本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，更具體的，涉及姜黃素(curcumin)在制備防治豬傳染性胃腸炎病毒藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

豬傳染性胃腸炎病毒(transmissiblegastroenteritisvirus,tgev)屬冠狀病毒科冠狀病毒屬成員，是導(dǎo)致以嚴(yán)重腹瀉、嘔吐和脫水為臨床特征的豬傳染性胃腸炎(transmissiblegastroenteritis,tge)的病因。由tgev引起的豬傳染性胃腸炎（tge）是危害世界養(yǎng)豬業(yè)的重要疾病之一。不同年齡和品種的豬對本病均易感，其中兩周齡以內(nèi)的仔豬致死率可達(dá)100%，5周齡以上豬的病死率很低，成年豬幾乎沒有死亡。該病1946年由doyle和hutchings在美國首次報道，此后世界上許多國家和地區(qū)(日本、英國、法國、荷蘭、德國、意大利、前蘇聯(lián)等)都相繼報道。我國最早是1956年在廣東省揭陽、惠來和汕頭市發(fā)現(xiàn)該病。自此以后，山東、天津、遼寧、甘肅、河北、山西、陜西等各地陸續(xù)發(fā)現(xiàn)該病。1976年后該病發(fā)病率平均每年以萬分之六、七的速度逐年上升，到1987年發(fā)病率達(dá)1.69％。1987～l989年全國疫病普查，tge在全國各地普遍存在，發(fā)病數(shù)仍居高不下。據(jù)21個省、市、自治區(qū)的統(tǒng)計，共發(fā)病豬2350.61萬頭，死亡36.14萬頭，平均發(fā)病率為1.61％，死亡率為0.025％。且近年來發(fā)病率呈上升趨勢，疫區(qū)也更為擴(kuò)大，并與豬輪狀病毒病、豬流行性腹瀉混合感染，給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。疫苗接種雖可在一定程度上預(yù)防該病，但不能徹底控制疫情的發(fā)生。tgev的防控仍是目前我國乃至世界的難題。

眾所周知，病毒感染性疾病是嚴(yán)重危害人類健康的常見病和多發(fā)病，尋找和開發(fā)無污染、低毒副作用的新的、安全有效的，特別是具有我國自主知識產(chǎn)權(quán)的抗病毒藥物具有十分重要的理論、經(jīng)濟(jì)和社會意義。我國地大物博，有豐富的中草藥資源，而用中藥治療疾病在我國有上千年的歷史，積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)。近年來，國內(nèi)外有關(guān)抗病毒中藥的研究日益增多，從中篩選其有效成分已成為當(dāng)前抗病毒新藥研發(fā)的一個熱點(diǎn)。

姜黃為我國常用傳統(tǒng)中藥，是姜科姜黃屬植物姜黃（curcumalongal）的干燥根莖。姜黃根莖中含有姜黃素、脫甲氧基姜黃素和脫二甲氧基姜黃素三種姜黃色素。其中姜黃素是一種低分子量的酸類物質(zhì)，是姜黃制品中最具活性的成分。長期以來，姜黃素一直被用作藥物、食品調(diào)味劑和著色劑?，F(xiàn)代藥理學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化、抗誘變和抗病毒等多方面的藥理作用。姜黃素因其隨處可見，價格低廉而又安全無毒成為了一種極具前景的新型藥物（前體）。

近年來，姜黃素的抗病毒作用研究受到國際上的廣泛關(guān)注，已有的研究表明，姜黃素對多種病毒，包括乙型肝炎病毒（hbv）、丙型肝炎病毒（hcv）、日本腦炎病毒（jev）、艾滋病病毒（hiv）、病毒性出血性敗血癥病毒（vhsv）、呼吸道合胞病毒（rsv）、流感病毒(iav)及人單純皰疹病毒i型（hsv-1）等都具有明顯的抑制效果。姜黃素是否也具有抗tgev的活性，至今還未有相關(guān)的研究或報道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有豬傳染性胃腸炎防治技術(shù)和藥物的不足，提供一種能夠防治豬傳染性胃腸炎的物質(zhì)——姜黃素(curcumin)。所述姜黃素對tgev有很好的抗病毒作用，且其已廣泛用于食品添加劑中，生物安全性好，有望在豬傳染性胃腸炎的防治中取得很好的應(yīng)用前景。

本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

第一方面，提供姜黃素(curcumin)在制備防治豬傳染性胃腸炎藥物中的應(yīng)用。

第二方面，提供姜黃素在制備防治豬傳染性胃腸炎病毒藥物中的應(yīng)用。

優(yōu)選的，所述姜黃素(curcumin)的使用劑量范圍為10-50μg/ml。

更優(yōu)選的，所述姜黃素(curcumin)的使用劑量范圍為10-30μg/ml。

第三方面，提供一種抗tgev藥物，其包括有效量的姜黃素。

優(yōu)選的，所述藥物制劑為注射制劑或口服制劑。

優(yōu)選的，所述口服制劑為顆粒劑、散片劑或膠囊劑。

優(yōu)選的，所述注射制劑為凍干粉針劑。

在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，首先確定了姜黃素對pk-15細(xì)胞的安全濃度范圍，并以此為依據(jù)在pk-15(豬腎上皮細(xì)胞)細(xì)胞中通過tcid50實(shí)驗(yàn)和real-timert-pcr等多種方法證實(shí)了姜黃素在不同作用方式下（先加藥后接毒、先接毒后加藥和藥物與病毒混合感作）對tgev都有很好的抗病毒效果，并闡明了姜黃素在tgev吸附過程中的作用；進(jìn)一步的，運(yùn)用雙熒光素酶報告系統(tǒng)分析姜黃素對tgev感染細(xì)胞的細(xì)胞因子表達(dá)的影響，初步闡明其是通過抑制nf-κb通路來抗tgev增殖。

本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明首次證明了姜黃素(curcumin)的抗tgev的作用，姜黃素能夠顯著降低病毒滴度和n基因的表達(dá)，且隨著姜黃素濃度的升高，抑制效果越明顯；姜黃素還能抑制病毒的吸附過程。姜黃素在先加藥后接毒方式下對病毒的抑制效果最好，提示姜黃素對tgev具有一定的預(yù)防作用。由于姜黃素在食品添加劑中已有廣泛應(yīng)用，對細(xì)胞及機(jī)體幾乎無毒性，故在豬傳染性胃腸炎的防治工作中具有良好的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1為mtt實(shí)驗(yàn)檢測姜黃素對pk-15的毒性試驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計圖。

圖2為姜黃素抗病毒試驗(yàn)中，先加藥后接毒作用方式下的病毒滴度圖。

圖3為姜黃素抗病毒試驗(yàn)中，先接毒后加藥作用方式下的病毒滴度。

圖4為姜黃素抗病毒試驗(yàn)中，混合作用方式下的病毒滴度圖。

圖5為姜黃素抗病毒試驗(yàn)中，三種作用方式處理細(xì)胞后經(jīng)real-timert-pcr試驗(yàn)檢測的n基因mrna表達(dá)水平。

圖6為mtt法檢測姜黃素對病毒吸附過程的影響。

圖7為real-timert-pcr試驗(yàn)檢測姜黃素對ifn-αmrna表達(dá)水平的影響。

圖8為real-timert-pcr試驗(yàn)檢測姜黃素對ifn-βmrna表達(dá)水平的影響。

圖9為雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測姜黃素對nf-κb活化信號的影響。

具體實(shí)施方式

通過以下詳細(xì)說明結(jié)合附圖可以進(jìn)一步理解本發(fā)明的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)。所提供的實(shí)施例僅是對本發(fā)明方法的說明，而不以任何方式限制本發(fā)明揭示的其余內(nèi)容。

除非特別說明，本發(fā)明采用的試劑、方法和設(shè)備為本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)試劑、方法和設(shè)備。

除非特別說明，以下實(shí)例所用試劑和材料均為市購。

本發(fā)明以下實(shí)施例的統(tǒng)計學(xué)分析：所有試驗(yàn)至少3次重復(fù)，結(jié)果采用平均值和標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用單因素方差分析和t檢驗(yàn)分析。所有統(tǒng)計分析均采用以p<0.05作為具有顯著統(tǒng)計學(xué)差異的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。

實(shí)施例1姜黃素細(xì)胞毒性試驗(yàn)

配制姜黃素母液：稱取0.1g姜黃素粉末，在超凈臺上加1mldmso溶解，使儲存濃度為100mg/ml，使用時分別用細(xì)胞維持液進(jìn)行稀釋成所需要的濃度。

用含10%胎牛血清的dmem培養(yǎng)基培養(yǎng)pk-15細(xì)胞，細(xì)胞用胰酶消化后鋪至96孔板（100μl/孔），37°c5.0%co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至單層，用不同濃度(0，10，20，30，40，50，60，70，80，90，100μg/ml)的姜黃素處理pk-15細(xì)胞，每個濃度重復(fù)3組，同時設(shè)置dmso對照組。作用16-18h后，每孔加入20μlmtt溶液（5mg/ml，即0.5%mtt），繼續(xù)培養(yǎng)4h。終止培養(yǎng)后小心吸去孔內(nèi)的培養(yǎng)液，每孔加入150μl二甲基亞砜，置搖床上低速震蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解，再使用多功能酶標(biāo)儀讀取各孔吸光值，作圖分析數(shù)據(jù)。

結(jié)果如附圖1所示，低濃度（10，20，30，40或50μg/ml）姜黃素處理組細(xì)胞的od值與dmso對照組無顯著差異（p>0.05），高濃度（60，70，80，90或100μg/ml）姜黃素處理組細(xì)胞的od值顯著低于dmso對照組（p<0.05），表明姜黃素對pk-15細(xì)胞的最大無毒濃度為50μg/ml。

實(shí)施例2姜黃素抗病毒試驗(yàn)

第一種作用方式：先加藥后接毒

先在24孔板內(nèi)加不同濃度（0，10，20，30，40，50μg/ml）的姜黃素溶液，37℃培養(yǎng)1.5h后用pbs洗滌3次，加入moi=0.1的tgev感染細(xì)胞1.5h，洗滌3次后換含有姜黃素的維持液培養(yǎng)24h。每個濃度設(shè)置3個重復(fù)。

第二種作用方式：先接毒后加藥

先在24孔板內(nèi)加入moi=0.1的tgev感染1.5h，pbs洗滌3次，加不同濃度（0，10，20，30，40，50μg/ml）的姜黃素溶液，37℃培養(yǎng)1.5h后用pbs洗滌3次，換不含姜黃素的維持液培養(yǎng)24h。每個濃度設(shè)置3個重復(fù)。

第三種作用方式：毒藥混合作用

將moi=0.1的tgev和不同濃度（0，10，20，30，40，50μg/ml）的姜黃素溶液混合37℃培養(yǎng)1.5h后加入細(xì)胞中，繼續(xù)培養(yǎng)1.5h后，pbs洗滌3次，換不含姜黃素的維持液培養(yǎng)24h。每個濃度設(shè)置3個重復(fù)。

以上三種方式處理的樣品均制備兩份。一份樣品（細(xì)胞+上清）反復(fù)凍融三次后分裝凍存于-80℃，用于后續(xù)的tcid50試驗(yàn)；另一份細(xì)胞樣品用pbs洗3遍，每孔加800μltrizol裂解，提取rna，用于rt-pcr。

將上述步驟4中反復(fù)凍融的（細(xì)胞+上清）樣品各取100μl融化后，進(jìn)行tcid50實(shí)驗(yàn)：在離心管中用含2%fbs的dmem維持液將病毒液作連續(xù)10倍的稀釋，從10^-1-10^-8。將梯度稀釋好的病毒接種到96孔培養(yǎng)板中，每一稀釋度接種一列，共8孔，100μl/每孔。再在每孔加入細(xì)胞懸液100μl，使其細(xì)胞量達(dá)到2~3×10⁵個/ml。同時設(shè)正常細(xì)胞對照（兩列共16孔，100μl維持液+100μl細(xì)胞懸液/孔）。置37℃co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日觀察并記錄細(xì)胞病變結(jié)果，一般觀察4-6天。按reed-muench兩氏法計算結(jié)果。

結(jié)果如附圖2（先加藥后接毒）、附圖3（先接毒后加藥）和附圖4（毒藥混合作用）所示。結(jié)果顯示，在三種作用方式中，不同濃度的姜黃素處理細(xì)胞后，病毒滴度與對照組都有顯著下降，且隨著姜黃素的濃度增大，滴度下降越明顯，呈現(xiàn)劑量依賴性。表明姜黃素對tgev的增殖有抑制作用，且濃度越高，抑制作用越明顯。

提取上述步驟4中trizol裂解的細(xì)胞樣品總rna，并反轉(zhuǎn)錄成cdna后作為模板，以jc-tgev-n-f（5’-ttacaaactcgctatcgcatgg-3’）和jc-tgev-n-r（5’-tgtcacatcacctttacctgca-3’）為引物，進(jìn)行實(shí)時熒光定量pcr測定。

結(jié)果如附圖5所示。結(jié)果顯示，與對照組相比，tgevn基因的mrna表達(dá)水平在不同方式姜黃素處理后均呈現(xiàn)下調(diào)的趨勢，表明姜黃素能抑制tgev基因組復(fù)制。進(jìn)一步比較上述三種作用方式下姜黃素的抑制作用，每種方式均顯示隨著姜黃素濃度的逐漸增加，tgev的mrna表達(dá)水平被抑制的效果越明顯，呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。且先加藥后接毒方式對病毒的抑制效果最好，初步提示姜黃素對tgev具有一定的預(yù)防作用。

實(shí)施例3姜黃素抑制病毒吸附試驗(yàn)

將pk-15細(xì)胞匯合度至80%的96孔板置于4℃預(yù)冷45min-1h后，加含有不同濃度姜黃素（0，10，20，30，40，50μg/ml）的tgev（100tcid50），每個濃度設(shè)置6個重復(fù)孔，4℃孵育2h。

預(yù)冷的pbs洗3次，將未吸附到病毒表面的病毒清洗掉，然后加入新鮮的維持液100μl/孔，置于37℃co2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24h，以mtt法分析姜黃素對tgev吸附過程的影響。

結(jié)果如附圖6所示。細(xì)胞經(jīng)過吸附實(shí)驗(yàn)處理24h后，在酶聯(lián)免疫檢測儀od490nm處測量各孔的吸光值記錄并做成柱狀圖。結(jié)果顯示姜黃素濃度在0-50μl范圍內(nèi)，隨著其濃度的增加，吸光值越來越高，說明姜黃素對tgev吸附pk-15細(xì)胞時有抑制作用，姜黃素具有抗病毒效果。

實(shí)施例4姜黃素對細(xì)胞因子的影響

1、在24孔板中pk-15細(xì)胞匯合至80%時，棄去培養(yǎng)液，pbs洗3遍，以moi=0.1的tgev感染細(xì)胞1.5h，洗滌3次后換含有姜黃素（0，30μg/ml）的維持液培養(yǎng)24h。每個濃度設(shè)置3個重復(fù)，同時設(shè)陰性對照和不加任何處理的空白對照。收集細(xì)胞對細(xì)胞因子ifn-α和ifn-β進(jìn)行qrt-pcr檢測。

結(jié)果顯示，與tgev處理組相比，姜黃素+tgev處理組能夠抑制ifn-α（附圖7）和ifn-β（附圖8）的mrna表達(dá)量。

2、在24孔板中pk-15細(xì)胞匯合至60%時，運(yùn)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法共轉(zhuǎn)染nf-κb熒光素酶報告質(zhì)粒（0.1μg）和內(nèi)參對照質(zhì)粒phrl-tk（0.05μg）。24h后棄去培養(yǎng)液，pbs洗3遍，以moi=0.1的tgev感染細(xì)胞1.5h，洗滌3次后換含有姜黃素（0，30μg/ml）的維持液繼續(xù)培養(yǎng)24h（每個濃度設(shè)置3個重復(fù)，同時設(shè)陰性對照和不加任何處理的空白對照）。

收集樣品采用雙熒光素酶檢測試劑盒（promega）和glomax20/20熒光檢測儀分析熒光素酶的活性，通過與內(nèi)參的比較，確定不同處理組中轉(zhuǎn)錄因子nf-κb的活性，以分析姜黃素對nf-κb活化過程的影響。

結(jié)果顯示：與tgev處理組相比，姜黃素+tgev處理組能夠抑制nf-κb的活化（附圖9）。

以上結(jié)果表明，姜黃素通過干擾nf-κb信號通路來發(fā)揮抗病毒作用，抑制tgev的復(fù)制。

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<110>武漢生物工程學(xué)院

<120>姜黃素在制備防治豬傳染性胃腸炎病毒藥物中的應(yīng)用

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