一種幽門螺桿菌感染動(dòng)物模型的建立方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種幽門螺桿菌感染動(dòng)物模型的建立方法，其包括：1、以4周齡雌性C57BL/6小鼠為試驗(yàn)動(dòng)物，用混合抗生素灌胃3～7天；所述的混合抗生素為慶大霉素、萬(wàn)古霉素和制霉菌素；2、將步驟1灌胃后的C57BL/6小鼠飼養(yǎng)6～8天；3、接種幽門螺桿菌：將步驟2得到的C57BL/6小鼠禁食，用幽門螺桿菌菌液灌胃，8～12小時(shí)后進(jìn)食；所述的步驟3的接種頻率為：隔日1次，共2～4次；4、將經(jīng)步驟3，2～4次接種后的小鼠進(jìn)行飼養(yǎng)。本發(fā)明的建模方法實(shí)驗(yàn)時(shí)間短、操作次數(shù)少、感染幽門螺桿菌數(shù)量級(jí)高、感染時(shí)間長(zhǎng)久，模型能廣泛應(yīng)用于相關(guān)研究的幽門螺桿菌感染動(dòng)物的方法。
【專利說(shuō)明】一種幽門螺桿菌感染動(dòng)物模型的建立方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物學(xué)和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)領(lǐng)域，特別涉及一種幽門螺桿菌感染動(dòng)物模型的建立方法。
【背景技術(shù)】
[0002]幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，Hp)被公認(rèn)為是胃炎、消化性潰瘍和胃癌的主要致病因子，人是幽門螺桿菌感染的唯一易感宿主。在發(fā)達(dá)國(guó)家，幽門螺桿菌感染率約為50%左右，而在發(fā)展中國(guó)家則達(dá)到60%以上。為此，國(guó)內(nèi)外研究者正在通過(guò)建立幽門螺桿菌感染的動(dòng)物模型，研究幽門螺桿菌致病機(jī)理、特異性防治以及一些藥物或微生態(tài)制劑的療效。
[0003]國(guó)內(nèi)外關(guān)于幽門螺桿菌感染動(dòng)物模型的報(bào)道中，以豚鼠、裸鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的，由于易死亡、自身的免疫缺陷等問(wèn)題，使得建模成功率低于80%，且模型應(yīng)用受到一定局限；以小鼠CD1、Balb/c A以及Balb/c等品種作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的，則感染率不高，且模型不穩(wěn)定。其他以猴子、沙鼠、小豬等動(dòng)物為模型的，存在價(jià)格昂貴、數(shù)量少、飼養(yǎng)條件高、感染困難等限制因素。同時(shí)，所有報(bào)道中的建模實(shí)驗(yàn)時(shí)間較長(zhǎng)，連續(xù)灌胃且次數(shù)較多，大大增加了建模時(shí)動(dòng)物的死亡率和并發(fā)癥的產(chǎn)生。因此，對(duì)于幽門螺桿菌機(jī)理、藥物應(yīng)用等研究，一個(gè)穩(wěn)定的、重現(xiàn)性好的動(dòng)物模型進(jìn)行臨床前的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)是必要的，找到一種普通的、易于飼養(yǎng)的動(dòng)物，建立一個(gè)建模時(shí)間短、操作次數(shù)少、感染幽門螺桿菌數(shù)量級(jí)高、建模致死率低的動(dòng)物模型建立方法，為幽門螺桿菌感染的徹底攻克奠定了基礎(chǔ)。`
【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于，為了克服現(xiàn)有技術(shù)中建立幽門螺桿菌感染的動(dòng)物模型可控性差、不穩(wěn)定，成功率不高，建模時(shí)間較長(zhǎng)，操作復(fù)雜，成本較高，一般實(shí)驗(yàn)室中難于建立等缺陷，而提供了一種幽門螺桿菌感染動(dòng)物模型的建立方法。本發(fā)明的建模方法實(shí)驗(yàn)時(shí)間短、操作次數(shù)少、感染幽門螺桿菌數(shù)量級(jí)高、感染時(shí)間長(zhǎng)久，模型能廣泛應(yīng)用于相關(guān)研究的幽門螺桿菌感染動(dòng)物的方法。
[0005]本發(fā)明通過(guò)下述技術(shù)方案解決上述技術(shù)問(wèn)題:
[0006]本發(fā)明提供了一種幽門螺桿菌感染動(dòng)物模型的建立方法，其包括以下步驟:
[0007]步驟1、以4周齡雌性C57BL/6小鼠為試驗(yàn)動(dòng)物，用混合抗生素灌胃3-7天；所述的混合抗生素為慶大霉素、萬(wàn)古霉素和制霉囷素；
[0008]步驟2、將步驟I灌胃后的C57BL/6小鼠飼養(yǎng)6-8天；
[0009]步驟3、接種幽門螺桿菌:將步驟2得到的C57BL/6小鼠禁食，用幽門螺桿菌菌液灌胃，8-12小時(shí)后進(jìn)食；
[0010]所述的步驟3的接種頻率為:隔日I次，共2-4次；
[0011]步驟4、將經(jīng)步驟3，2-4次接種后的小鼠進(jìn)行飼養(yǎng)。
[0012]步驟I中，用混合抗生素灌胃可以有效降低小鼠胃部原有菌群對(duì)幽門螺桿菌感染建立的影響。所述的灌胃的方法可參考本領(lǐng)域中常規(guī)的灌胃方法進(jìn)行。所述的用混合抗生素灌胃的天數(shù)優(yōu)選7天。
[0013]步驟I中，所述的4周齡雌性C57BL/6小鼠可為本領(lǐng)域常規(guī)的4周齡雌性C57BL/6小鼠，一般體重都在llg± I-2g。
[0014]步驟I中，所述的混合抗生素中，較佳地，慶大霉素0.058-0.062萬(wàn)單位/只/天，萬(wàn)古霉素1.2-1.7mg/只/天，制霉菌素0.72-0.77萬(wàn)單位/只/天；更佳地，慶大霉素0.062萬(wàn)單位/只/天，萬(wàn)古霉素1.7mg/只/天，制霉菌素0.77萬(wàn)單位/只/天。
[0015]步驟2中，所述的飼養(yǎng)可為本領(lǐng)域中常規(guī)的飼養(yǎng)方法，一般在SPF級(jí)環(huán)境中飼養(yǎng)。所述的 SPF (specific-pathogen-free)級(jí)環(huán)境為:溫度 22±2°C,,濕度 56±5%，I 周換 2-3次墊料，控制12h光照，12h黑暗；飼料:常規(guī)飼料；自由進(jìn)食、進(jìn)水。
[0016]步驟2中，所述的飼養(yǎng)的時(shí)間優(yōu)選為7天。
[0017]步驟3中，所述的禁食的時(shí)間優(yōu)選12-24h，更優(yōu)選24h。
[0018]步驟3中，所述的幽門螺桿菌菌液為將幽門螺桿菌菌體懸于其液體培養(yǎng)基中形成的菌液；所述的幽門螺桿菌菌液中，所述的液體培養(yǎng)基可為BHI (brain heart infusion)。
[0019]步驟3中，所述的幽門螺桿菌優(yōu)選為幽門螺桿菌悉尼菌株SSl (H.pylori Sydneystrain SSI, Hp SSlX
[0020]步驟3中，所述的幽門螺桿菌菌液中，其細(xì)菌密度優(yōu)選大于IX 108cfu/mL，更優(yōu)選為 lX109cfu/mL。
[0021]步驟3中，所述的灌胃的方法可為本領(lǐng)域常規(guī)的灌胃方法。所述的灌胃的次數(shù)優(yōu)選3次。
[0022]步驟3中，所述的幽門螺桿菌菌液灌胃量?jī)?yōu)選0.18-0.22mL/只/次，更優(yōu)選
0.2mL/ 只 / 次。
[0023]步驟3中，所述的接種頻率優(yōu)選為:隔日I次，共3次。
[0024]步驟4中，所述的飼養(yǎng)的方法可為本領(lǐng)域常規(guī)的飼養(yǎng)方法，一般在SPF級(jí)環(huán)境中飼養(yǎng)。所述的 SPF (specific-pathogen-free)級(jí)環(huán)境為:溫度 22±2°C,,濕度 56±5%，I 周換2-3次墊料，控制12h光照，12h黑暗；飼料:常規(guī)飼料；自由進(jìn)食、進(jìn)水。所述的飼養(yǎng)的時(shí)間優(yōu)選為兩周。
[0025]所述的幽門螺桿菌感染動(dòng)物模型的建立方法后，還可通過(guò)抽檢確定步驟來(lái)確定是否將幽門螺桿菌定殖于胃部。
[0026]所述的抽檢確定步驟優(yōu)選包括:將經(jīng)過(guò)上述步驟I-步驟4處理的C57BL/6小鼠禁食24h后處死，取幽門端，通過(guò)尿素酶實(shí)驗(yàn)、細(xì)菌培養(yǎng)和病理切片驗(yàn)證幽門螺桿菌是否定殖于胃部。所述的抽檢確定步驟可參考文獻(xiàn):“建立幽門螺桿菌感染BALB/c小鼠動(dòng)物模型”，《使用臨床醫(yī)藥雜志》，2013年第17卷第I期，P27-P33。
[0027]本發(fā)明中，小鼠進(jìn)食的飼料可為本領(lǐng)域中常規(guī)的飼養(yǎng)飼料。
[0028]在不違背本領(lǐng)域常識(shí)的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可任意組合，即得本發(fā)明各較佳實(shí)例。
[0029]本發(fā)明中除所述的幽門螺桿菌菌株外，所用試劑和原料均市售可得。
[0030]本發(fā)明的積極進(jìn)步效果在于:本發(fā)明的建模方法實(shí)驗(yàn)時(shí)間短、操作次數(shù)少、感染幽門螺桿菌數(shù)量級(jí)高、感染時(shí)間長(zhǎng)久，模型能廣泛應(yīng)用于各項(xiàng)幽門螺桿菌相關(guān)研究?！緦＠綀D】

【附圖說(shuō)明】
[0031]圖1為陰性對(duì)照小鼠胃組織切片。
[0032]圖2為陽(yáng)性對(duì)照小鼠胃組織切片。
【具體實(shí)施方式】
[0033]下面通過(guò)實(shí)施例的方式進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實(shí)施例范圍之中。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，按照常規(guī)方法和條件，或按照商品說(shuō)明書選擇。
[0034]下述實(shí)施例中涉及的飼養(yǎng)均是在SPF級(jí)環(huán)境下進(jìn)行飼養(yǎng)，具體條件為:溫度22±2°C，，濕度56±5%，I周換2-3次墊料，控制12h光照，12h黑暗；飼料:常規(guī)飼料；自由進(jìn)食、進(jìn)水。
[0035]慶大霉素、萬(wàn)古霉素、制霉菌素:上海閃晶生物公司。
[0036]幽門螺桿菌悉尼菌株SSl (H.pylori Sydney strain SSI, Hp SSI):仁濟(jì)醫(yī)院惠贈(zèng)。所述的幽門螺桿菌悉尼菌株SSl在以下文獻(xiàn)中被報(bào)道:“幽門螺桿菌(SSl)感染及其胃炎的小鼠模型”，《中國(guó)微生態(tài)雜志》，2003年6月第15卷第3期。
[0037]BHI 培養(yǎng)基:0xoid 公司。
[0038]實(shí)施例1:
[0039]4周齡雌性C57BL/6小鼠，48只，體重Ilg± I-2g，混合抗生素灌胃7天(方案--慶大霉素0.062萬(wàn)單位/只/天，萬(wàn)古霉`素1.7mg/只/天，制霉菌素0.77萬(wàn)單位/只/天)—正常飼養(yǎng)一周一接種幽門螺桿菌:小鼠禁食24h后，0.18mL/只/次的幽門螺桿菌菌液灌胃，細(xì)菌密度lX109cfu/mL，8小時(shí)后進(jìn)食。隔日I次，共3次一飼養(yǎng)兩周一抽檢確定。建模抽檢的接種成功率100%，建模成活率96%。
[0040]實(shí)施例2:
[0041 ] 4周齡雌性C57BL/6小鼠，48只，體重Ilg± I-2g，混合抗生素灌胃7天(方案--慶大霉素0.058萬(wàn)單位/只/天，萬(wàn)古霉素1.2mg/只/天，制霉菌素0.72萬(wàn)單位/只/天)—正常飼養(yǎng)6天一接種幽門螺桿菌:小鼠禁食24h后，0.2mL/只/次的幽門螺桿菌菌液灌胃，細(xì)菌密度lX109cfu/mL，8小時(shí)后進(jìn)食。隔日I次，共3次一飼養(yǎng)兩周一抽檢確定。建模抽檢的接種成功率100%，建模成活率100%。
[0042]實(shí)施例3:
[0043]4周齡雌性C57BL/6小鼠，48只，體重Ilg± I-2g，混合抗生素灌胃3天(方案--慶大霉素0.062萬(wàn)單位/只/天，萬(wàn)古霉素1.5mg/只/天，制霉菌素0.77萬(wàn)單位/只/天)—正常飼養(yǎng)6天一接種幽門螺桿菌:小鼠禁食24h后，0.22mL/只/次的幽門螺桿菌菌液灌胃，細(xì)菌密度lX109cfu/mL，12小時(shí)后進(jìn)食。隔日I次，共2次一飼養(yǎng)兩周一抽檢確定。建模抽檢的接種成功率100%，建模成活率100%。
[0044]實(shí)施例4:
[0045]4周齡雌性C57BL/6小鼠，48只，體重llg±l-2g，混合抗生素灌胃7天(方案:慶大霉素0.062萬(wàn)單位/只/天，萬(wàn)古霉素1.7g/只/天，制霉菌素0.77萬(wàn)單位/只/天)—正常飼養(yǎng)8天一接種幽門螺桿菌:小鼠禁食12h后，0.22mL/只/次的幽門螺桿菌菌液灌胃，細(xì)菌密度lX108cfu/mL，12小時(shí)后進(jìn)食。隔日I次，共4次一飼養(yǎng)兩周一抽檢確定。建模抽檢的接種成功率100%，建模成活率94%。
[0046]效果實(shí)施例1
[0047]1、建模評(píng)估
[0048]I)尿素酶實(shí)驗(yàn):取小鼠近幽門端1/3的胃，立即置于尿素酶快速檢測(cè)卡(珠海麗珠試劑有限公司)中，24h后觀察。
[0049]結(jié)論:抽檢小鼠尿素酶反應(yīng)均為陽(yáng)性。
[0050]2)細(xì)菌培養(yǎng):將實(shí)施例1的小鼠胃組織幽門端的1/3與400 ii L BHI置于無(wú)菌的玻璃勻漿器內(nèi)勻漿數(shù)次，分別取勻漿液的10倍和100倍的無(wú)菌生理鹽水(濃度0.75%，氯化鈉相對(duì)于溶液的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)，經(jīng)滅菌處理的生理鹽水)稀釋液各IOOii L (樣本1、樣本I1、樣本III)涂板，培養(yǎng)后鏡檢菌落并進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，結(jié)果如表I所示。
[0051 ] 表I建模抽檢幽門螺桿菌菌落計(jì)數(shù)結(jié)果
[0052]
【權(quán)利要求】
1.一種幽門螺桿菌感染動(dòng)物模型的建立方法，其包括以下步驟:步驟1、以4周齡雌性C57BL/6小鼠為試驗(yàn)動(dòng)物，用混合抗生素灌胃3-7天；所述的混合抗生素為慶大霉素、萬(wàn)古霉素和制霉囷素；步驟2、將步驟I灌胃后的C57BL/6小鼠飼養(yǎng)6-8天；步驟3、接種幽門螺桿菌:將步驟2得到的C57BL/6小鼠禁食，用幽門螺桿菌菌液灌胃，8-12小時(shí)后進(jìn)食；所述的步驟3的接種頻率為:隔日I次，共2-4次；步驟4、將經(jīng)步驟3，2-4次接種后的小鼠進(jìn)行飼養(yǎng)。
2.如權(quán)利要求1所述的幽門螺桿菌感染動(dòng)物模型的建立方法，其特征在于:步驟I中，所述的混合抗生素中，慶大霉素0.058-0.062萬(wàn)單位/只/天，萬(wàn)古霉素1.2-1.7mg/只/天，制霉菌素0.72-0.77萬(wàn)單位/只/天。
3.如權(quán)利要求2所述的幽門螺桿菌感染動(dòng)物模型的建立方法，其特征在于:步驟I中，所述的混合抗生素中，慶大霉素0.062萬(wàn)單位/只/天，萬(wàn)古霉素1.7mg/只/天，制霉菌素：0.77萬(wàn)單位/只/天。
4.如權(quán)利要求1所述的幽門螺桿菌感染動(dòng)物模型的建立方法，其特征在于:步驟3中，所述的禁食時(shí)間為12-24小時(shí)。
5.如權(quán)利要求1所述的幽門螺桿菌感染動(dòng)物模型的建立方法，其特征在于:步驟3中，所述的幽門螺桿菌為幽門螺桿菌悉尼菌株SSl (H.pylori Sydney strain SSI, Hp SSI)。
6.如權(quán)利要求1所述的幽門螺桿菌感染動(dòng)物模型的建立方法，其特征在于:步驟3中，所述的幽門螺桿菌菌液為將幽門螺桿菌菌體懸于其液體培養(yǎng)基中形成的菌液；所述的幽門螺桿菌菌液中，所述的液體培養(yǎng)基為BHI。
7.如權(quán)利要求1所述的幽門螺桿菌感染動(dòng)物模型的建立方法，其特征在于:步驟3中，所述的幽門螺桿菌菌液中，其細(xì)菌密度大于1*108cfu/ml，優(yōu)選1*109cfu/ml。
8.如權(quán)利要求1所述的幽門螺桿菌感染動(dòng)物模型的建立方法，其特征在于:步驟3中，所述的幽門螺桿菌菌液灌胃量為0.18-0.22mL/只/次，優(yōu)選0.2mL/只/次。
9.如權(quán)利要求1所述的幽門螺桿菌感染動(dòng)物模型的建立方法，其特征在于:步驟4中，所述的飼養(yǎng)的時(shí)間為兩周。
10.如權(quán)利要求1或9所述的幽門螺桿菌感染動(dòng)物模型的建立方法，其特征在于:所述的飼養(yǎng)在SPF級(jí)環(huán)境中飼養(yǎng)；所述的SPF級(jí)環(huán)境為:溫度22±2°C，，濕度56±5%，I周換2-3次墊料，控制12h光照，12h黑暗；飼料:常規(guī)飼料；自由進(jìn)食、進(jìn)水。
【文檔編號(hào)】A61K31/7048GK103446576SQ201310415511
【公開(kāi)日】2013年12月18日 申請(qǐng)日期:2013年9月12日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月12日
【發(fā)明者】苗君蒞, 郭本恒, 劉振民, 吳正鈞, 于鵬 申請(qǐng)人:光明乳業(yè)股份有限公司