本發(fā)明屬于藥物研究開發(fā)領(lǐng)域，具體涉及胡黃連苷II治療缺血性腦卒中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：
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腦卒中(cerebral stroke)是一種常見的腦血管突發(fā)事件，包括缺血性和出血性卒中。我國每年新增腦卒中患者150萬-180萬，腦血管病已居三大死因之首，具有發(fā)病率高、死亡率高、致殘率高、復發(fā)率高的特點。腦卒中是指因各種誘發(fā)因素引起腦內(nèi)動脈狹窄，閉塞或破裂，而造成急性腦血液循環(huán)障礙，臨床上表現(xiàn)為一過性或永久性腦功能障礙的癥狀和體征，急性缺血性腦卒中是最常見的腦卒中類型，約占全部腦卒中的60％-80％。缺血性腦卒中系動脈供血突然中斷，導致腦組織缺血缺氧、進而壞死、軟化，多數(shù)情況下，血栓形成是缺血性卒中發(fā)生的主要原因，迅速溶栓復流是腦缺血急性期治療成功的前提和基礎(chǔ)。但溶栓治療血流恢復的同時，腦血流再灌注激發(fā)產(chǎn)生了了過剩的活性氧(ROS)，ROS導致蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA的過氧化，誘導細胞生長增殖停滯，細胞凋亡和壞死，從而形成腦出血和腦水腫，增加死亡率和致殘率。因此，開發(fā)一種能夠抵抗再灌注產(chǎn)生的ROS、減輕溶栓治療后引起的腦組織損傷的藥物或功能制品具有重要意義。目前治療腦缺血性卒中所致的腦損傷藥物，根據(jù)《中國急性缺血性腦卒中診治指南》推薦，且國內(nèi)使用具有較好療效的藥物僅有依達拉奉一種，但其臨床有效率僅有55％，比安慰劑高出約21.8％。因而，研發(fā)一種新型高效的針對腦缺血再灌注致腦損傷的藥物具有重要的經(jīng)濟和社會效益。

胡黃連苷II(Picroside II)是從我國傳統(tǒng)中藥胡黃連的根莖中提取出來的一種環(huán)烯醚萜苷，分子量為512，能夠通過血腦屏障，其結(jié)構(gòu)中含有鄰苯二酚基結(jié)構(gòu)，類似抗壞血酸，可通過還原反應(yīng)直接清除氧自由基，主要通過抗氧化、抗炎、抗凋亡發(fā)揮神經(jīng)保護作用?，F(xiàn)階段，國內(nèi)外學者已經(jīng)報道了一些關(guān)于胡黃連苷II在防治過敏性炎性疾病應(yīng)用方面的專利(CN012125544.X)，以及胡黃連苷II在治療乙型肝炎方面的專利(CN200410098646.4)，但是目前還沒有關(guān)于胡黃連苷II在治療缺血性腦卒中所致腦損傷中的專利報道。因此，涉及一類胡黃連苷II治療缺血性腦卒中的應(yīng)用，對缺血性腦卒中導致的腦損傷具有神經(jīng)保護作用和較好的治療作用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
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本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺點，針對現(xiàn)有技術(shù)中還未有針對缺血性腦卒中致神經(jīng)功能障礙的有效藥物，尋求設(shè)計胡黃連苷II治療缺血性腦卒中的應(yīng)用，所述胡黃連苷II對缺血性腦卒中導致的腦損傷具有神經(jīng)保護作用，且能夠通過有效抑制Rac1(retrovirus-associated DNA sequences，逆轉(zhuǎn)錄病毒相關(guān)DNA序列)/Nox2(Non-phagocytic cell oxidase 2，非吞噬細胞氧化酶)/ROS(reactive oxygen species，反應(yīng)性氧或活性氧)/ROCK(Rho-associated coiled-coil forming protein setine/threonine kinase，Rho激酶)/Claudin5(閉合蛋白5)信號通路來改善缺血性腦卒中導致的神經(jīng)功能障礙。

為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案予以實現(xiàn)：

選用Wistar大鼠為實驗對象，其體重230-250g，為SPF(無特定病原體)級，選用市售胡黃連苷II產(chǎn)品，應(yīng)用線栓法經(jīng)左側(cè)頸外-頸內(nèi)動脈插線建立大腦中動脈栓塞(MCAO)模型，將實驗用大鼠分為假手術(shù)組、模型組、胡黃連苷II組、夾竹桃麻素組和胡黃連苷II+夾竹桃麻素組，應(yīng)用改良神經(jīng)功能缺損評分(mNSS)評價胡黃連苷II對腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)行為功能的影響，mNSS包括動力學測試、感官測試和反射測試，總分18分，評分數(shù)越高，表示神經(jīng)功能缺損越嚴重。各組大鼠均在手術(shù)前后、治療前后進行評分，證明胡黃連苷II對腦缺血再灌注大鼠的神經(jīng)功能均有保護作用。

進一步地，選用市售胡黃連苷II產(chǎn)品，以體重為230-250g的SPF級Wistar大鼠為實驗對象，建立大鼠MCAO模型，將實驗用大鼠分為正常組、模型組、胡黃連苷II組、夾竹桃麻素組和胡黃連苷II+夾竹桃麻素組，應(yīng)用TTC(2,3,5-氯化三苯基四氮唑)染色實驗觀察胡黃連苷II對MCAO大鼠腦梗死體積的影響，證明胡黃連苷II能夠減小MCAO大鼠的腦梗死體積。

進一步地，選用市售胡黃連苷II產(chǎn)品，以體重為230-250g的SPF級Wistar大鼠為實驗對象，將實驗用大鼠分為正常組、模型組、胡黃連苷II組、夾竹桃麻素組和胡黃連苷II+夾竹桃麻素組，研究胡黃連苷II對腦缺血再灌注大鼠血腦屏障的影響，證明胡黃連苷II能夠減輕腦水腫，減少EB滲漏，能減輕血腦屏障的開放程度和通透性。

進一步地，選用市售胡黃連苷II產(chǎn)品，以體重為230-250g的SPF級Wistar大鼠為實驗對象，建立大鼠MCAO模型，檢測胡黃連苷II對腦缺血再灌注大鼠腦組織形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)的影響，證明胡黃連苷II能夠顯著減輕腦缺血再灌注引起的大腦皮質(zhì)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)損傷。

進一步地，選用市售胡黃連苷II產(chǎn)品，以體重為230-250g的SPF級Wistar大鼠為實驗對象，建立MCAO動物模型，檢測胡黃連苷II對腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)細胞Rac1/Nox2/ROS/ROCK/Claudin5信號通路活化水平的影響，證明胡黃連苷II具有顯著的抗氧化、保護血腦屏障作用，且能夠通過調(diào)控Rac1/Nox2/ROS/ROCK/Claudin5信號通路而減小腦梗死體積，改善神經(jīng)元的形態(tài)結(jié)構(gòu)和動物的神經(jīng)行為功能，顯示胡黃連苷II對缺血性腦卒中所致腦損傷具有較好的治療作用。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，利用MCAO大鼠模型，選取胡黃連苷II為研究對象，在體內(nèi)水平上揭示其抑制缺血性腦卒中導致的大腦皮層神經(jīng)元損傷，改善神經(jīng)行為功能障礙的作用，證實了胡黃連苷II對腦缺血再灌注大鼠的神經(jīng)功能有保護作用，能夠減小MCAO大鼠的腦梗死體積，減輕腦水腫，減少EB滲漏，能減輕血腦屏障的開放程度和通透性，能夠顯著減輕腦缺血再灌注引起的大腦皮質(zhì)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)損傷，具有顯著的抗氧化作用，對缺血性腦卒中導致腦損傷具有保護作用，且可通過調(diào)控Rac1/Nox2/ROS/ROCK/Claudin5信號通路，改善腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)功能障礙，減輕血腦屏障的損傷，該試劑應(yīng)用環(huán)境良好，治療效果極佳，具有開發(fā)成為治療缺血性腦卒中新型藥物的廣闊前景。

附圖說明：

圖1為本發(fā)明涉及的實驗中腦缺血再灌注大鼠大腦切片TTC染色結(jié)果圖。

圖2為本發(fā)明涉及的實驗中腦缺血再灌注大鼠大腦整體和切片EB滲漏結(jié)果圖。

圖3為本發(fā)明涉及的實驗中腦缺血再灌注大鼠大腦皮質(zhì)區(qū)血管的血腦屏障對于硝酸鑭的滲透程度(10000×)圖。

圖4為本發(fā)明涉及的實驗中腦缺血再灌注大鼠大腦皮質(zhì)HE染色結(jié)果(400×)圖。

圖5為本發(fā)明涉及的實中腦缺血再灌注大鼠大腦皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)圖(5000×；20000×)。

圖6和圖7為本發(fā)明涉及的實驗中腦缺血再灌注大鼠大腦皮質(zhì)區(qū)Rac1/Nox2/ROS/ROCK/Claudin5信號通路各蛋白的表達情況圖。

具體實施方式：

下面結(jié)合附圖并通過實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明。

下述實施例選用市售胡黃連苷II產(chǎn)品，以體重為230-250g的SPF級Wistar大鼠為實驗對象，通過國際公認的方法來對胡黃連苷II治療缺血性腦卒中導致的腦組織損傷的神經(jīng)保護作用以及改善神經(jīng)功能障礙的作用進行評價。

實施例1：

應(yīng)用mNSS法評價胡黃連苷II對腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)行為功能的影響，具體步驟如下：

步驟一：應(yīng)用線栓法經(jīng)左側(cè)頸外-頸內(nèi)動脈插線建立大腦中動脈栓塞(MCAO)模型。將激光多普勒血流檢測儀(PE-5001，Swedan)探頭經(jīng)骨孔固定在硬腦膜上，記錄左側(cè)大腦中動脈供血區(qū)的血流變化，待血流趨于平穩(wěn)時，經(jīng)左側(cè)頸外-頸內(nèi)動脈插線，缺血2h后拔出線栓實現(xiàn)血流再灌注，以插入線栓后局部腦血流量(rCBF)峰值降到插線前的30％及以下，拔出線栓后rCBF恢復至插線前的80％及以上，且改良神經(jīng)功能缺損評分(mNSS)7-12分作為動物模型成功的標準，未達此指標的動物則被剔除，剩余成功模型備用；

步驟二：模型制備成功后，將模型制作如下分組：

(1)模型組：應(yīng)用線栓法建立MCAO模型，缺血2h后拔出線栓實現(xiàn)再灌注22h；

(2)假手術(shù)組：經(jīng)左側(cè)頸外-頸內(nèi)動脈插入線栓1cm，但不進入顱內(nèi)，2h后拔出線栓，其余步驟同模型組；

(3)治療組：胡黃連苷II(Picroside II，CAS No.39012-20-9，分子式：C23H28O13，分子量512，天津奎青有限公司)生理鹽水配制成體積比1％的溶液，以20mg/kg在缺血后2h腹腔注射；

(4)陽性對照組：煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶抑制劑夾竹桃麻素(Apocynin,CAS No.498-02-2,分子式：C9H10O3，分子量166，Sigma-Aldrich)用生理鹽水配制成體積比為2.5％的溶液，以50mg/kg在缺血后2h腹腔注射；

(5)治療+陽性對照組：缺血后2h給予胡黃連苷II 20mg/kg、夾竹桃麻素50mg/kg，腹腔注射；

應(yīng)用mNSS法檢測評價MCAO大鼠的神經(jīng)行為功能，mNSS包括運動(肌肉狀態(tài)和異常運動)、感覺(觸覺、本體感覺和視覺)和反射測試，總分18分，評分數(shù)越高，表示神經(jīng)功能缺損越嚴重，各組大鼠均在手術(shù)前后、治療前后進行評分；mNSS評分結(jié)果如表1所示：

表1大鼠mNSS評分的比較(n＝5)

表1顯示：假手術(shù)組mNSS評分為零，無神經(jīng)功能障礙；模型組大鼠神經(jīng)功能缺失，其mNSS評分明顯高于假手術(shù)組(P＜0.001)；MCAO大鼠經(jīng)胡黃連苷II或夾竹桃麻素治療后，mNSS評分較治療前及模型組均明顯下降(P＜0.05)；胡黃連苷II+夾竹桃麻素組mNSS評分顯著低于模型組(P＜0.05)，且低于胡黃連苷II或夾竹桃麻素單獨作用組(P＜0.05)，這表明胡黃連苷II對腦缺血再灌注大鼠的神經(jīng)功能均有保護作用，且兩藥聯(lián)合的保護效果更明顯。

表中所述P是顯著性概率,P>0.05表示對比組之間無顯著性差異；0.01<P<0.05表示對比組之間的差異具有顯著性意義，P<0.01時,表示對比組之間的差異具有非常顯著性意義。

實施例2：

TTC染色檢測胡黃連苷II對腦缺血再灌注大鼠腦梗死體積的影響，具體步驟如下：

應(yīng)用TTC(2,3,5-氯化三苯基四氮唑)染色觀察胡黃連苷II對MCAO大鼠腦梗死體積的影響。TTC本身可作為一種氧化還原指示劑，活細胞內(nèi)的脫氫酶(尤其是線粒體內(nèi)的琥珀酸脫氫酶)可以將TTC還原為紅色甲臢化合物TPF(1,3,5-triphenylformazan)，缺血梗塞組織因組織壞死脫氫酶活力喪失呈現(xiàn)蒼白色，而正常組織呈深紅色。大鼠腦缺血再灌注22h后，應(yīng)用10％體積濃度的水合氯醛深度麻醉，取5片2mm厚的腦冠狀位切片，切片浸泡在2％體積濃度的TTC磷酸鹽緩沖液中，在37℃溫箱中避光孵育10min。TTC染色結(jié)果如圖1所示，假手術(shù)組大鼠腦組織呈均勻的紅色，未見明顯梗死灶；模型組大鼠可見大片白色梗死灶，白色梗死灶體積比例為34.75±4.23％，梗死范圍涉及皮質(zhì)、紋狀體及海馬；胡黃連苷II組、夾竹桃麻素組、胡黃連苷II+夾竹桃麻素組的大鼠腦梗死體積均比模型組明顯縮小(P<0.05)，胡黃連苷II組的大鼠腦梗死體積為14.12±1.73％，夾竹桃麻素組的大鼠腦梗死體積為13.68±1.38％，胡黃連苷II+夾竹桃麻素組的大鼠腦梗死體積為4.57±0.62％；并且胡黃連苷II+夾竹桃麻素組腦梗死體積較治療組明顯縮小(P<0.05)；胡黃連苷II組與夾竹桃麻素組之間無顯著性差異(P>0.05)；這表明胡黃連苷II單獨或聯(lián)合夾竹桃麻素均能夠減小MCAO大鼠的腦梗死體積。

實施例3：

測試胡黃連苷II對腦缺血再灌注大鼠血腦屏障(BBB)的影響，具體步驟如下：

(1)測試腦水含量評價胡黃連苷II對腦缺血再灌注大鼠腦水腫程度的影響：

建立大鼠MCAO模型，腦缺血再灌注22h后，快速斷頭取腦，沿矢狀縫將左右半球分開，取左半球，濾紙吸去表面水分，稱濕重后置110℃烤箱中烘烤24h至恒重，取出立即稱干重，計算腦含水量：(濕重-干重)/濕重*100％，腦含水量結(jié)果如表2所示，模型組大鼠腦含水量顯著高于假手術(shù)組(P<0.05)，而胡黃連苷II組、夾竹桃麻素組含水量明顯低于模型組(P<0.05)，胡黃連苷II+夾竹桃麻素組腦含水量亦明顯低于模型組(P<0.05)，略低于胡黃連苷II組，但無顯著性差異(P>0.05)；

表2大鼠的腦水含量

(2)伊文思藍滲漏實驗評價胡黃連苷II對MCAO大鼠BBB開放程度的影響：

應(yīng)用線栓法建立大鼠MCAO模型，通過伊文思藍(Evans Blue,EB,CAS:314-13-16,Sigma-Aldrich)外滲率測定BBB的通透性。每組取5只大鼠，再灌注開始前2h，經(jīng)股靜脈注射體積比為2％的EB，4ml/kg，再灌注22h后，通過水合氯醛腹腔注射麻醉，經(jīng)心臟灌注，取損傷側(cè)平面5mm厚腦組織，電子天平稱重(濕重)；再加2ml三氯乙酸(體積比50％)在37℃孵育3d；再充分研磨，在半徑15cm的離心機上以14000r/min離心20min；取1ml上清，在上清中加入3ml無水乙醇，使用酶標儀(Bio-Rad680，USA，激發(fā)波長620nm，發(fā)射波長680nm)檢測熒光強度，按照標準曲線計算EB滲透量，結(jié)果以μg/g腦組織表示。將損傷側(cè)腦組織EB滲透量與對側(cè)腦組織EB滲透量相比，計算EB滲透率；

EB實驗結(jié)果如圖2所示，假手術(shù)組幾乎無滲出；模型組在非缺血側(cè)BBB通透性沒有改變，缺血側(cè)EB滲漏率較非缺血側(cè)顯著增加(P<0.05)；胡黃連苷II治療組在缺血側(cè)EB滲出率較模型組顯著降低(P<0.05)；如圖2所示，模型組腦組織切片可清楚看到EB滲漏；EB滲漏主要見于缺血側(cè)，非缺血側(cè)腦組織未見明顯EB外滲；胡黃連苷II能顯著降低缺血側(cè)腦組織EB滲出；胡黃連苷II+夾竹桃麻素組滲出略低于胡黃連苷II組，但無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

(3)通過硝酸鑭滲漏實驗，觀察BBB的超微結(jié)構(gòu)變化，從而評價胡黃連苷II對MCAO大鼠BBB開放程度和通透性的影響

硝酸鑭是一種高密度重金屬，分子量433U，直徑4nm，其溶液在pH值堿性時形成氫氧化鑭，正常情況下不能通過完整的BBB進入細胞間質(zhì)內(nèi)，腦受損傷后致BBB開放，使得鑭顆粒通過BBB而沉積在血管外。采用硝酸鑭示蹤法不僅可研究腦損傷所致BBB通透性改變，還同時直接觀察到BBB超微結(jié)構(gòu)改變。本實驗應(yīng)用線栓法建立MCAO模型，給藥22h后，每組取5只大鼠，腹腔注射10％水合氯醛麻醉，頸部切口分離左側(cè)頸外靜脈，注入0.5ml 2％硝酸鑭-生理鹽水，循環(huán)、鑭醛固定液，灌流固定，隨即迅速開顱取全腦，自視交叉向后冠狀切成約1mm厚腦片，分別于缺血側(cè)及缺血對側(cè)相應(yīng)部位皮質(zhì)及底節(jié)區(qū)各取2小塊尺寸為1.0mm×1.0mm×1.0mm的腦組織，經(jīng)固定、切片、干燥后，電鏡觀察BBB超微結(jié)構(gòu)，血管對硝酸鑭通透程度的判斷：1.La3+沉積于血管管腔面，管腔外無La3+為(-)，不通透；2.La3+出現(xiàn)在局部基底膜，為(+)；La3+出現(xiàn)在廣泛基底膜為(++)；La3+出現(xiàn)在局血管周圍腦間質(zhì)裂隙內(nèi)為(+++)，(+)、(++)、(+++)為通透程度逐漸加重；

結(jié)果顯示，假手術(shù)組鑭顆粒只分布在毛細血管管腔內(nèi)，附著在管腔內(nèi)壁的表面，毛細血管外組織間隙未見鑭顆粒沉積，BBB結(jié)構(gòu)未見明顯異常為(-)，如圖3A所示；腦缺血再灌注22h后，管腔內(nèi)鑭顆粒呈線性沉積于內(nèi)皮細胞緊密連接處，部分緊密連接開放，鑭顆粒從管腔內(nèi)漏出，進入組織間隙為(+++)，如圖3B所示，表明BBB通透性明顯增加，屏障功能遭破壞；經(jīng)胡黃連苷II治療后，毛細血管內(nèi)鑭顆粒在管腔內(nèi)細胞間緊密連接處沉積，緊密連接結(jié)構(gòu)尚完整，血管外腦組織間隙未見明顯鑭顆粒沉積為(++)，如圖3C所示；經(jīng)陽性對照藥物夾竹桃麻素治療后，管腔內(nèi)亦可見明顯的鑭顆粒沉積，管腔外腦組織間隙未見明顯鑭顆粒沉積為(++)，如圖3D所示；模型組大鼠經(jīng)胡黃連苷II+夾竹桃麻素治療后，腦組織內(nèi)血管間隙未見鑭顆粒沉積，BBB結(jié)構(gòu)未見破壞，管腔內(nèi)見鑭顆粒沉積為(+)如圖3E所示；

綜上所述，mNSS評分、TTC染色實驗結(jié)果均表明，胡黃連苷II能夠顯著改善MCAO模型大鼠的神經(jīng)行為學功能，減少梗死面積；胡黃連苷II聯(lián)合夾竹桃麻素能夠進一步改善神經(jīng)行為學功能，進一步減少梗死面積，兩者有一定的協(xié)同作用；腦含水量測定結(jié)果及伊文思藍滲漏實驗結(jié)果均表明，胡黃連苷II能夠減輕腦水腫，減少EB滲漏；硝酸鑭滲漏實驗結(jié)果也表明，胡黃連苷II確能減輕BBB的開放程度和通透性，與夾竹桃麻素聯(lián)用較單獨使用胡黃連苷II效果更好。

實施例4：

觀察胡黃連苷II對腦缺血再灌注大鼠腦組織形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)的影響，具體步驟如下：

(1)采用蘇木精伊紅(HE)染色評價胡黃連苷II對大腦皮質(zhì)損傷的影響：

采用線栓法建立大鼠MCAO模型，造模結(jié)束并應(yīng)用胡黃連苷II和夾竹桃麻素治療22h后，水合氯醛腹腔注射麻醉，經(jīng)心臟灌注生理鹽水200ml和體積濃度比為4％的多聚甲醛200ml，開顱取腦后經(jīng)多聚甲醛固定2h，再將大鼠腦用雙蒸水浸泡4h，最后將大鼠腦采用常規(guī)脫水、透明、包埋處理，處理后對大鼠腦連續(xù)冠狀切片、貼片，所述切片厚度為5μm，對切片進行HE染色，光鏡下觀察HE染色切片，其神經(jīng)細胞核呈嗜堿性藍色，細胞質(zhì)呈不同程度的紫紅色，在400倍顯微鏡下，每張切片隨機觀察皮質(zhì)區(qū)4個不重疊的視野計數(shù)細胞，取其均值，神經(jīng)元損傷程度以變性細胞指數(shù)(DCI＝變性細胞總數(shù)/細胞總數(shù))表示。

HE染色結(jié)果如圖4所示，假手術(shù)組大鼠腦組織皮質(zhì)區(qū)，神經(jīng)元分布均勻，排列整齊，輪廓清晰，結(jié)構(gòu)完整，著色均勻；模型組皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)元排列紊亂，細胞核固縮、著色加深，變性壞死后形成大量空泡，變性細胞指數(shù)DCI為0.66±0.06，比假手術(shù)組的變性細胞指數(shù)DCI為0.14±0.02顯著升高(P<0.01)；胡黃連苷II組、夾竹桃麻素組、胡黃連苷II+夾竹桃麻素組大鼠神經(jīng)元分布較均勻，排列較規(guī)整，輪廓尚清晰，結(jié)構(gòu)較完整，著色均勻，胡黃連苷II組、夾竹桃麻素組、胡黃連苷II+夾竹桃麻素組的變性細胞指數(shù)DCI分別為0.30±0.04，0.32±0.03，0.21±0.03，較模型組顯著降低(P<0.01)，胡黃連苷II+夾竹桃麻素組DCI值較模型組降低更為顯著(P<0.05)。

(2)通過透射電鏡觀察評價胡黃連苷II對腦組織神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)的影響：

采用線栓法制備大鼠MCAO模型，模型制備結(jié)束并應(yīng)用胡黃連苷II和夾竹桃麻素治療22h后，開顱取腦，從缺血皮質(zhì)區(qū)取1mm³的腦組織，采用體積比為2.5％的戊二醛與體積比為1％的四氧化鋨雙重固定，丙酮梯度脫水，環(huán)氧樹脂Epon812包埋、修塊，進行超薄切片，切片厚度為50nm，將超薄切片置于聚乙烯醇縮甲醛膜(Formvar膜)載網(wǎng)，應(yīng)用體積比為3％醋酸鈾飽和酒精溶液(pH＝3.5)染色30min，然后雙蒸水洗滌3次，每次10min，吸干水分后再用體積比為6％枸櫞酸鉛染液(pH＝12)染色5min，無CO2的雙蒸水沖洗3次，每次10min，沖洗完畢后室溫干燥，應(yīng)用透射電鏡(JEM-1200EX，日本)觀察腦皮質(zhì)神經(jīng)元的形態(tài)。

電鏡照片如圖5所示，假手術(shù)組大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元胞核較大，呈圓形或橢圓形，如圖5A所示，雙層核膜清晰完整，可見核孔，染色質(zhì)均勻分布，胞漿內(nèi)細胞器結(jié)構(gòu)形態(tài)清晰，如圖5B所示；模型組神經(jīng)元核膜皺縮，核染色質(zhì)邊聚，密度增高如圖5C所示，線粒體結(jié)構(gòu)松散，出現(xiàn)空泡狀，線粒體嵴斷裂、消失，如圖5D所示；胡黃連苷II組神經(jīng)元的核膜皺縮有所改善，如圖5E所示，細胞器腫脹亦較模型組減輕，如圖5F所示；夾竹桃麻素組神經(jīng)元核膜皺縮明顯減輕，空泡亦減少如圖5G所示，線粒體嵴明顯如圖5H所示；胡黃連苷II+夾竹桃麻素組神經(jīng)元核膜皺縮亦明顯減輕如圖5I所示，可見較多細胞器，如圖5J所示。

綜上所述，HE染色和電鏡結(jié)果表明，胡黃連苷II單獨或聯(lián)合夾竹桃麻素治療均能夠顯著減輕腦缺血再灌注引起的大腦皮質(zhì)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)損傷。

實施例5：

免疫印跡(Western Blotting)檢測胡黃連苷II對大鼠腦缺血再灌注Rac1/Nox2/ROS/ROCK/Claudin5信號通路活化水平的影響：

采用線栓法建立MCAO動物模型，造模結(jié)束并應(yīng)用胡黃連苷II和夾竹桃麻素治療22h后，取大腦皮質(zhì)腦組織勻漿，超聲震蕩提取蛋白，并采用BCA(bicinchonininc acid)法進行蛋白定量，利用大腦皮質(zhì)腦組織勻漿制備SDS-PAGE(SDS-聚丙烯酰胺)凝膠，并從超聲震蕩提取的蛋白中取蛋白樣品20ug，加樣電泳，濕法轉(zhuǎn)膜后在室溫條件下封閉2h后，加一抗Rac-1(1:3000)、Nox2(1:2000)、ROCK(1:3000)、MLCK(1:3000)、MMP-2(1:3000)、Claudin-5(1:100)制得待用物質(zhì)，上述中Rac1、Nox2、ROCK、MLCK、MMP-2和Claudin5稀釋比例均為體積比，均采用市售Western專用一抗二抗稀釋液進行稀釋，如Rac-1與Western專用一抗二抗稀釋液采用體積比為1:3000的比例進行稀釋；將制得的待用物質(zhì)在4℃孵育過夜后采用TBST(Tris-Buffered Saline and Tween20)洗膜3次，用HRP(辣根過氧化物酶)標記的二抗稀釋液(1:2000)室溫孵育2h，再用TBST洗膜3次后采用凝膠成像分析系統(tǒng)(Biospectrum 810Imaging system，UVP，USA)曝光顯影，Quantity One軟件分析測定各條帶的灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，計算目的蛋白相對值(RVP＝目的蛋白灰度/內(nèi)參灰度)，重復測定3次，取其均數(shù)。

Western blotting結(jié)果如圖6所示，模型組大鼠缺血側(cè)腦組織Rac1、Nox2表達顯著高于假手術(shù)組(P＜0.01)；胡黃連苷II組Rac1、Nox2表達較模型組降低(P<0.01)；夾竹桃麻素組及胡黃連苷II+夾竹桃麻素組Rac1、Nox2表達較模型組均顯著降低(P<0.01)；如圖7所示，模型組ROCK1、MLCK和MMP-2表達較假手術(shù)組明顯升高(P<0.01-0.001)；胡黃連苷II組ROCK1、MLCK和MMP-2表達較模型組顯著降低(P<0.05-0.001)，胡黃連苷II+夾竹桃麻素組ROCK、MLCK和MMP-2表達較模型組顯著降低(P<0.05-0.001)；Claudin-5分子量22kD，其降解時能夠看到17kD低分子量片段；模型組Claudin-5表達比假手術(shù)組顯著衰減(P<0.01)，并出現(xiàn)17kD新條帶；胡黃連苷II組Claudin-5表達比模型組有所增強(P<0.05)，且降解條帶表達減弱；胡黃連苷II+夾竹桃麻素組與模型組相比，能顯著提高Claudin-5表達水平(P<0.05)。

綜上所述，本實施例結(jié)果證實，胡黃連苷II有顯著的抗氧化、保護BBB作用，且能夠通過調(diào)控Rac1/Nox2/ROS/ROCK/Claudin5信號通路而減小腦梗死體積，改善神經(jīng)元的形態(tài)結(jié)構(gòu)和動物的神經(jīng)行為功能，顯示胡黃連苷II對缺血性腦卒中所致腦損傷具有較好的治療作用。

以上實施例僅用于說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對其進行限制；盡管參照前述實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，依然可以對前述實施例所記載的技術(shù)方案進行修改，或者對其中部分技術(shù)特征進行等同替換；而這些修改或替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明所要求保護的技術(shù)方案的精神和范圍。