本發(fā)明涉及一種多聚磷酸鈣改性IPDI-PCLLA-PEG-PCLLA多孔支架及制備和應(yīng)用，具體是固體部分以聚己內(nèi)酯聚乳酸-聚乙二醇-聚乳酸（PCLLA-PEG-PCLLA）為軟段結(jié)構(gòu)，異佛爾酮二異氰酸酯（IPDI）為硬段結(jié)構(gòu), 體型交聯(lián)后作為生物支架的主要成分。微米級(jí)聚磷酸鈣顆粒作為填充無(wú)機(jī)材料，復(fù)合后的醫(yī)用支架起到促骨生長(zhǎng)，誘導(dǎo)細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的作用。

技術(shù)背景

組織和器官的缺損修復(fù)一直是影響人類(lèi)健康的重大問(wèn)題。長(zhǎng)期以來(lái)，科學(xué)家一直在尋求治療組織缺損的各種方法、手段和材料。再生醫(yī)學(xué)是一門(mén)新興學(xué)科，為組織再生和修復(fù)提供了極有前景的治療理念，其基本思路是人體內(nèi)提取一定數(shù)量的正常細(xì)胞，進(jìn)行體外增殖擴(kuò)增；然后將細(xì)胞種植到生物材料上，使其粘附、增殖、分化；把細(xì)胞和材料的復(fù)合物植入體內(nèi)缺損位置，隨著材料逐漸被降解吸收，細(xì)胞外基質(zhì)不斷分泌和組織不斷形成，重建功能和形態(tài)，達(dá)到組織或器官缺損修復(fù)的目的。

用于制造醫(yī)用修復(fù)的高分子可分為可降解和不可降解型，可降解型材料可以被人體完全降解吸收，不需要二次手術(shù)取出，在發(fā)展進(jìn)程中受到廣泛關(guān)注，其使用能為組織缺損提供基本的力學(xué)和生理功能支持，材料可以通過(guò)降解排除體外，缺損可以完全修復(fù)。水凝膠材料由交聯(lián)包含大量的水卻不溶解于水的高分子組成，是一類(lèi)理想的組織修復(fù)材料，用來(lái)填充組織缺損和微創(chuàng)填充治療。由親水的聚乙二醇（PEG）和疏水的可降解聚酯（PCLLA）組成的三嵌段共聚物（PCLA-PEG-PCLA）在預(yù)防腸粘連和作為注射性組織工程材料方面具有廣泛的用途。由兩親性嵌段聚合物膠束自組裝后形成的凝膠，表面富集大量親水PEG片段，能有效抵抗蛋白和細(xì)胞的粘附。但水凝膠經(jīng)冷凍干燥后的組織支架力學(xué)性能較差，因此加入交聯(lián)性的-NCO-官能團(tuán)物質(zhì)的交聯(lián)劑，增加三嵌段聚合物的力學(xué)強(qiáng)度。

聚磷酸鈣（CPP）是一種可降解的無(wú)機(jī)聚合物，這種聚合物主鏈不是由簡(jiǎn)單的共價(jià)鍵鏈接而成，而是四面體結(jié)構(gòu)的磷酸根離子鏈接，可以利用聚合物特性，通過(guò)改變材料聚合度等參數(shù)對(duì)其性能進(jìn)行改善。近幾年，CPP作為骨支架材料進(jìn)行了深入研究，發(fā)現(xiàn)其力學(xué)強(qiáng)度高，可降解，生物相容型號(hào)，植入后促進(jìn)骨修復(fù)

本發(fā)明結(jié)合PCLLA-PEG-PCLLA材料和CPP材料，加入異氰酸酯類(lèi)交聯(lián)劑，支架固化后將CPP粒子材料固定于支架內(nèi)部，形成的含有復(fù)合CPP微米顆粒的支架結(jié)構(gòu)，其力學(xué)強(qiáng)度保證支架在植入過(guò)程中的結(jié)構(gòu)性能，同時(shí)其組成成份隨著殼層的逐步降解得到緩慢釋放和降解，進(jìn)而安全地代謝出體外。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種多聚磷酸鈣改性IPDI-PCLLA-PEG-PCLLA多孔支架及制備和應(yīng)用。固相方法制備聚磷酸鈣微米顆粒，通過(guò)球磨、篩分方法控制粒徑。在將PCLLA-PEG-PCLLA和異佛爾酮異氰酸酯（IPDI）交聯(lián)，增強(qiáng)了原水凝膠支架的力學(xué)強(qiáng)度，CPP的支架內(nèi)填充，增加促骨生長(zhǎng)效果，促進(jìn)細(xì)胞分化。

本發(fā)明的目的通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)：

一種多聚磷酸鈣改性IPDI-PCLLA-PEG-PCLLA多孔支架的制備方法，其特征在于，包含以下步驟：

（1）聚磷酸鈣（CPP）的制備：

磷酸二氫鈣500攝氏度下經(jīng)煅燒后從馬弗爐中取出，經(jīng)淬火后得到CPP的非晶燒料，待干燥后CPP粉料粉末，取用300~400目產(chǎn)物；

（2）交聯(lián)支架材料的制備：

將聚己內(nèi)酯聚乳酸-聚乙二醇-聚乳酸聚己內(nèi)酯（PCLLA-PEG-PCLLA）在惰性的環(huán)境中與異氰酸酯（IPDI）反應(yīng)，將所得交聯(lián)后的物質(zhì)與超純水以質(zhì)量比1:1進(jìn)行混合，超聲25分鐘，磁力攪拌過(guò)夜，隔夜靜置后，將放入-20攝氏度冰箱中冷凍，冷凍干燥得到粉末支架；

（3）CPP/聚合物交聯(lián)行支架的制備：

將PCLLA-PEG-PCLLA在惰性的環(huán)境中與IPDI反應(yīng)，將所得交聯(lián)后的物質(zhì)與超純水以質(zhì)量比1:1進(jìn)行混合，加入CPP顆粒后，磁力攪拌過(guò)夜，隔夜靜置后，將放入-20攝氏度冰箱中冷凍，冷凍干燥得到支架。

步驟（2）IPDI與PCLLA-PEG-PCLLA的質(zhì)量比為1:500~1:5000；配制方式為室溫溶解或60℃以下加熱助溶，還可以輔以機(jī)械攪拌或磁力攪拌。

步驟（3）所述的CPP的顆粒大小為2~5um，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0%~50%。

一種多聚磷酸鈣改性IPDI-PCLLA-PEG-PCLLA多孔支架，其特征在于，根據(jù)上述任一所述方法制備得到。

一種多聚磷酸鈣改性IPDI-PCLLA-PEG-PCLLA多孔支架的應(yīng)用。

（1）CPP的制備：

稱(chēng)取200g磷酸二氫鈣放入200ml坩堝中，500攝氏度下保溫4個(gè)小時(shí)，經(jīng)煅燒后從馬弗爐中取出，將其直接倒在碎冰上快速冷卻，經(jīng)淬火后得到CPP的非晶燒料，用乙醇干燥，在真空干燥箱中備用，待干燥后CPP粉料粉末，取300~400目產(chǎn)物，用無(wú)水乙醇分散后球磨，所得分散液密閉保存待用。形貌如圖1所示。

（2）交聯(lián)支架材料的制備

將PCLLA-PEG-PCLLA原料加熱后，在惰性的環(huán)境中與IPDI反應(yīng)，磁力攪拌，并保持反應(yīng)溫度為50攝氏度，過(guò)夜靜止。將所得交聯(lián)后的物質(zhì)與超純水以質(zhì)量比1:1進(jìn)行混合，超聲25分鐘，磁力攪拌過(guò)夜。隔夜靜置后，將放入-20攝氏度冰箱中冷凍，然后置于冷凍干燥機(jī)中將水分抽離，冷凍干燥得到粉末支架，形貌如圖2所示。

（3）CPP/聚合物交聯(lián)行支架的制備。

將PCLLA-PEG-PCLLA原料加熱后，在惰性的環(huán)境中與IPDI反應(yīng)，磁力攪拌，并保持反應(yīng)溫度為50攝氏度，過(guò)夜靜止。將所得交聯(lián)后的物質(zhì)與超純水以質(zhì)量比1:1進(jìn)行混合，超聲25分鐘，加入CPP顆粒后，磁力攪拌過(guò)夜。隔夜靜置后，將放入-20攝氏度冰箱中冷凍，然后置于冷凍干燥機(jī)中將水分抽離，冷凍干燥得到支架，形貌如圖3所示。

本發(fā)明包括以下步驟：

1. 配制PCLLA-PEG-PCLLA的聚合物，具體成分為PCLLA55/45 1700-PEG2000-PCLLA55/45。

2. 按照IPDI加入到PCLLA-PEG-PCLLA中的比例為1000:1 500:1 200:1，配制成為交聯(lián)型聚合物凝膠。

3. 按照CPP與上述聚合物凝膠的質(zhì)量比為0%，10%，30%，50%。

4. 若支架長(zhǎng)期不用，將其密閉保存于4 ℃環(huán)境。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：

1. 制備方法簡(jiǎn)便，所用原料簡(jiǎn)單，適于大量生產(chǎn)。

2. 所研制的載藥新配方改善了PCLLA-PEG-PCLLA材料的力學(xué)性能，通過(guò)加入IPDI等含有-NCO-基團(tuán)交聯(lián)劑，生成具有體型交聯(lián)的聚合物，其中包含有硬段和軟段成分，有效的提高了力學(xué)性能。CPP顆粒的填入水凝膠后具有增強(qiáng)。

附圖說(shuō)明

圖1為實(shí)施例1、2、3、4中CPP材料的SEM照片。

圖2為實(shí)施例1中制備的多孔支架材料的SEM照片。

圖3為實(shí)施例1中制備的多孔CPP/支架材料的SEM照片。

圖4為實(shí)施例1、2、3、4固化的支架力學(xué)的應(yīng)變應(yīng)力曲線(xiàn)。

圖5為實(shí)施例1、2、3、4中細(xì)胞生存率曲線(xiàn)。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例以發(fā)明技術(shù)方案為前提進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過(guò)程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不限于下述的實(shí)施例。

實(shí)施例1 ：

稱(chēng)取200g磷酸二氫鈣放入200ml坩堝中，500攝氏度下保溫4個(gè)小時(shí)，經(jīng)煅燒后從馬弗爐中取出，將其直接倒在碎冰上快速冷卻，經(jīng)淬火后得到CPP的非晶燒料，用乙醇干燥，在真空干燥箱中備用，待干燥后CPP粉料粉末，取300~400目產(chǎn)物，用無(wú)水乙醇分散后球磨，所得分散液密閉保存待用。

將PCLLA-PEG-PCLLA原料加熱后，在惰性的環(huán)境中與IPDI反應(yīng), 比例為500:1，磁力攪拌，并保持反應(yīng)溫度為50攝氏度，過(guò)夜靜止。將所得交聯(lián)后的物質(zhì)與超純水以質(zhì)量比1:1進(jìn)行混合，超聲25分鐘，磁力攪拌過(guò)夜。隔夜靜置后，將放入-20攝氏度冰箱中冷凍，然后置于冷凍干燥機(jī)中將水分抽離，冷凍干燥得到粉末支架。

實(shí)施例2：

稱(chēng)取200g磷酸二氫鈣放入200ml坩堝中，500攝氏度下保溫4個(gè)小時(shí)，經(jīng)煅燒后從馬弗爐中取出，將其直接倒在碎冰上快速冷卻，經(jīng)淬火后得到CPP的非晶燒料，用乙醇干燥，在真空干燥箱中備用，待干燥后CPP粉料粉末，取300~400目產(chǎn)物，用無(wú)水乙醇分散后球磨，所得分散液密閉保存待用。

將PCLLA-PEG-PCLLA原料加熱后，在惰性的環(huán)境中與IPDI反應(yīng), 比例為500:1，磁力攪拌，并保持反應(yīng)溫度為50攝氏度，加入CPP顆粒后（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%），攪拌過(guò)夜。將所得交聯(lián)后的物質(zhì)與超純水以質(zhì)量比1:1進(jìn)行混合，超聲25分鐘，磁力攪拌過(guò)夜。隔夜靜置后，將放入-20攝氏度冰箱中冷凍，然后置于冷凍干燥機(jī)中將水分抽離，冷凍干燥得到粉末支架。

實(shí)施例3 ：

稱(chēng)取200g磷酸二氫鈣放入200ml坩堝中，500攝氏度下保溫4個(gè)小時(shí)，經(jīng)煅燒后從馬弗爐中取出，將其直接倒在碎冰上快速冷卻，經(jīng)淬火后得到CPP的非晶燒料，用乙醇干燥，在真空干燥箱中備用，待干燥后CPP粉料粉末，取300~400目產(chǎn)物，用無(wú)水乙醇分散后球磨，所得分散液密閉保存待用。

將PCLLA-PEG-PCLLA原料加熱后，在惰性的環(huán)境中與IPDI反應(yīng), 比例為500:1，磁力攪拌，并保持反應(yīng)溫度為50攝氏度，加入CPP顆粒后（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%），攪拌過(guò)夜。將所得交聯(lián)后的物質(zhì)與超純水以質(zhì)量比1:1進(jìn)行混合，超聲25分鐘，磁力攪拌過(guò)夜。隔夜靜置后，將放入-20攝氏度冰箱中冷凍，然后置于冷凍干燥機(jī)中將水分抽離，冷凍干燥得到粉末支架。

實(shí)施例4 ：

稱(chēng)取200g磷酸二氫鈣放入200ml坩堝中，500攝氏度下保溫4個(gè)小時(shí)，經(jīng)煅燒后從馬弗爐中取出，將其直接倒在碎冰上快速冷卻，經(jīng)淬火后得到CPP的非晶燒料，用乙醇干燥，在真空干燥箱中備用，待干燥后CPP粉料粉末，取300~400目產(chǎn)物，用無(wú)水乙醇分散后球磨，所得分散液密閉保存待用。

將PCLLA-PEG-PCLLA原料加熱后，在惰性的環(huán)境中與IPDI反應(yīng), 比例為500:1，磁力攪拌，并保持反應(yīng)溫度為50攝氏度，加入CPP顆粒后（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%），攪拌過(guò)夜。將所得交聯(lián)后的物質(zhì)與超純水以質(zhì)量比1:1進(jìn)行混合，超聲25分鐘，磁力攪拌過(guò)夜。隔夜靜置后，將放入零下20攝氏度冰箱中冷凍，然后置于冷凍干燥機(jī)中將水分抽離，冷凍干燥得到粉末支架。

所制備得到的固化后支架到形貌如圖2,3 所示，支架固化后，由于冷凍干燥效果產(chǎn)生的孔洞尺寸在200-400um，聚合物結(jié)構(gòu)互相交織，具有一定的力學(xué)強(qiáng)度；將CPP復(fù)合填充進(jìn)將PCLLA-PEG-PCLLA后，由形貌可知，PCLLA-PEG-PCLLA聚合物粘附于CPP粒子上，CPP粒子堆疊，其中孔的大小為200um。

將實(shí)施例1-4中的支架材料做成1cm x 1cm x 1cm的塊狀材料，分別放置于萬(wàn)能力學(xué)試驗(yàn)機(jī)中進(jìn)行壓縮模量的測(cè)量，繪制模量曲線(xiàn)，如圖4所示。實(shí)施例1中，PCLLA-PEG-PCLLA和IPDI交聯(lián)后，壓縮模量為47.6Kpa；實(shí)施例2填充了10%的CPP后，壓縮模量為78.7Kpa；實(shí)施例3中，填充了30%的CPP后，壓縮模量為85.9Kpa；實(shí)施例4中，填充了30%的CPP后，壓縮模量為95.4Kpa。

將實(shí)施例4中的固化后的骨水泥骨架放入含有MC3T3細(xì)胞的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)24、48和72小時(shí)后對(duì)比細(xì)胞生存率對(duì)比，結(jié)果如圖4所示。支架材料中細(xì)胞生存率維持在100%以上充分說(shuō)明了支架材料具有良好的生物相容性。