苗，其中滅活的I型脊髓灰質炎病毒的量為每0.5mL大于IOD抗原單位并小于20D抗原單位。
3.如權利要求1或2所述的疫苗，其中所述滅活的I型脊髓灰質炎病毒的量為標準40D抗原單位劑量的 26-49%、30-45%、33-40%或 35-37%。
4.如權利要求1或2所述的疫苗，其中所述滅活的I型脊髓灰質炎病毒的量為每0.5mL標準40D抗原單位劑量的26-49%、30-45%、33-40%或35-37%。
5.如權利要求1-4所述的疫苗，其中所述疫苗還包含滅活的3型脊髓灰質炎病毒，其劑量為8-20D抗原單位，9-19D抗原單位，10-18D抗原單位，11-17D抗原單位，12-16D抗原單位，或13-1?抗原單位；例如大約或精確的14D抗原單位。
6.如權利要求1-4所述的疫苗，其中所述疫苗還包含滅活的3型脊髓灰質炎病毒，其量為每0.5mL8-20D抗原單位，9-19D抗原單位，10-18D抗原單位，11-17D抗原單位，12-16D抗原單位，或13-1?抗原單位；例如每0.5mL大約或精確的14D抗原單位。
7.如權利要求5或6所述的疫苗，其中所述滅活的3型脊髓灰質炎病毒的劑量為大于8并小于20D抗原單位。
8.如權利要求5或6所述的疫苗，其中所述滅活的3型脊髓灰質炎病毒的量為每0.5mL大于8并小于20D抗原單位。
9.一種包含滅活的3型脊·髓灰質炎病毒的IPV疫苗，其中滅活的3型脊髓灰質炎病毒的劑量為大于8并小于20D抗原單位，9-19D抗原單位，10-18D抗原單位，11-17D抗原單位，12-16D抗原單位，或13-1?抗原單位；例如大約或精確的14D抗原單位。
10.一種包含滅活的3型脊髓灰質炎病毒的IPV疫苗，其中滅活的3型脊髓灰質炎病毒的量為每0.5mL大于8并小于20D抗原單位，9-19D抗原單位，10-18D抗原單位，11-17D抗原單位，12-16D抗原單位，或13-1?抗原單位；例如每0.5mL大約或精確的14D抗原單位。
11.如權利要求9或10所述的疫苗，其中所述疫苗還包含滅活的I型脊髓灰質炎病毒，其劑量為10-20D抗原單位，11-19D抗原單位，12-18D抗原單位，13-17D抗原單位，14-16D抗原單位；例如大約或精確的MD抗原單位。
12.如權利要求9或10所述的疫苗，其中所述疫苗還包含滅活的I型脊髓灰質炎病毒，其量為每0.5mL10-20D抗原單位，11-19D抗原單位，12-18D抗原單位，13-17D抗原單位，14-16D抗原單位；例如每0.5mL大約或精確的MD抗原單位。
13.如權利要求1-12所述的疫苗，其中所述疫苗還包含滅活的2型脊髓灰質炎病毒，其劑量為2-4D抗原單位。
14.如權利要求1-12所述的疫苗，其中所述疫苗還包含滅活的2型脊髓灰質炎病毒，其量為每0.5mL2-4D抗原單位。
15.如權利要求13或14所述的疫苗，其中所述滅活的2型脊髓灰質炎病毒的劑量為大于2D抗原單位并小于4D抗原單位，或其劑量為大約或精確的3D抗原單位。
16.如權利要求13或14所述的疫苗，其中所述滅活的2型脊髓灰質炎病毒的量為每0.5mL大于2D抗原單位并小于4D抗原單位，或其量為每0.5mL大約或精確的3D抗原單位。
17.如權利要求1-16所述的疫苗，其中與包含40D抗原單位的I型IPV的疫苗相比，其相對效力值至少為0.85,0.9,0.95或I。
18.如權利要求1-17所述的疫苗，其中與包含8D抗原單位的2型IPV的疫苗相比，其相對效力值至少為0.85,0.9,0.95或I。
19.如權利要求1-18所述的疫苗，其中與包含32D抗原單位的3型IPV的疫苗相比，其相對效力值至少為0.85,0.9,0.95或I。
20.如權利要求1-19所述的疫苗，其中所述疫苗還包含白喉類毒素，其任選吸附到氫氧化鋁或磷酸鋁或這兩者的混合物上。
21.如權利要求1-20所述的疫苗，其中所述疫苗還包含破傷風類毒素，其任選吸附到氫氧化鋁或磷酸鋁或這兩者的混合物上。
22.如權利要求1-21所述的疫苗，其中所述疫苗還包含滅活的全細胞百日咳桿菌(Bordetella pertussis),其基本上不含硫柳萊,任選吸附到氫氧化招或磷酸招或這兩者的混合物上。
23.如權利要求1-21所述的疫苗，其中所述疫苗還包含兩種或更多種非細胞百日咳組分(Pa)(例如百日咳類毒素(PT)，絲狀血細胞凝集素(FHA)和百日咳桿菌粘附素(PRN))，其任選吸附到氫氧化鋁 或磷酸鋁或這兩者的混合物上。
24.—種DTP疫苗，其基本上不含硫柳汞，并且包含一種或多種IPV組分，所述IPV組分選自； a.1型IPV，其劑量為10-36D抗原單位，11-32D抗原單位，12-28D抗原單位，13-24D抗原單位，14-20D抗原單位或15-19D抗原單位；或大約或精確的18D抗原單位； b.2型IPV，其劑量為2-7D抗原單位，3-6D抗原單位，或4-?抗原單位；和 c.3型IPV，其劑量為8-29D抗原單位，9-26D抗原單位，10-23D抗原單位，11-20D抗原單位，12-17D抗原單位，或13-14D抗原單位。
25.如權利要求24所述的疫苗，所述疫苗包含滅活的I型脊髓灰質炎病毒，其劑量為10-36D抗原單位，11-32D抗原單位，12-28D抗原單位，13-24D抗原單位，14-20D抗原單位或15-19D抗原單位，或大約或精確的18D抗原單位。
26.如權利要求24或25所述的疫苗，所述疫苗包含滅活的2型脊髓灰質炎病毒，其劑量為2-7D抗原單位，3-6D抗原單位，或4-?抗原單位。
27.如權利要求24-26所述的疫苗，所述疫苗包含滅活的3型脊髓灰質炎病毒，其劑量為8-29D抗原單位，9-26D抗原單位，10-23D抗原單位，11-20D抗原單位，12-17D抗原單位，或13-14D抗原單位。
28.如權利要求1-27所述的疫苗，其包含吸附到氫氧化鋁或磷酸鋁或這兩者的混合物上的滅活的I型脊髓灰質炎病毒。
29.如權利要求1-28所述的疫苗，其包含吸附到氫氧化鋁或磷酸鋁或這兩者的混合物上的滅活的2型脊髓灰質炎病毒。
30.如權利要求1-29所述的疫苗，其包含吸附到氫氧化鋁或磷酸鋁或這兩者的混合物上的滅活的3型脊髓灰質炎病毒。
31.如權利要求1-30所述的疫苗，所述疫苗包含吸附到鋁鹽上的1、2和3型IPV。
32.如權利要求1-31所述的疫苗，其包含吸附到氫氧化鋁或磷酸鋁或這兩者的混合物上的1、2和3型IPV。
33.如權利要求1-32所述的疫苗，其包含任選吸附到氫氧化鋁或磷酸鋁或這兩者的混合物上的白喉類毒素。
34.如權利要求1-33所述的疫苗，其包含任選吸附到氫氧化鋁或磷酸鋁或這兩者的混合物上的破傷風類毒素。
35.如權利要求1-34所述的疫苗，其包含任選吸附到磷酸鋁上的滅活的全細胞百日咳桿菌或兩種或更多種非細胞百日咳組分(Pa)(例如PT、FHA和PRN)。
36.如權利要求1-35所述的疫苗，其中所述疫苗還包含乙肝表面抗原，其基本上不含硫柳汞，任選吸附到磷酸鋁上。
37.如權利要求1-36所述的疫苗，其中所述疫苗還包含載體蛋白與B型流感嗜血桿菌(Hib)莢膜糖的綴合物，其任選吸附到磷酸鋁上或不吸附到佐劑上。
38.如權利要求1-37所述的疫苗，其中所述疫苗還包含載體蛋白與細菌莢膜糖的一種或多種綴合物，所述細菌選自A型腦膜炎球菌(Neisseria meningitidis), C型腦膜炎球菌，W型腦膜炎球菌和Y型腦膜炎球菌，所述綴合物任選吸附到氫氧化鋁或磷酸鋁或這兩者的混合物上或不吸附到佐劑上。
39.如權利要求1-38所述的疫苗，其中所述疫苗還包含B型腦膜炎球菌(MenB)外膜囊泡或LOS或綴合的MenB莢膜糖，或其衍生物，其任選吸附到氫氧化鋁或磷酸鋁或這兩者的混合物上或不吸附到佐劑上。
40.如權利要求1-39所述的疫苗，其中所述疫苗還包含與載體蛋白綴合的傷寒沙門氏菌(Salmonella typhi) Vi糖，其任選吸附到氫氧化鋁或磷酸鋁或這兩者的混合物上或不吸附到佐劑上。
41.如權利要求1-40所述·的疫苗，其中所述疫苗還包含甲肝抗原，其任選吸附到氫氧化鋁或磷酸鋁或這兩者的混合物上。
42.如權利要求1-41所述的疫苗，其中所述疫苗包含DT，其量為每0.5mL劑量中5_50，7-30Lf或大約或精確的7.5Lf或25Lf。
43.如權利要求1-41所述的疫苗，其中所述疫苗包含DT，其量為每0.5mL劑量中小于5Lf,或l-4Lf或大約或精確的2Lf。
44.如權利要求1-43所述的疫苗，其中所述疫苗包含TT，其量為每0.5mL劑量中2.5-30Lf，3-20Lf，5-15Lf 或精確的或大約 IOLf。
45.如權利要求1-44所述的疫苗，其中所述疫苗包含Pa，其包含每0.5mL劑量中2-50 μ g, 5-40 μ g, 10-30 μ g 或精確的或大約 25 μ g 的 PT。
46.如權利要求1-45所述的疫苗，其中所述疫苗包含Pa，其包含每0.5mL劑量中精確的或大約2.5或8μ g的PT。
47.如權利要求1-46所述的疫苗，其中所述疫苗包含Pa，其包含每0.5mL劑量中2-50 μ g, 5-40 μ g, 10-30 μ g 或精確的或大約 25 μ g 的 FHA。
48.如權利要求1-47所述的疫苗，其中所述疫苗包含Pa，其包含每0.5mL劑量中精確的或大約2.5或8μ g的FHA。
49.如權利要求1-48所述的疫苗，其中所述疫苗包含Pa，其包含每0.5mL劑量中0.5-20 μ g, 0.8-15 μ g, 2-10 μ g 或精確的或大約 8 μ g 的 PRN。
50.如權利要求1-49所述的疫苗，其中所述疫苗包含Pa，其包含每0.5mL劑量中精確的或大約0.8或2.5 i! g的PRN。
51.如權利要求1-44所述的疫苗，其中所述疫苗包含Pw，其量為每0.5mL劑量5-5010U, 7-4010U, 9-35IOU, 11-3010U，13-25IOU，15-21TOU 或大約或精確的 2010U。
52.如權利要求1-51所述的疫苗，其中所述疫苗包含HB，其量為每0.5mL5-20iig、8-15 u g或大約或精確的10 u g0
53.如權利要求1-52所述的疫苗，其中所述疫苗包含Hib，其量為每0.5mL劑量5-20 u g、8-15 u g或大約或精確的10 u g0
54.如權利要求1-52所述的疫苗，其中所述疫苗包含Hib，其量為每0.5mL劑量1-6 U g，2-4 u g，或大約或精確的2.5 ii g。
55.如權利要求1-54所述的疫苗，其中所述疫苗還包含一種或多種佐劑，所述佐劑選自:鋁鹽諸如氫氧化鋁或磷酸鋁，鈣鹽、鐵鹽或鋅鹽，酰化酪氨酸或酰化糖的不溶性懸浮液，陽離子或陰離子衍生的糖，聚磷腈，可生物降解的微球，單磷酸類脂A (MPL)，毒性減弱的類脂A衍生物，3-0-脫酰MPL，quiI A，皂苷，QS21，生育酚，AS-2，CpG寡核苷酸，生物粘附劑，粘膜粘附劑，微粒，脂質體，聚氧乙烯醚制劑，聚氧乙烯酯制劑，胞壁酰肽，咪唑并喹啉化合物，白介素，巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)，腫瘤壞死因子(TNF)，粒細胞和巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)。
56.如權利要求55所述的疫苗，其中所述佐劑是優(yōu)選的THl誘導物。
57.—種包含疫苗的注射器，其包含一次劑量的如權利要求1-56中任一項所述的疫苗。
58.—種包含疫苗的小瓶,其包含I次或2次劑量的如權利要求1-56中任一項所述的疫苗。
59.—種制備如權利要求1-58所述的疫苗的方法，所述方法包括將IPV與藥學上可接受的賦形劑混合的步驟。
60.—種預防或治療脊髓灰質炎病毒感染及任選的破傷風桿菌(Clostridiumtetani)、白喉桿菌(Corynebacterium diphtheria)和 / 或百日咳桿菌(Clostridiumtetani)感染的方法，所述方法包括給需要其的人施用如權利要求1_58所述的疫苗。
61.一種預防或治療脊髓灰質炎病毒感染及任選的破傷風桿菌(Clostridiumtetani)、白喉桿菌(Corynebacterium diphtheria)和 / 或百日咳桿菌(Clostridiumtetani)感染的方法，所述方法包括在生命第一年的初次免疫方案中給需要其的人施用如權利要求1-58所述的疫苗。
62.一種預防或治療脊髓灰質炎病毒、破傷風桿菌、白喉桿菌和百日咳桿菌感染及任選的乙肝、b型流感嗜血桿菌、A型腦膜炎球菌、C型腦膜炎球菌、W型腦膜炎球菌、Y型腦膜炎球菌、B型腦膜炎球菌、傷寒沙門氏菌和甲肝感染中的一種或多種的方法，所述方法包括施用如權利要求24-58所述的疫苗。
63.如權利要求1-58所述的疫苗在制備用于預防由脊髓灰質炎病毒及任選的破傷風桿菌、白喉桿菌和/或百日咳桿菌引起的疾病的藥物中的用途。
64.如權利要求24-58所述的疫苗在制備用于預防由脊髓灰質炎病毒、破傷風桿菌、白喉桿菌和百日咳桿菌感染及任選的乙肝、b型流感嗜血桿菌、A型腦膜炎球菌、C型腦膜炎球菌、W型腦膜炎球菌、Y型腦膜炎球菌、B型腦膜炎球菌、傷寒沙門氏菌和甲肝感染中的一種或多種引起的疾病的藥物中的用途。
65.包含25-50%的IPV標準劑量的疫苗在制備用于預防脊髓灰質炎的藥物中的用途，其中所述疫苗實現(xiàn)至少0.85,0.9,0.95或I的相對效力值。
66.如權利要求65所述的用途,其中所述疫苗是權利要求1-58中任一所述的疫苗。
67.一種試劑盒，所述試劑盒包括第一容器、第二容器和任選的第三容器，其中: a)第一容器包括 1.如權利要求1-58所述的IPV疫苗； 2.如權利要求20-58所述的白喉類毒素； 3.如權利要求21-58所述的破傷風類毒素； 4.如權利要求22-58所述的滅活的全細胞百日咳桿菌(Pw)，或如權利要求23-58所述的非細胞百日咳組分(Pa)； 5.任選的如權利要求36-58所述的乙肝表面抗原； 6.任選的如權利要求37-58所述的載體蛋白與B型流感嗜血桿菌莢膜糖的綴合物， b)第二容器包括 1.任選的如權利要求36-58所述的乙肝表面抗原；· 2.任選的如權利要求37-58所述的載體蛋白與B型流感嗜血桿菌莢膜糖的綴合物； 3.任選的如權利要求38-58所述的MenA、MenC、MenW或MenY綴合物中的一種或多種； 4.任選的如權利要求39-58所述的MenB外膜囊泡或LOS或MenB莢膜糖綴合物； 5.任選的如權利要求40-58所述的傷寒沙門氏菌Vi綴合物； 6.任選的如權利要求41-58所述的甲肝抗原， c)任選的第三容器包括 1.任選的如權利要求36-58所述的乙肝表面抗原； 2.任選的如權利要求37-58所述的載體蛋白與B型流感嗜血桿菌莢膜糖的綴合物； 3.任選的如權利要求38-58所述的MenA、MenC、MenW或MenY綴合物中的一種或多種； 4.任選的如權利要求39-58所述的MenB外膜囊泡或LOS或MenB莢膜糖綴合物； 5.任選的如權利要求40-58所述的傷寒沙門氏菌Vi綴合物； 6.任選的如權利要求41-58所述的甲肝抗原。
68.如權利要求67所述的試劑盒，其中乙肝表面抗原存在于所述第一容器。
69.如權利要求67所述的試劑盒，其中乙肝表面抗原存在于所述第二容器。
70.如權利要求67所述的試劑盒，其中乙肝表面抗原存在于所述第三容器。
71.如權利要求67-70所述的試劑盒，其中載體蛋白與B型流感嗜血桿菌莢膜糖的綴合物存在于所述第一容器。
72.如權利要求67-70所述的試劑盒，其中載體蛋白與B型流感嗜血桿菌莢膜糖的綴合物存在于所述第二容器。
73.如權利要求67-70所述的試劑盒，其中載體蛋白與B型流感嗜血桿菌莢膜糖的綴合物存在于所述第三容器。
74.如權利要求67-73所述的試劑盒，其中MenA、MenC,MenW或MenY綴合物中的一種或多種存在于所述第二容器。
75.如權利要求67-73所述的試劑盒，其中MenA、MenC,MenW或MenY綴合物中的一種或多種存在于所述第三容器。
76.如權利要求67-75所述的試劑盒，其中MenB外膜囊泡或LOS或MenB綴合物存在于所述第二容器。
77.如權利要求67-75所述的試劑盒，其中MenB外膜囊泡或LOS或MenB綴合物存在于所述第三容器。
78.如權利要求67-77所述的試劑盒，其中傷寒沙門氏菌Vi綴合物存在于所述第二容器。
79.如權利要求67-77所述的試劑盒，其中傷寒沙門氏菌Vi綴合物存在于所述第三容器。
80.如權利要求67-79所述的試劑盒，其中甲肝抗原存在于所述第二容器。
81.如權利要求67-79所述的試劑盒，其中甲肝抗原存在于所述第三容器。
82.如權利要求67-81所述的試劑盒，其提供用于施用所述疫苗的一系列說明書。
83.如權利要求67-82所述的試劑盒在制備用于預防脊髓灰質炎的藥物中的用途。
84.—種施用如權利要求67-82所述的試劑盒的方法，其中所有容器中的疫苗在同一次就醫(yī)時同時施用。
85.如權利要求1-84所述的疫苗、方法、用途或試劑盒，其中如果存在I型IPV，則所述I型IPV來自于Mahoney株。
86.如權利要求1-85所述的疫苗、方法、用途或試劑盒，其中如果存在2型IPV，則所述2型IPV來自于MEF-1株。
87.如權利要求1-86所述的疫苗、方法、用途或試劑盒，其中如果存在3型IPV，則所述3型IPV來自于Saukett株。
【文檔編號】A61K39/295GK103585624SQ201310079459
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2007年9月7日 優(yōu)先權日:2006年9月7日
【發(fā)明者】H.德亨普丁納, M.迪謝納, A.瑪麗, M.索恩沃 申請人:葛蘭素史密絲克萊恩生物有限公司