本發(fā)明屬于生物，具體涉及pafah2蛋白在制備預(yù)防和/或治療缺血再灌注損傷的產(chǎn)品中的應(yīng)用，特別涉及通過(guò)靜脈注射人源重組的pafah2蛋白預(yù)防和/或治療缺血再灌注損傷的方法。

背景技術(shù)：

1、鐵死亡是一種鐵依賴(lài)的脂質(zhì)過(guò)氧化積累導(dǎo)致的程序性細(xì)胞死亡。最初，erastin和rsl3被發(fā)現(xiàn)能特異性地殺死ras致癌突變的腫瘤細(xì)胞，因而被統(tǒng)稱(chēng)為ras-selectivelethal?compounds(rsls)。在2012年，brent?r.stockwell將這種rsls導(dǎo)致的特征性細(xì)胞死亡命名為鐵死亡。鐵死亡在細(xì)胞形態(tài)上、生物化學(xué)上和基因水平上不同于凋亡、壞死和焦亡等已報(bào)道的細(xì)胞死亡。鐵死亡過(guò)程中并不會(huì)形成凋亡小體或自噬小體，不具有細(xì)胞收縮、染色質(zhì)聚集、細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞器腫脹等現(xiàn)象，而展現(xiàn)出線粒體片段化和膜密度增加、膜結(jié)構(gòu)完整性喪失和細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化物增加的特征。鐵死亡被報(bào)道參與多種疾病進(jìn)程，包括腫瘤、缺血再灌注損傷和神經(jīng)退行性疾病等。迄今為止，鐵死亡的發(fā)生機(jī)制和細(xì)胞抵御鐵死亡的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)已基本形成，但仍有更多與鐵死亡傳播和藥物臨床應(yīng)用相關(guān)的科學(xué)問(wèn)題亟待解決，而脂質(zhì)過(guò)氧化導(dǎo)致鐵死亡發(fā)生的具體機(jī)制是該領(lǐng)域未解決的一大難題。

2、缺血再灌注(i/r)損傷是某一器官的動(dòng)脈血液供應(yīng)被短暫阻斷后又恢復(fù)供應(yīng)而導(dǎo)致的組織損傷。缺血時(shí)期，組織會(huì)經(jīng)受低氧的壓力，線粒體無(wú)氧代謝致使atp產(chǎn)量下降；再灌注時(shí)期，活性氧驟然增加，會(huì)導(dǎo)致缺血部位再氧化和多器官炎癥的級(jí)聯(lián)效應(yīng)，最終會(huì)導(dǎo)致器官衰竭。缺血再灌注損傷發(fā)生在器官移植、敗血癥、缺血性中風(fēng)和睡眠呼吸暫停等多種疾病中。缺血再灌注會(huì)激活凋亡、壞死性凋亡和自噬性細(xì)胞死亡等程序性細(xì)胞死亡。通過(guò)抑制細(xì)胞死亡來(lái)緩解缺血再灌注損傷是一種新的治療策略，在動(dòng)物模型上，鐵死亡的抑制劑已用于緩解多種缺血再灌注損傷。

3、腎臟是重要的負(fù)責(zé)排泄和內(nèi)分泌的器官。腎臟的外層是腎皮質(zhì)，主要由腎小球和腎小管組成。腎小管又可以分為近端小管(包括近曲小管和髓袢降支粗段)、髓袢細(xì)段和遠(yuǎn)端小管(包括髓袢升支粗段和遠(yuǎn)曲小管)三部分。腎臟的內(nèi)部是由腎錐體構(gòu)成腎髓質(zhì)。急性腎損傷又被稱(chēng)為急性腎功能衰竭。急性腎損傷對(duì)腎小管和腎小球等有直接損害，這導(dǎo)致快速的腎功能不全，腎小球?yàn)V過(guò)率和腎輸出量的驟然下降，水和電解質(zhì)平衡受損，是多種相關(guān)疾病高發(fā)病率和高死亡率的主要原因。他莫昔芬誘導(dǎo)的鐵死亡關(guān)鍵蛋白gpx4除大腦以外的全身敲除，會(huì)導(dǎo)致急性腎損傷和個(gè)體死亡，這表明腎小管細(xì)胞是大腦區(qū)域外最容易受到鐵死亡損傷的細(xì)胞，其中腎近端小管上皮細(xì)胞的損傷最為顯著。

4、急性腎損傷發(fā)生的最主要原因是腎臟缺血再灌注損傷。在腎臟再灌注時(shí)期會(huì)產(chǎn)生大量活性氧自由基，鐵離子水平增加，次級(jí)氧化產(chǎn)物丙二醛的水平增加，谷胱甘肽的水平下降，膜系統(tǒng)脂質(zhì)過(guò)氧化增加，促進(jìn)腎小管細(xì)胞死亡的發(fā)生，與鐵死亡具有相似的特征。補(bǔ)充自由基的清除劑褪黑素能抵抗缺血再灌注損傷導(dǎo)致的腎臟損傷，表明清除自由基的抗氧化系統(tǒng)對(duì)缺血再灌注損傷有保護(hù)效應(yīng)。鐵死亡的抑制劑ferrostatins和liproxstatins是親脂性抗氧化劑，預(yù)處理能減輕嚴(yán)重的腎臟缺血再灌注損傷，這表明鐵死亡參與腎臟缺血再灌注損傷。他莫昔芬誘導(dǎo)鐵死亡關(guān)鍵蛋白gpx4敲除以后，小鼠腎臟腫大，變得蒼白，出現(xiàn)非選擇性蛋白尿，近端腎小管上皮細(xì)胞死亡等急性腎衰竭的特征。gpx4敲除的腎臟氧化脂質(zhì)組分析顯示，磷脂酰乙醇胺、磷脂酰膽堿和心磷脂氧化修飾增加。親脂性的抗氧化劑liproxstatin-1能減少gpx4敲除導(dǎo)致的小鼠腎小管細(xì)胞的鐵死亡，并延長(zhǎng)其壽命，表明了鐵死亡對(duì)急性腎損傷有一定的貢獻(xiàn)。另外，鐵死亡抑制蛋白fsp1敲除加劇缺血再灌注損傷導(dǎo)致的腎小管細(xì)胞的鐵死亡，表明非谷胱甘肽依賴(lài)的抗氧化系統(tǒng)也能保護(hù)腎臟對(duì)抗缺血再灌注損傷。在器官移植后的第七天，急性腎小管損傷患者的活檢標(biāo)本顯示鐵死亡標(biāo)志蛋白acsl4的表達(dá)水平顯著增加，伴隨著嚴(yán)重血栓性微血管病變，也表明在缺血再灌注損傷時(shí)有鐵死亡的發(fā)生。

5、鐵死亡相關(guān)的疾病往往涉及大面積的連續(xù)區(qū)域損傷，與erastin等誘導(dǎo)的鐵死亡在相鄰的細(xì)胞之間以波的形式傳播的特征相符合。與細(xì)胞焦亡和壞死性凋亡相似，細(xì)胞膜上形成的納米級(jí)直徑的孔介導(dǎo)了鐵死亡細(xì)胞的腫脹和破裂，1?450和3?350da的聚乙二醇作為調(diào)滲物質(zhì)能抑制鐵死亡時(shí)細(xì)胞膜的破裂。并且，鐵死亡信號(hào)傳播發(fā)生在細(xì)胞破裂之前，但鐵死亡的傳播因子尚未可知。在斑馬魚(yú)幼蟲(chóng)尾鰭中注射花生四烯酸促使自尾鰭傷口邊緣產(chǎn)生脂質(zhì)過(guò)氧化物的梯度，會(huì)導(dǎo)致尾鰭細(xì)胞發(fā)生以波狀形式傳播的鐵死亡。鐵死亡在分離的腎小管上也呈現(xiàn)出波浪一樣的時(shí)空傳播方式，erastin促使原代腎小管細(xì)胞死亡，更加穩(wěn)定并強(qiáng)效的第三代的ferrosatin?16-86能抑制腎小管的死亡，而壞死性凋亡的抑制劑necrostatin-1(nec-1)并不能抵抗腎小管的死亡，表明鐵死亡而非壞死性凋亡會(huì)導(dǎo)致同步化的腎小管細(xì)胞死亡。

6、綜上所述，鐵死亡參與缺血再灌注損傷的發(fā)生與發(fā)展，可以通過(guò)抑制鐵死亡來(lái)治療或緩解此類(lèi)疾病。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是如何預(yù)防和/或治療和/或抑制缺血再灌注損傷。

2、為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明首先提供了pafah2蛋白或促進(jìn)pafah2蛋白表達(dá)的物質(zhì)的新用途。

3、本發(fā)明提供了pafah2蛋白或促進(jìn)pafah2蛋白表達(dá)的物質(zhì)在制備預(yù)防和/或治療和/或抑制缺血再灌注損傷的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

4、上述應(yīng)用中，所述pafah2蛋白為如下r1)-r4)所示的蛋白質(zhì)：

5、r1)氨基酸序列是seq?id?no.1所示的蛋白質(zhì)；

6、r2)在r1)所示的蛋白質(zhì)的羧基端和/或氨基端融合標(biāo)簽蛋白得到的具有相同功能的融合蛋白；

7、r3)將r1)或r2)所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白質(zhì)；

8、r4)與r1)或r2)或r3)所示的氨基酸序列具有90％或90％以上的同一性且具有相同功能的蛋白質(zhì)。

9、上述r2)中，所述標(biāo)簽是指利用dna體外重組技術(shù)，與目的蛋白一起融合表達(dá)的一種多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表達(dá)、檢測(cè)、示蹤和/或純化。所述標(biāo)簽可為flag標(biāo)簽、his標(biāo)簽、mbp標(biāo)簽、ha標(biāo)簽、myc標(biāo)簽、gst標(biāo)簽和/或sumo標(biāo)簽等。

10、上述r3)中，所述一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加為不超過(guò)10個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加，或不超過(guò)9個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加，或不超過(guò)8個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加，或不超過(guò)7個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加，或不超過(guò)6個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加，或不超過(guò)5個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加，或不超過(guò)4個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加，或不超過(guò)3個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加，或不超過(guò)2個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加，或不超過(guò)1個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。

11、上述r4)中，所述同一性包括與本發(fā)明的seq?id?no.1所示的氨基酸序列具有90％或更高，或91％或更高，或92％或更高，或93％或更高，或94％或更高，或95％或更高，或96％或更高，或97％或更高，或98％或更高，或99％或更高同一性的氨基酸序列。

12、上述r1)-r4)所述的蛋白質(zhì)可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。

13、在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施例中，所述pafah2蛋白是通過(guò)生物表達(dá)得到，具體制備方法包括如下步驟：將pafah2的編碼基因?qū)肷锛?xì)胞中，得到重組細(xì)胞；將所述細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，并從培養(yǎng)產(chǎn)物中純化得到pafah2蛋白。

14、所述pafah2的編碼基因通過(guò)表達(dá)載體導(dǎo)入生物細(xì)胞中，所述表達(dá)載體具體可為pcdna3.1，所述pafah2的編碼基因具體可為seq?id?no.2所示的dna分子。

15、所述生物細(xì)胞具體可為hek?293f細(xì)胞。

16、所述培養(yǎng)條件具體可為37℃、120rpm、5％co2的條件下培養(yǎng)48h。

17、所述培養(yǎng)后還包括如下步驟：離心(18,000rpm、4℃離心40min)，棄上清液，收集細(xì)胞沉淀；重懸所述細(xì)胞沉淀后進(jìn)行裂解，得到裂解液；將所述裂解液離心，收集上清液；將所述上清液先用進(jìn)行親和吸附，然后進(jìn)行洗脫，得到人源重組pafah2蛋白。

18、按照本發(fā)明方法制備的人源重組pafah2蛋白可在純化及除菌后立即使用，也可凍存于-80攝氏度冰箱中保存，需要避免反復(fù)凍融。

19、上述應(yīng)用中，所述pafah2蛋白可通過(guò)抑制脂質(zhì)過(guò)氧化導(dǎo)致的鐵死亡抑制缺血再灌注損傷，具體可通過(guò)清除缺血再灌注導(dǎo)致的血小板激活因子及其類(lèi)似磷脂，阻斷鐵死亡在細(xì)胞群體間的傳播，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)預(yù)防和/或治療和/或抑制缺血再灌注損傷。

20、上述應(yīng)用中，所述pafah2蛋白可通過(guò)靜脈注射的方式預(yù)防和/或治療和/或抑制缺血再灌注損傷。所述靜脈注射的劑量具體可為20mg/kg。

21、為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明還提供了一種用于預(yù)防和/或治療和/或抑制缺血再灌注損傷的產(chǎn)品。

22、本發(fā)明提供的用于預(yù)防和/或治療和/或抑制缺血再灌注損傷的產(chǎn)品的活性成分為上述任一所述的pafah2蛋白或促進(jìn)pafah2蛋白表達(dá)的物質(zhì)。

23、進(jìn)一步的，所述產(chǎn)品為pafah2蛋白溶液。

24、再進(jìn)一步的，所述pafah2蛋白溶液的濃度可為2mg/ml。

25、更進(jìn)一步的，所述pafah2蛋白溶液的溶劑可為含300mm?nacl，50mm?tris(ph?8.5)的緩沖液。

26、上述任一所述產(chǎn)品可為藥物或制劑。

27、在實(shí)際應(yīng)用中制備所述藥物或制劑時(shí)，還可加入載體材料。所述載體材料包括但不限于水溶性載體材料(如聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、有機(jī)酸等)、難溶性載體材料(如乙基纖維素、膽固醇硬脂酸酯等)、腸溶性載體材料(如醋酸纖維素酞酸酯和羧甲乙纖維素等)。

28、使用這些材料可以制成多種劑型，包括但不限于片劑、膠囊、滴丸、氣霧劑、丸劑、粉劑、溶液劑、混懸劑、乳劑、顆粒劑、脂質(zhì)體、透皮劑、口含片、栓劑、凍干粉針劑等?？梢允瞧胀ㄖ苿⒕忈屩苿?、控釋制劑及各種微粒給藥系統(tǒng)。為了將單位給藥劑型制成片劑，可以廣泛使用本領(lǐng)域公知的各種載體。關(guān)于載體的例子是，例如稀釋劑與吸收劑，如淀粉、糊精、硫酸鈣、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化鈉、葡萄糖、尿素、碳酸鈣、白陶土、微晶纖維素、硅酸鋁等；濕潤(rùn)劑與粘合劑，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉漿、糊精、糖漿、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯膠漿、明膠漿、羧甲基纖維素鈉、紫膠、甲基纖維素、磷酸鉀、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解劑，例如干燥淀粉、海藻酸鹽、瓊脂粉、褐藻淀粉、碳酸氫鈉與枸櫞酸、碳酸鈣、聚氧乙烯、山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸鈉、甲基纖維素、乙基纖維素等；崩解抑制劑，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氫化油等；吸收促進(jìn)劑，例如季銨鹽、十二烷基硫酸鈉等；潤(rùn)滑劑，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸鹽、硼酸、液體石蠟、聚乙二醇等。還可以將片劑進(jìn)一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、腸溶包衣片，或雙層片和多層片。為了將單位給藥劑型制成丸劑，可以廣泛使用本領(lǐng)域公知的各種載體。關(guān)于載體的例子是，例如稀釋劑與吸收劑，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氫化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、高嶺土、滑石粉等；粘合劑如阿拉伯膠、黃蓍膠、明膠、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解劑，如瓊脂粉、干燥淀粉、海藻酸鹽、十二烷基磺酸鈉、甲基纖維素、乙基纖維素等。為了將單位給藥劑型制成栓劑，可以廣泛使用本領(lǐng)域公知的各種載體。關(guān)于載體的例子是，例如聚乙二醇、卵磷脂、可可脂、高級(jí)醇、高級(jí)醇的酯、明膠、半合成甘油酯等。為了將單位給藥劑型制成注射用制劑，如溶液劑、乳劑、凍干粉針劑和混懸劑，可以使用本領(lǐng)域常用的所有稀釋劑，例如，水、乙醇、聚乙二醇、1,3-丙二醇、乙氧基化的異硬脂醇、多氧化的異硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，為了制備等滲注射液，可以向注射用制劑中添加適量的氯化鈉、葡萄糖或甘油，此外，還可以添加常規(guī)的助溶劑、緩沖劑、ph調(diào)節(jié)劑等。此外，如需要，也可以向藥物制劑中添加著色劑、防腐劑、香料、矯味劑、甜味劑或其它材料。

29、使用上述劑型可以經(jīng)注射給藥，優(yōu)選靜脈注射。將上述產(chǎn)品通過(guò)靜脈注射的方式施用于受試者，可以預(yù)防和/或治療和/或抑制缺血再灌注損傷。

30、為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明最后還提供了一種抑制缺血再灌注損傷的方法。

31、本發(fā)明提供的抑制缺血再灌注損傷的方法包括向受試者靜脈注射pafah2蛋白的步驟。

32、所述靜脈注射的劑量具體可為20mg/kg。

33、所述靜脈注射的時(shí)間具體可在缺血發(fā)生后，組織進(jìn)行再灌注之前。

34、上述任一所述應(yīng)用或產(chǎn)品或方法中，所述缺血再灌注損傷可為心肌缺血再灌注損傷、腦缺血再灌注損傷或腎臟缺血再灌注損傷(如腎臟缺血再灌注導(dǎo)致的急性腎損傷)。

35、上述任一所述應(yīng)用或產(chǎn)品或方法中，所述缺血再灌注損傷不僅包括由于血液循環(huán)受阻在臨床治療時(shí)需進(jìn)行血流再灌注而導(dǎo)致的損傷，還包括在組織或器官缺血狀態(tài)下進(jìn)行類(lèi)似于再灌注治療而導(dǎo)致的損傷。

36、所述由于血液循環(huán)受阻在臨床治療時(shí)需進(jìn)行血流再灌注的疾病包括但不限于器官移植、膿毒癥、心肌梗塞、動(dòng)脈粥樣硬化。

37、所述在組織或器官缺血狀態(tài)下進(jìn)行類(lèi)似于再灌注治療的情況包括但不限于休克時(shí)微循環(huán)的疏通、冠狀動(dòng)脈痙攣的緩解、心臟驟停后心腦肺復(fù)蘇。

38、本發(fā)明的有益效果如下：由于在缺血再灌注的過(guò)程中會(huì)有血小板激活因子以及多種類(lèi)型的氧化截?cái)嗔字漠a(chǎn)生，而血小板激活因子乙酰水解酶pafah2是細(xì)胞內(nèi)對(duì)上述特殊磷脂具有特異性的磷脂酶，通過(guò)水解磷脂sn-2位置上的短鏈，促進(jìn)氧化的磷脂進(jìn)入磷脂循環(huán)中，用于新的磷脂的合成，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)有害磷脂的清除?；诖?，本發(fā)明提供了一種通過(guò)靜脈注射pafah2蛋白以抑制缺血再灌注損傷的方法，該方法通過(guò)在缺血發(fā)生后，組織進(jìn)行再灌注之前，通過(guò)靜脈注射體外純化的人源重組pafah2蛋白，用pafah2清除由于再灌注產(chǎn)生的氧化截?cái)嗟牧字?，從而?shí)現(xiàn)了保護(hù)組織細(xì)胞免受由于脂質(zhì)過(guò)氧化導(dǎo)致的鐵死亡的發(fā)生及傳播擴(kuò)散，抑制缺血再灌注導(dǎo)致的大面積的組織損傷。本發(fā)明方法適用于多種臨床情況，包括多種器官移植手術(shù)、血管堵塞的疏通和膿毒癥等，只需在進(jìn)行手術(shù)實(shí)施之前通過(guò)靜脈注射pafah2的蛋白即可，簡(jiǎn)單方便，效果顯著。

39、本發(fā)明提供了一種通過(guò)靜脈注射pafah2蛋白以抑制缺血再灌注的方法。本發(fā)明首次揭示了血小板激活因子及其類(lèi)似磷脂可以誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生鐵死亡。一方面，它們可以直接導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性增加；另一方面，它們可以被分泌到細(xì)胞外，作為鐵死亡的傳播因子，促進(jìn)鐵死亡在細(xì)胞群體中的傳播。pafah2作為細(xì)胞內(nèi)對(duì)血小板激活因子及其類(lèi)似磷脂的特異性水解酶，通過(guò)清除這些氧化底物，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)鐵死亡的抵抗作用。缺血再灌注會(huì)導(dǎo)致組織細(xì)胞發(fā)生鐵死亡，本發(fā)明通過(guò)注射人源重組pafah2蛋白來(lái)清除由于再灌注產(chǎn)生的氧化截?cái)嗟牧字?，從而保護(hù)組織細(xì)胞免受由于脂質(zhì)過(guò)氧化導(dǎo)致的鐵死亡的發(fā)生及傳播擴(kuò)散，抑制缺血再灌注導(dǎo)致的大面積的組織損傷。