本發(fā)明屬于生物工程，特別是涉及全反式視黃酸在制備牙源性干細(xì)胞成血管分化藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、2001年，牙髓再血管化引入牙髓病學(xué)中，2004年banchs和trope學(xué)者正式提出“牙髓血管再生”的概念。2007年，再生牙髓病學(xué)的概念提出，其定義為以生物學(xué)為基礎(chǔ)，采用組織工程原理，通過(guò)組織工程學(xué)技術(shù)促進(jìn)根管內(nèi)牙髓再生，旨在修復(fù)受損的牙齒組織，包括牙本質(zhì)、牙根及牙髓-牙本質(zhì)復(fù)合體，是牙髓再生治療的新方向和新選擇。

2、再生牙髓病學(xué)中，牙源性干細(xì)胞、生物支架和生長(zhǎng)因子是3個(gè)關(guān)鍵因素。其中牙源性干細(xì)胞作為種子細(xì)胞的來(lái)源，獲取途徑易得，具有較強(qiáng)的體外增殖能力和成牙本質(zhì)向、成血管向分化能力，體內(nèi)植入后具有形成牙髓組織的潛能。生物支架主要用于模擬細(xì)胞外基質(zhì)，提供細(xì)胞附著和增殖的場(chǎng)所，同時(shí)可負(fù)載多種藥物參與釋放生長(zhǎng)因子以引導(dǎo)干細(xì)胞的分化。近年來(lái)多種生物支架材料已被嘗試用于動(dòng)物模型和臨床前期研究，如水凝膠、殼聚糖、透明質(zhì)酸和膠原，結(jié)果表明其在體內(nèi)和體外均可以引導(dǎo)牙髓樣組織的再生。生長(zhǎng)因子的應(yīng)用是牙髓再生治療成功的重要因素之一。在牙髓組織發(fā)育過(guò)程中，大量的生長(zhǎng)因子如轉(zhuǎn)移性生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、血小板衍生生長(zhǎng)因子和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子等參與其中，精確地激活多條信號(hào)通路以調(diào)控干細(xì)胞在特定的時(shí)間和空間向不同的細(xì)胞譜系分化。

3、采用組織工程原理實(shí)現(xiàn)全牙髓再生的技術(shù)瓶頸在于使移植物內(nèi)部快速血管化并與根尖區(qū)血管床產(chǎn)生充分吻合。種子細(xì)胞無(wú)論以何種方式植入根管后均面臨高度缺氧和營(yíng)養(yǎng)受限的環(huán)境，使得遠(yuǎn)離根尖孔一側(cè)的細(xì)胞極易發(fā)生壞死。移植物內(nèi)部必須快速、充分地形成血管網(wǎng)絡(luò)才能使細(xì)胞存活，為其原位增殖、分化形成具有結(jié)構(gòu)和功能的牙髓組織提供物質(zhì)基礎(chǔ)。以往研究嘗試通過(guò)搭載外源性生長(zhǎng)因子(主要是血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子)來(lái)促進(jìn)種子細(xì)胞的原位血管化，由于其半衰期短，且需通過(guò)復(fù)雜的控釋系統(tǒng)進(jìn)行釋放，臨床應(yīng)用效果仍不確定。牙源性干細(xì)胞具有分泌促血管生成因子的活性，利用干細(xì)胞的這一特點(diǎn)促進(jìn)其自身在根管內(nèi)持續(xù)地成血管分化，有望解決牙髓再生療法中的快速血管重建難題。

4、然而，如何調(diào)控牙源性干細(xì)胞等種子細(xì)胞在高度營(yíng)養(yǎng)受限和缺氧等應(yīng)激條件下分泌促血管形成生長(zhǎng)因子的活性仍不清楚。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為解決上述現(xiàn)有技術(shù)中的至少部分技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明經(jīng)過(guò)深入研究，發(fā)現(xiàn)通過(guò)在血清饑餓環(huán)境中使用全反式視黃酸培養(yǎng)牙源性干細(xì)胞能夠促進(jìn)其成血管分化，從而解決牙髓再生過(guò)程中的快速血管重建難題。具體地，本發(fā)明包括以下內(nèi)容。

2、本發(fā)明的第一方面，提供全反式視黃酸或其類似物、衍生物在制備牙源性干細(xì)胞成血管分化藥物中的應(yīng)用。

3、在某些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明所述的應(yīng)用，其中，所述成血管分化包括以下情形中的至少之一：

4、(1)小管長(zhǎng)度、連接點(diǎn)數(shù)量、血管管腔體積和管腔數(shù)目至少之一增多；

5、(2)血管延伸長(zhǎng)度增加或出芽增多；

6、(3)加快血管生成速度；

7、(4)增加血管密度；

8、(5)血管調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)量或相關(guān)蛋白的量升高。

9、在某些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明所述的應(yīng)用，其中，所述血管調(diào)控相關(guān)基因包括vwf、ve-cadherin、hif1a、vegf中的至少一種。

10、在某些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明所述的應(yīng)用，其中，所述牙源性干細(xì)胞包括脫落乳牙牙髓干細(xì)胞、牙髓干細(xì)胞、根尖乳頭干細(xì)胞、牙周膜干細(xì)胞、牙齦干細(xì)胞中的至少一種。

11、在某些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明所述的應(yīng)用，其中，所述全反式視黃酸或其類似物、衍生物的濃度為0.01-2μm。

12、本發(fā)明的第二方面，提供一種用于成血管分化的種子細(xì)胞的制備方法，其包括：

13、(1)在無(wú)血清培養(yǎng)基中使用全反式視黃酸或其類似物、衍生物與牙源性干細(xì)胞接觸并培養(yǎng)；

14、(2)收集步驟(1)的培養(yǎng)物。

15、在某些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明所述的制備方法，其中，所述無(wú)血清培養(yǎng)基為包含0％胎牛血清和0.1-5％青鏈霉素的無(wú)血清mem-α培養(yǎng)基。

16、在某些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明所述的制備方法，其中，所述全反式視黃酸或其類似物、衍生物的濃度為0.01-2μm。

17、在某些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明所述的制備方法，其中，所述培養(yǎng)條件包括：溫度30-40℃、氧濃度15％-30％。

18、本發(fā)明的第三方面，提供一種調(diào)控牙源性干細(xì)胞成血管分化活性的方法，其包括在無(wú)血清培養(yǎng)基中使用全反式視黃酸或其類似物、衍生物與牙源性干細(xì)胞接觸并培養(yǎng)的步驟。

19、在某些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明所述的調(diào)控牙源性干細(xì)胞成血管分化活性的方法，其中，所述無(wú)血清培養(yǎng)基為包含0％胎牛血清和0.1-5％青鏈霉素的無(wú)血清mem-α培養(yǎng)基。

20、在某些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明所述的調(diào)控牙源性干細(xì)胞成血管分化活性的方法，其中，所述全反式視黃酸或其類似物、衍生物為0.01-2μm。

21、在某些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明所述的調(diào)控牙源性干細(xì)胞成血管分化活性的方法，其中，培養(yǎng)條件包括：溫度30-40℃、氧濃度15％-30％。

22、本發(fā)明經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，全反式視黃酸協(xié)同血清饑餓促進(jìn)人牙源性干細(xì)胞成血管向分化，具體表現(xiàn)為：(1)協(xié)同血清饑餓誘導(dǎo)成血管特異性基因(例如vwf、vegfr2、ve-cadherin等)的表達(dá)；(2)增強(qiáng)血清饑餓誘導(dǎo)的成血管相關(guān)基因的表達(dá)水平，例如hif1a、vegfa等。本發(fā)明通過(guò)rna高通量測(cè)序并基于kegg數(shù)據(jù)庫(kù)豐富了介導(dǎo)差異基因功能的顯著改變的通路，發(fā)現(xiàn)視黃酸信號(hào)通路為促進(jìn)牙源性干細(xì)胞在饑餓環(huán)境中成血管向分化的候選靶點(diǎn)并能夠應(yīng)用于組織工程再生牙髓治療中。

23、總之，本發(fā)明的研究結(jié)果表明，血清饑餓能夠誘導(dǎo)牙源性干細(xì)胞成血管向分化，并激活視黃酸信號(hào)通路。而且，全反式視黃酸能夠促進(jìn)人牙源性干細(xì)胞在血清饑餓環(huán)境中成血管向分化。

技術(shù)特征：

1.全反式視黃酸或其類似物、衍生物在制備牙源性干細(xì)胞成血管分化藥物中的應(yīng)用。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述成血管分化包括以下情形中的至少之一：

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述血管調(diào)控相關(guān)基因包括vwf、ve-cadherin、hif1a、vegf中的至少一種。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述牙源性干細(xì)胞包括脫落乳牙牙髓干細(xì)胞、牙髓干細(xì)胞、根尖乳頭干細(xì)胞、牙周膜干細(xì)胞、牙齦干細(xì)胞中的至少一種。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述全反式視黃酸或其類似物、衍生物的濃度為0.01-2μm。

6.一種用于成血管分化的種子細(xì)胞的制備方法，其特征在于，包括：

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述無(wú)血清培養(yǎng)基為包含0％胎牛血清和0.1-5％青鏈霉素的無(wú)血清mem-α培養(yǎng)基；

8.一種調(diào)控牙源性干細(xì)胞成血管分化活性的方法，其特征在于，包括在無(wú)血清培養(yǎng)基中使用全反式視黃酸或其類似物、衍生物與牙源性干細(xì)胞接觸并培養(yǎng)的步驟。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的調(diào)控牙源性干細(xì)胞成血管分化活性的方法，其特征在于，所述無(wú)血清培養(yǎng)基為包含0％胎牛血清和0.1-5％青鏈霉素的無(wú)血清mem-α培養(yǎng)基；

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的調(diào)控牙源性干細(xì)胞成血管分化活性的方法，其特征在于，培養(yǎng)條件包括：溫度30-40℃、氧濃度15％-30％。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開全反式視黃酸在制備牙源性干細(xì)胞成血管分化藥物中的應(yīng)用，其中成血管分化包括以下情形中的至少之一：小管長(zhǎng)度、連接點(diǎn)數(shù)量、血管管腔體積和管腔數(shù)目至少之一增多；血管延伸長(zhǎng)度增加或出芽增多；加快血管生成速度；血管密度增加；血管調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)量或相關(guān)蛋白的量升高。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)視黃酸信號(hào)通路為促進(jìn)牙源性干細(xì)胞在饑餓環(huán)境中成血管分化的候選靶點(diǎn)并能夠應(yīng)用于牙髓再生治療中，因此，本發(fā)明在牙髓再生治療領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用前景。

技術(shù)研發(fā)人員：鄧旭亮,張學(xué)慧,袁牧,李曉嬋,吳珂,皇文進(jìn)
受保護(hù)的技術(shù)使用者：北京大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/5/15