本技術(shù)涉及生物醫(yī)用材料領(lǐng)域，具體涉及一種重組iii型人膠原蛋白凝膠及其制備方法。

背景技術(shù)：

1、膠原蛋白是生物高分子，動(dòng)物結(jié)締組織中的主要成分，也是哺乳動(dòng)物體內(nèi)含量最多、分布最廣的功能性蛋白，占蛋白質(zhì)總量的25％～30％，某些生物體甚至高達(dá)80％以上。膠原蛋白獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特征、理化性能及優(yōu)異的生物相容性、可生物降解性，使其成為一種理想的生物醫(yī)用材料，在難愈性創(chuàng)面愈合及周圍皮膚的護(hù)理、提供皮膚過敏、激光、光子術(shù)后的愈合環(huán)境、真皮組織填充、人工皮膚、骨修復(fù)材料、藥物緩釋材料等多方面發(fā)揮著重要作用。除膠原蛋白本身在促進(jìn)細(xì)胞黏附、增殖、分化及遷移方面的作用之外，膠原蛋白骨架還可誘導(dǎo)自身膠原蛋白的產(chǎn)生，對(duì)維持注射部位及周圍組織持續(xù)的膠原蛋白“穩(wěn)態(tài)”存在、修復(fù)皮膚生態(tài)環(huán)境等方面，具有其他修復(fù)材料或再生材料不可比擬的功能和作用，具有非常重要的臨床治療意義。

2、同時(shí)，膠原蛋白良好的生物相容性、可降解性，使其作為敷料或組織工程支架為創(chuàng)面治療提供了良好的生物材料選擇，其可被制作成膠原蛋白溶液、膠原蛋白海綿、膠原蛋白敷貼、膠原蛋白凝膠等。膠原蛋白被廣泛開發(fā)成第二類醫(yī)療器械應(yīng)用于創(chuàng)面修復(fù)，被開發(fā)成第三類醫(yī)療器械用于水光針及真皮組織的填充。依據(jù)膠原材料來源，膠原蛋白可分為天然來源和重組來源。天然來源系動(dòng)物來源，原料取自豬皮、牛皮、牛跟腱、魚等，依其不同來源特性，制備膠原蛋白產(chǎn)品分別適用不同場(chǎng)景，重組來源包括以大腸桿菌、酵母、哺乳動(dòng)物細(xì)胞等作為細(xì)胞工廠，將目標(biāo)膠原蛋白基因轉(zhuǎn)入宿主，通過發(fā)酵表達(dá)、分離純化進(jìn)行制備。動(dòng)物來源膠原蛋白具有完整的生物學(xué)活性及體內(nèi)穩(wěn)定性，但存在免疫反應(yīng)及疾病或病毒傳播風(fēng)險(xiǎn)，成分復(fù)雜、質(zhì)量可控性差、來源受限等問題。重組來源膠原蛋白克服了動(dòng)物來源膠原蛋白的缺點(diǎn)和不足，在第二類醫(yī)療器械及第三類醫(yī)療器械的應(yīng)用方面得到廣泛使用。

3、隨著應(yīng)用場(chǎng)景的不斷增多，對(duì)重組來源的膠原蛋白也提出了更高的要求，如何使膠原蛋白具有與天然人膠原蛋白相一致的生物學(xué)作用成為其應(yīng)用的阻礙，獲得具有正確高級(jí)結(jié)構(gòu)的膠原蛋白，特別是具有與天然人膠原蛋白相一致的結(jié)構(gòu)，成為解決這一問題的關(guān)鍵，同時(shí)還要克服重組人膠原蛋白在與不同功能輔料復(fù)配時(shí)的互溶穩(wěn)定性及安全性。

4、為滿足日益增長(zhǎng)的醫(yī)美需求及復(fù)雜、難治愈傷口的治療需求，新型多功能復(fù)合醫(yī)美產(chǎn)品特別是具有互補(bǔ)功能的產(chǎn)品及高端創(chuàng)傷敷料成為當(dāng)下最迫切需要開發(fā)的產(chǎn)品。

5、目前尚未見到采用高純度、脯氨酸羥基化程度與天然人膠原蛋白相一致，具有完整三螺旋結(jié)構(gòu)、生物學(xué)作用與天然人膠原蛋白一致的重組iii型人膠原蛋白及其相關(guān)產(chǎn)品。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本技術(shù)旨在至少在一定程度上解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題至少之一。為此，本技術(shù)提供了一種重組iii型人膠原蛋白凝膠，該重組iii型人膠原蛋白凝膠具有高穩(wěn)定性。

2、本技術(shù)是基于發(fā)明人的下列發(fā)現(xiàn)而完成的：

3、透明質(zhì)酸(hyaluronic?acid，ha)，是一種酸性粘多糖，由d-葡萄糖醛酸與n-乙酰葡糖胺組成雙糖單位糖胺聚糖，廣泛存在于人體的組織和體液中，如皮膚、玻璃體、關(guān)節(jié)液、軟骨和臍帶中，是構(gòu)成人體細(xì)胞間質(zhì)、玻璃體、關(guān)節(jié)滑液等結(jié)締組織的主要成分。

4、透明質(zhì)酸作為人體的一種固有成分，以其獨(dú)特的分子結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)在機(jī)體生命活動(dòng)中顯示出多種重要的生理功能。具有維持細(xì)胞外空間、調(diào)節(jié)滲透壓、潤(rùn)滑關(guān)節(jié)、調(diào)節(jié)血管壁通透性、調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的擴(kuò)散及運(yùn)轉(zhuǎn)、促進(jìn)細(xì)胞修復(fù)及創(chuàng)傷愈合等多種生物學(xué)特性。

5、重組人膠原蛋白結(jié)構(gòu)中含有大量羥基化脯氨酸，它是形成穩(wěn)定三螺旋結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)，其優(yōu)良的生物學(xué)特性、組織相容性及生物可降解性，加之與透明質(zhì)酸一起構(gòu)成天然組織細(xì)胞外基質(zhì)(ecm)的主要組成成分，二者復(fù)配將會(huì)發(fā)揮更好的疊加/互補(bǔ)生物學(xué)作用。但是透明質(zhì)酸的聚陰離子性質(zhì)，在與重組人膠原蛋白復(fù)配成溶液或凝膠時(shí)產(chǎn)生絮狀沉淀(溶液出現(xiàn)沉淀，凝膠出現(xiàn)非均相絲狀物)，或者形成一種不穩(wěn)定體系，這種體系在放置過程中，要么出現(xiàn)絮狀沉淀(溶液)，要么出現(xiàn)凝膠分層/析水，或形成不溶性絮狀懸浮物，從而影響制劑產(chǎn)品在正常放置過程中的使用，特別是二者在復(fù)配成凝膠時(shí)，長(zhǎng)期放置，因出現(xiàn)凝膠析水現(xiàn)象，不再保持穩(wěn)定均一的凝膠體系。如何解決復(fù)配體系的穩(wěn)定性成為業(yè)界無法逾越的難題，大大限制了其在生物組織材料、注射填充、創(chuàng)面修復(fù)等領(lǐng)域的應(yīng)用。為解決這一難題，有研究者嘗試通過對(duì)膠原蛋白或透明質(zhì)酸進(jìn)行修飾的方法，或添加其他基團(tuán)進(jìn)行改性、或進(jìn)行不同程度的交聯(lián)，這只在一定程度上解決了二者的復(fù)配穩(wěn)定性問題，但又引出新的問題，如這些方法(對(duì)膠原蛋白)是在一定的強(qiáng)酸體系下進(jìn)行的，強(qiáng)酸體系容易導(dǎo)致膠原蛋白的變性，破壞其高級(jí)結(jié)構(gòu)，失去體內(nèi)生物學(xué)作用，或改性后一定程度上改變了其天然生物材料的特性，或采用交聯(lián)的方式，交聯(lián)后產(chǎn)生一定的交聯(lián)劑殘留，交聯(lián)劑具有臨床使用安全性的風(fēng)險(xiǎn)，或?qū)ν该髻|(zhì)酸進(jìn)行改性或交聯(lián)，改變了透明質(zhì)酸的天然理化特性、生物學(xué)特性及體內(nèi)代謝特性，失去其作為天然生物材料的優(yōu)勢(shì)。因此，找到一種重組iii型人膠原蛋白與透明質(zhì)酸或其鹽的復(fù)配方法及組成，以解決具有高級(jí)結(jié)構(gòu)的重組iii型人膠原蛋白與透明質(zhì)酸或其鹽的復(fù)配難題，得到可長(zhǎng)期維持穩(wěn)定且具有互補(bǔ)功能的膠原蛋白透明質(zhì)酸或其鹽凝膠十分必要。

6、本技術(shù)的發(fā)明人經(jīng)過大量實(shí)驗(yàn)探索重組人膠原蛋白與透明質(zhì)酸或其鹽的復(fù)配特性，驚奇地發(fā)現(xiàn)(1)重組iii型人膠原蛋白、透明質(zhì)酸或其鹽分別各自與其穩(wěn)定劑相混合，形成膠原蛋白混合液及透明質(zhì)酸或其鹽混合液，再將2種混合液復(fù)配；及(2)采用甘油、甘露醇作為膠原蛋白復(fù)合穩(wěn)定劑，且二者在一定比例時(shí)，及(3)采用甘油、甘露醇作為透明質(zhì)酸或其鹽穩(wěn)定劑，并與透明質(zhì)酸或其鹽保持一定比例時(shí)；及(4)采用磷酸鹽作為ph調(diào)節(jié)劑，預(yù)先將透明質(zhì)酸溶液調(diào)至ph值為7.0-7.5后再與重組iii型人膠原蛋白混合，可以實(shí)現(xiàn)膠原蛋白與透明質(zhì)酸或其鹽的穩(wěn)定復(fù)配，獲得高穩(wěn)定性的復(fù)配凝膠體系，為重組人膠原蛋白、透明質(zhì)酸或其鹽復(fù)配體系在醫(yī)美注射填充、復(fù)雜創(chuàng)面修復(fù)及愈合、組織材料領(lǐng)域的應(yīng)用開辟了一條新的路線。

7、在本技術(shù)的第一方面，本技術(shù)提出了一種重組iii型人膠原蛋白凝膠。根據(jù)本技術(shù)的實(shí)施例，所述重組iii型人膠原蛋白凝膠包括：第一溶液和第二溶液；其中，所述第一溶液包括重組iii型人膠原蛋白、第一穩(wěn)定劑和第一ph調(diào)節(jié)劑；所述第二溶液包括透明質(zhì)酸或其鹽、第二穩(wěn)定劑和第二ph調(diào)節(jié)劑；所述第一穩(wěn)定劑、第二穩(wěn)定劑各自獨(dú)立地選自甘油、甘露醇中的至少之一。根據(jù)本技術(shù)實(shí)施例的重組iii型人膠原蛋白凝膠具有較高的穩(wěn)定性，尤其具有較高的熱穩(wěn)定性。

8、在本技術(shù)的第二方面，本技術(shù)提出了一種重組iii型人膠原蛋白凝膠。根據(jù)本技術(shù)的實(shí)施例，所述重組iii型人膠原蛋白凝膠包括第一溶液和第二溶液，所述第一溶液和第二溶液的體積比為1：1；其中，

9、所述第一溶液包括重組iii型人膠原蛋白、甘油、甘露醇和naoh，所述重組iii型人膠原蛋白、甘油和甘露醇的重量比為(0.2～2.0):1.5:1.0，所述第一溶液的ph值為6.5～7.0；

10、所述第二溶液包括透明質(zhì)酸或其鹽、甘油、甘露醇和磷酸鹽溶液，所述透明質(zhì)酸或其鹽、甘油和甘露醇的重量比為(2.0～4.0):1.5:1.0，所述磷酸鹽溶液的ph值為11～12，所述第二溶液的ph值為7.0～7.5；

11、和/或，所述重組iii型人膠原蛋白凝膠包括第一溶液和第二溶液，所述第一溶液和第二溶液的體積比為1：1；其中，

12、所述第一溶液包括重組iii型人膠原蛋白、甘油、甘露醇和naoh，所述重組iii型人膠原蛋白、甘油和甘露醇的重量比為2.0:1.5:1.0，所述第一溶液的ph值為6.5～7.0；

13、所述第二溶液包括透明質(zhì)酸或其鹽、甘油、甘露醇和磷酸鹽溶液，所述透明質(zhì)酸或其鹽、甘油和甘露醇的重量比為(2.0～6.0):1.5:1.0，所述磷酸鹽溶液的ph值為11～12，所述第二溶液的ph值為7.0～7.5。根據(jù)本技術(shù)實(shí)施例的重組iii型人膠原蛋白凝膠具有較高的穩(wěn)定性，尤其具有較高的熱穩(wěn)定性。

14、在本技術(shù)的第三方面，本技術(shù)提出了一種制備上述的重組iii型人膠原蛋白凝膠的方法。根據(jù)本技術(shù)的實(shí)施例，所述方法包括：將重組iii型人膠原蛋白和第一穩(wěn)定劑進(jìn)行第一混合處理，采用第一ph調(diào)節(jié)劑對(duì)第一混合處理產(chǎn)物進(jìn)行ph調(diào)節(jié)，得到第一溶液；將透明質(zhì)酸或其鹽和第二穩(wěn)定劑進(jìn)行第二混合處理，采用第二ph調(diào)節(jié)劑對(duì)第二混合處理產(chǎn)物進(jìn)行ph調(diào)節(jié)，得到第二溶液；將所述第一溶液和第二溶液進(jìn)行第三混合處理，得到所述重組iii型人膠原蛋白凝膠。本技術(shù)的制備方法簡(jiǎn)單，制備過程中無需對(duì)膠原蛋白或透明質(zhì)酸鈉進(jìn)行交聯(lián)、修飾或改性，即可獲得穩(wěn)定的膠原蛋白、透明質(zhì)酸鈉凝膠，所用試劑均無細(xì)胞毒性、無致敏性等任何安全性風(fēng)險(xiǎn)，制備得到的重組iii型人膠原蛋白凝膠產(chǎn)品安全、無病毒隱患、不會(huì)發(fā)生二次感染或創(chuàng)面繼發(fā)性感染，尤其是不加交聯(lián)劑，不會(huì)產(chǎn)生因交聯(lián)劑殘留所致的過敏風(fēng)險(xiǎn)，也不會(huì)因?yàn)樾揎椇透男裕ツz原蛋白或透明質(zhì)酸鈉的天然材料特性，還具有良好的生物相容性、可降解性和高穩(wěn)定性，尤其是具有較高的熱穩(wěn)定性。

15、在本技術(shù)的第四方面，本技術(shù)提出了一種生物醫(yī)用材料。根據(jù)本技術(shù)的實(shí)施例，生物醫(yī)用材料包括上述的重組iii型人膠原蛋白凝膠或依據(jù)上述的方法制備得到的重組iii型人膠原蛋白凝膠。本技術(shù)的生物醫(yī)用材料可實(shí)現(xiàn)醫(yī)美注射的即刻填充，重塑皮膚ecm微環(huán)境，可促進(jìn)復(fù)雜創(chuàng)面的愈合和修復(fù)、重構(gòu)健康皮膚生態(tài)。

16、在本技術(shù)的第五方面，本技術(shù)提出了一種上述的重組iii型人膠原蛋白凝膠，依據(jù)上述的方法制備得到的重組iii型人膠原蛋白凝膠、或上述的生物醫(yī)用材料在產(chǎn)品中的用途，所述產(chǎn)品用于醫(yī)美注射填充，治療難愈性復(fù)雜創(chuàng)面。

17、本技術(shù)的附加方面和優(yōu)點(diǎn)將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本技術(shù)的實(shí)踐了解到。