抗鴨肝炎病毒轉(zhuǎn)移因子的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及獸藥領(lǐng)域，更具體的說，是涉及一種抗鴨肝炎病毒轉(zhuǎn)移因子的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]鴨病毒性肝炎簡稱鴨肝炎，是由鴨肝炎病毒引起雛鴨的一種傳播迅速和高度致死性傳染病，是一種肝臟呈現(xiàn)出血炎癥狀態(tài)的急性烈性傳染病。該病的主要特征為肝臟腫大呈斑點(diǎn)狀出血，膽囊腫大，膽汁顏色變淡，有出血斑點(diǎn)和神經(jīng)癥狀。在初次感染疫區(qū)，該病的死亡率很高，可達(dá)90%以上。
[0003]鴨病毒性肝炎主要發(fā)生于4?20日齡雛鴨，中成鴨一般不發(fā)病，雞和鵝也不能自然發(fā)病。該病的主要傳染源是病鴨和帶毒鴨，主要通過消化道和呼吸道感染，飼養(yǎng)管理不良，如缺乏維生素和礦物質(zhì)，鴨舍潮濕、擁擠等，均可促使本病發(fā)生。本病發(fā)生于雛鴨孵化季節(jié)，一旦爆發(fā)，傳播很快，發(fā)病率可達(dá)100%，給養(yǎng)殖業(yè)帶來了很大的經(jīng)濟(jì)損失。
[0004]轉(zhuǎn)移因子(Transferfactor, TF)是T淋巴細(xì)胞釋放的一種能夠轉(zhuǎn)移致敏信息的可透析小分子物質(zhì)-多肽核苷酸復(fù)合物，它能夠特異地將供體的細(xì)胞免疫信息轉(zhuǎn)移給受體正常的淋巴細(xì)胞，從而增強(qiáng)受體的免疫功能，被譽(yù)為T細(xì)胞活性的觸發(fā)劑、細(xì)胞免疫的增強(qiáng)劑、細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)劑及干擾素產(chǎn)生啟動劑。具有傳遞免疫信息、激發(fā)免疫細(xì)胞活性、調(diào)節(jié)免疫功能、增強(qiáng)機(jī)體特異性和非特異性細(xì)胞免疫功能等作用，可以抵抗真菌、病毒等非細(xì)菌性感染。TF含多種成分，分子量小，無熱原，無抗原性，無毒副作用和無種屬差異，是一種新型而又安全的免疫制劑。
[0005]目前轉(zhuǎn)移因子的生產(chǎn)主要是通過半透膜透析得到，一次性生產(chǎn)量少，操作費(fèi)用高，因此需要一種高效、快速、經(jīng)濟(jì)的方法來獲取轉(zhuǎn)移因子，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)移因子的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。除此之外，豬脾臟、胸腺以及淋巴結(jié)組織作為免疫活性細(xì)胞聚集的場所，且是活豬宰殺后的下腳料，成本較低而且材料來源非常廣泛，因此從這類細(xì)胞中提取特異性轉(zhuǎn)移因子，有重要的理論意義和現(xiàn)實(shí)意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，提供一種天然高效純生物活性物質(zhì)抗鴨肝炎病毒轉(zhuǎn)移因子的制備方法。
[0007]本發(fā)明抗鴨肝炎病毒轉(zhuǎn)移因子的制備方法，按照以下步驟進(jìn)行:
[0008](I)制備病毒抗原:將鴨肝炎病毒接種于9-11日齡的雞胚或鴨胚尿囊液中，330C _37°C溫箱孵育，24h內(nèi)死亡的雞胚或鴨胚棄去，120h后收集有明顯痘斑的雞胚或鴨胚絨毛尿囊膜，以磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后，置于組織勻漿機(jī)內(nèi)制成懸液，-20°C—-40°C冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆茫?br>[0009](2)提取病毒抗原:將步驟(I)中得到病毒抗原反復(fù)凍融3-5次后，裝入厚壁小瓶子內(nèi)，超聲15-20min，4°C、5000rpm離心20_30min，棄去沉淀，收集上清液，將上清液經(jīng)4°C、7000rpm離心20_30min,棄去沉淀，收集上清液,經(jīng)4°C、25000rpm離心20_30min,棄去上清液，取沉淀，用等體積PBS溶液溶解。將上述溶液裝入以15 %、30 %、45 %、60 %及80 %的蔗糖制備的不連續(xù)梯度密度離心管，超速離心，4°C、15000-20000rpm離心2-4h，根據(jù)鴨肝炎病毒的分子量確定鴨肝炎病毒所在位置，吸出并置于-20°C—-40°C冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆茫?br>[0010](3)用步驟(2)所得提取的病毒抗原免疫豬:挑選健康免疫豬，取制備的病毒抗原，采用皮下多點(diǎn)免疫方法，注射免疫豬，共免疫3-4次，前兩次分別以完全佛氏佐劑及不完全佛氏佐劑混合抗原，以高速組織勻漿機(jī)打勻，在動物皮內(nèi)或皮下多點(diǎn)注射免疫，第3次和第4次后在動物的肌肉或靜脈注射，每次免疫間隔一周，最后一次免疫7-10天后取動物靜脈血，以免疫熒光方法或ELISA方法檢測上述病毒的特異性抗體效價，出現(xiàn)病毒特異性免疫效價后，宰殺動物，取脾臟和胸腺于冰上，轉(zhuǎn)移至_20°C—-40°C保存，備用；
[0011](4)從免疫豬中提取抗鴨肝炎病毒轉(zhuǎn)移因子:
[0012]①原材料的制備及預(yù)處理:取步驟(3)所得的接種鴨肝炎病毒免疫豬的脾臟、胸腺及淋巴結(jié)組織，用冷三蒸水洗凈豬的脾臟，去除表面筋膜、脂肪等組織，再滅菌生理鹽水反復(fù)沖洗；
[0013]②破碎:將洗干凈的豬脾臟剪碎，加入2倍體積的冷生理鹽水，在冰凍的條件下用高速組織搗碎機(jī)以1000r/min搗碎3次,每次3min,制得勻衆(zhòng)液；
[0014]③凍融:將勻漿液置于_80°C快速冷凍，水浴30°C中融化，交替凍融4-8次，每次融化后均以組織勻漿機(jī)高速勻漿粉碎；
[0015]④提取:加入3倍體積的冷生理鹽水，置于冰凍離心機(jī)于5°C以4000r/min離心30min，取上層血紅色液體，再用G2砂心漏斗過濾，取濾液；
[0016]⑤超濾:將上述濾液用截流值為5000道爾頓的中空纖維超濾膜加壓超濾，濾液為分子量小于5000道爾頓的轉(zhuǎn)移因子；
[0017]⑥除菌:將超濾得到的濾液用孔徑為0.1-0.22um的濾膜加壓過濾除菌；
[0018]⑦分裝:4°C密封保存，即得抗鴨肝炎病毒轉(zhuǎn)移因子提取液成品。
[0019]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)及有益效果是:
[0020]1、原材料來源豐富、無污染、成本低。豬脾臟、胸腺以及淋巴結(jié)組織屬于屠宰后豬的下腳料。
[0021]2、破碎組織后，加入低溫凍融處理的步驟，特別是在37°C以下溶解，不使小分子物質(zhì)活性喪失，并能夠使鴨肝炎病毒轉(zhuǎn)移因子得以充分地提取。
[0022]3、工藝采用了比較先進(jìn)的中空纖維超濾膜超過濾法，從而縮短了制備時間，保證物質(zhì)分離過程中活性不被破壞。
[0023]4、提取物經(jīng)生化測定和若干成分分析，是一種低分子量多肽-核苷酸復(fù)合物，是一種不含蛋自質(zhì)、可溶的小分子物質(zhì)，平均分子量在5000道爾頓以下。經(jīng)體內(nèi)外生物活性試驗(yàn)以及藥理、毒性試驗(yàn)等證明，具有純度高、免疫活性強(qiáng)、起效快而維持時間長、易吸收、無任何不良反應(yīng)等特點(diǎn)，其療效確切，安全可靠，既可治療又可增強(qiáng)抗病能力。該提取物可做成口服液或注射液等劑型，便于應(yīng)用。
[0024]本發(fā)明的抗鴨肝炎病毒轉(zhuǎn)移因子可以有效的抑制鴨肝炎病毒，能保護(hù)正常機(jī)體細(xì)胞免受病毒感染。因此使用本發(fā)明的轉(zhuǎn)移因子可以起到預(yù)防鴨肝炎病毒感染、能夠保護(hù)正常機(jī)體細(xì)胞免受鴨肝炎病毒侵害的作用，從而降低發(fā)病率。同時對于遭到鴨肝炎病毒感染的鴨使用轉(zhuǎn)移因子進(jìn)行治療，可有效的改善臨床癥狀，提高治愈率、降低死亡率。
【具體實(shí)施方式】
[0025]本發(fā)明通過以下實(shí)施例進(jìn)一步詳述。需要說明的是:下述實(shí)施例是說明性的，不是限定性的，不能以下述實(shí)施例來限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0026]實(shí)施例1
[0027]—種抗鴨肝炎病毒轉(zhuǎn)移因子的制備方法，其步驟如下:
[0028](I)制備病毒抗原:將鴨肝炎病毒接種于10日齡的雞胚尿囊液中，37°C溫箱孵育，24h內(nèi)死亡的雞胚棄去，120h后收集有明顯痘斑的雞胚絨毛尿囊膜，以磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后，置于組織勻漿機(jī)內(nèi)制成懸液，-20°C冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆茫?br>[0029](2)提取病毒抗原:將步驟(I)中得到病毒抗原反復(fù)凍融3次后，裝入厚壁小瓶子內(nèi)，超聲20min,4°C、5000rpm離心30min,棄去沉淀，收集上清液,將上清液經(jīng)4°C、7000rpm離心20min,棄去沉淀,收集上清液,經(jīng)4°C、25000rpm離心30min,棄去上清液,取沉淀，用等體積PBS溶液溶解。將上述溶液裝入以15 %、30 %、45 %、60 %及80 %的蔗糖制備的不連續(xù)梯度密度離心管，超速離心，4°C、ISOOOrpm離心4h，根據(jù)鴨肝炎病毒的分子量確定鴨肝炎病毒所在位置，吸出并置于-20°C冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆茫?br>[0030](3)用步驟(2)所得提取的病毒抗原免疫豬:挑選健康免疫豬，取制備的病毒抗原，采用皮下多點(diǎn)免疫方法