本發(fā)明涉及一種多層狀結(jié)構(gòu)的水凝膠人工血管及其制備方法，屬于生物醫(yī)學(xué)。

背景技術(shù)：

1、隨著世界人口的老齡化，心血管疾病成為目前全球人口死亡的主要原因。血管重建在臨床外科具有十分重要的地位。目前自體靜脈或動脈仍然是血管重建移植物的最佳選擇，但是人體自身血管極為有限，而異體血管移植物存在嚴(yán)重的免疫排斥反應(yīng)和其他術(shù)后并發(fā)癥。

2、目前臨床上使用的人工血管，如dacron或ptfe人工血管，已被廣泛用于大、中口徑動脈的修復(fù)。然而，由于小口徑(<6mm)血管移植物容易引起吻合口處血栓、內(nèi)膜過度增生、遠(yuǎn)期通暢性差等問題，至今仍難以應(yīng)用于臨床。因此小口徑人工血管的研發(fā)成為了當(dāng)務(wù)之急。

3、合成的高分子材料，如：聚己內(nèi)酯(pcl)、聚乳酸(pla)、聚乙醇酸(pga)、聚氨酯(pu)等，因其具有良好的加工性、機(jī)械性能穩(wěn)定性、生物可降解性、無毒性等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于組織工程sdvgs的制備。然而，缺乏細(xì)胞識別生物活性位點(diǎn)的特性限制了它們在血管組織工程中的應(yīng)用。

4、動物組織來源細(xì)胞外基質(zhì)(ecm)中含有多種生長因子和活性肽，包括結(jié)構(gòu)蛋白、糖胺聚糖和對組織的維持和修復(fù)具有重要意義的小分子。ecm來源的生物材料具有支持細(xì)胞生長的潛力，并能通過提供接近天然組織的微環(huán)境來觸發(fā)再生過程，因此ecm被廣泛應(yīng)用于組織工程血管的構(gòu)建。動脈血管ecm中的彈力纖維雖然能為血管提供良好的力學(xué)支撐，但其降解緩慢且排列致密，限制了受體細(xì)胞的浸潤影響遠(yuǎn)期血管再生，且部分ecm材料機(jī)械性能較差難以承受體內(nèi)周期性血壓。

5、為了解決上述問題，已有研究者們將細(xì)胞外基質(zhì)來源的材料復(fù)合到可降解高分子支架材料上，中國專利申請cn?110201223?a公開了一種可降解合成高分子與天然細(xì)胞外基質(zhì)復(fù)合材料、人工血管及其制備方法，其將合成高分子和去細(xì)胞外基質(zhì)混合后，先制備人工血管內(nèi)層，再在內(nèi)層上繼續(xù)制備人工血管外層，再經(jīng)定型形成人工血管。其工藝過程繁瑣，且其天然細(xì)胞外基質(zhì)是無差別地分布在血管材料結(jié)構(gòu)中，并沒有充分考慮不同結(jié)構(gòu)、組成的天然細(xì)胞外基質(zhì)的天然優(yōu)勢，且其孔狀結(jié)構(gòu)需要添加一定的致孔劑，這對于人工血管的生物安全性來說是不利的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對現(xiàn)有技術(shù)小口徑人工血管制備技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的第一個目的是在于提供一種多層狀結(jié)構(gòu)的水凝膠人工血管，該人工血管基于血管細(xì)胞外基質(zhì)水凝膠協(xié)同多層狀結(jié)構(gòu)，為人工血管提供了良好的自我愈合功能，且通過高分子材料纖維和血管細(xì)胞外基質(zhì)水凝膠復(fù)合，綜合調(diào)節(jié)了人工血管的降解速度，使得人工血管的層級降解過程和組織再生能夠相匹配，提高了人工血管的生物相容性。

2、本發(fā)明的第二個目的是在于提供一種多層狀結(jié)構(gòu)的水凝膠人工血管的制備方法，通過將靜電紡絲-靜電噴霧技術(shù)與ecm自組裝凝膠化相結(jié)合，一步形成多層狀結(jié)構(gòu)，同時在凝膠化的過程中載入藥物，綜合控制了人工血管的空間結(jié)構(gòu)、藥物負(fù)載能力和降解速度。

3、為了實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)目的，本發(fā)明提供了一種多層狀結(jié)構(gòu)的水凝膠人工血管，其橫截面具有多層狀結(jié)構(gòu)，所述多層狀結(jié)構(gòu)是由高分子材料纖維分散在血管細(xì)胞外基質(zhì)水凝膠中構(gòu)成；所述血管細(xì)胞外基質(zhì)水凝膠通過天然血管外膜脫細(xì)胞基質(zhì)在肝素溶液中自組裝形成。

4、本發(fā)明的人工血管關(guān)鍵在于采用了天然血管外膜脫細(xì)胞基質(zhì)。天然動脈血管是三層結(jié)構(gòu)，每層的ecm機(jī)構(gòu)和組成都存在差異。內(nèi)膜層很薄，人體動脈內(nèi)膜厚度一般在100～200μm左右，可獲取的ecm較少；中膜層結(jié)構(gòu)致密，含有大量的彈性纖維形成多層彈性膜，且難以通過溫和的化學(xué)方法溶解?，F(xiàn)有技術(shù)中大多是利用天然血管內(nèi)膜和中膜層的功能性來分別構(gòu)建人工血管的內(nèi)層或中層，而忽視了天然血管外膜層的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。發(fā)明人通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，天然血管外膜層結(jié)構(gòu)疏松，且其蛋白質(zhì)組成以豐富的膠原蛋白為主還含有豐富的糖胺聚糖，如透明質(zhì)酸等，而彈性纖維相對內(nèi)膜和中膜較少，其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和蛋白質(zhì)構(gòu)成可以使得發(fā)明人采用更溫和的去細(xì)胞方案獲得ecm蛋白質(zhì)和更容易的將ecm溶解，且更重要的是，天然血管外膜的ecm中膠原蛋白和自組裝能力相關(guān)蛋白要顯著大于血管內(nèi)膜層和中膜層，只有使用天然血管外膜脫細(xì)胞基質(zhì)時才能形成本發(fā)明的水凝膠基質(zhì)，為人工血管提供良好的自我修復(fù)能力。

5、本發(fā)明的人工血管充分模擬了天然血管的結(jié)構(gòu)和力學(xué)特點(diǎn)，該人工血管選擇高強(qiáng)度的可降解的高分子材料作為支撐材料，以天然血管外膜脫細(xì)胞基質(zhì)作為水凝膠組分構(gòu)建材料，顯著提高了人工血管的生物相容性，有助于人工血管在宿主體內(nèi)的再生與重建。與此同時，本發(fā)明人工血管的多層狀結(jié)構(gòu)具有防止血液滲漏和提供細(xì)胞浸潤生長空間的作用。且血管細(xì)胞外基質(zhì)水凝膠有自我修復(fù)能力，在生理?xiàng)l件下可以自我修復(fù)，有利于血管移植后減少出血情況，同時，血管細(xì)胞外基質(zhì)水凝膠具有良好的生物降解性，而高分子材料的降解速度相對緩慢，使得人工血管表現(xiàn)為層級降解，這種層級降解過程和組織再生能夠更加匹配。而血管細(xì)胞外基質(zhì)水凝膠自組裝過程中載入的肝素藥物可以為人工血管提供良好的抗血栓能力。

6、作為一種優(yōu)選的方案，所述天然血管外膜脫細(xì)胞基質(zhì)包括動脈外膜、靜脈外膜、大隱靜脈外膜、臍動脈外膜和臍靜脈外膜中的至少一種。采用本發(fā)明所優(yōu)選的血管外膜中膠原蛋白含量高，彈性纖維少，兼具較高的自組裝能力和可降解能力。所述外膜來源于動物或人類捐獻(xiàn)者，其中動物包括但不限于牛、羊、豬等。

7、作為一種優(yōu)選的方案，所述人工血管中血管細(xì)胞外基質(zhì)水凝膠和高分子材料纖維的質(zhì)量比為(2～8)：8。本發(fā)明所優(yōu)選的血管細(xì)胞外基質(zhì)水凝膠和高分子材料纖維質(zhì)量比的人工血管能同時具有多層狀水凝膠結(jié)構(gòu)和自我愈合能力。當(dāng)高分子材料纖維用量高于該比例時人工血管呈纖維結(jié)構(gòu)會失去自我愈合能力，而低于該比例時人工血管力學(xué)性能明顯下降而低于臨床應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)。進(jìn)一步優(yōu)選，所述人工血管中血管細(xì)胞外基質(zhì)水凝膠和高分子材料纖維的質(zhì)量比為(6～8)：8。

8、作為一種優(yōu)選的方案，所述人工血管直徑為0.5～20mm，厚度為0.1～2mm。本發(fā)明所提供的人工血管為小口徑人工血管，擴(kuò)展了其臨床應(yīng)用范圍。

9、作為一種優(yōu)選的方案，所述高分子材料包括聚己內(nèi)酯(pcl)、聚丙交酯(pla)、聚乙醇酸(pga)、聚癸二酸甘油酯(pgs)、聚(丙交酯-己內(nèi)酯)共聚物(plcl)和聚氨基甲酸酯(pu)中的至少一種。

10、本發(fā)明還提供了一種多層狀結(jié)構(gòu)的水凝膠人工血管的制備方法，該方法包括以下步驟：

11、s1，用含有青霉素和鏈霉素的無菌pbs溶液沖洗天然血管外膜組織后，分別采用高滲氯化鈉-乙二胺四乙酸溶液、低滲氯化鈉-乙二胺四乙酸溶液浸泡處理，再使用dnase?i酶消化，冷凍干燥后，得到天然血管外膜脫細(xì)胞基質(zhì)；

12、s2，將天然血管外膜脫細(xì)胞基質(zhì)與六氟異丙醇混合，得到ecm溶液；將高分子材料溶解于有機(jī)溶劑中，得到高分子溶液；

13、s3，將ecm溶液和高分子溶液分別注入兩個注射器，ecm溶液采用靜電噴霧，高分子溶液采用靜電紡絲，兩種方法同步進(jìn)行，在接收器得到人工血管復(fù)合前體；

14、s4，所述人工血管前體風(fēng)干后置于肝素溶液中自組裝凝膠化，即得。

15、本發(fā)明充分利用血管外膜的結(jié)構(gòu)和組成特點(diǎn)，應(yīng)用溫和的去細(xì)胞方案獲得細(xì)胞外基質(zhì)，并直接采用六氟異丙醇將天然血管外膜脫細(xì)胞基質(zhì)溶解。同時，本發(fā)明創(chuàng)新性的同時采用靜電噴霧和靜電紡絲形成復(fù)合材料，在s3的過程中，高分子材料通過靜電紡絲會形成纖維狀材料，而ecm則經(jīng)靜電噴霧形成顆粒狀物質(zhì)，并均勻負(fù)載于高分子纖維材料表面。由于靜電紡絲和靜電噴霧過程的連續(xù)性，最終獲得的人工血管復(fù)合前體呈現(xiàn)出獨(dú)特的“高分子纖維-ecm顆粒-高分子纖維-ecm顆粒-高分子纖維-…”交替排列的多層夾芯結(jié)構(gòu)。此外，得益于天然血管外膜脫細(xì)胞基質(zhì)優(yōu)異的自組裝特性，該材料在肝素溶液中會自組裝形成水凝膠同時實(shí)現(xiàn)肝素的有效負(fù)載，最終得到多層狀結(jié)構(gòu)的人工血管。

16、作為一種優(yōu)選的方案，所述s1中，所述高滲氯化鈉-乙二胺四乙酸溶液中氯化鈉濃度為1.1～5wt％，乙二胺四乙酸濃度為0.02～0.05wt％；所述低滲氯化鈉-乙二胺四乙酸溶液中氯化鈉濃度為0.1～0.7wt％，乙二胺四乙酸濃度為0.02～0.05wt％。

17、作為一種優(yōu)選的方案，s2中，所述有機(jī)溶劑為二氯甲烷、六氟異丙醇、乙醇和丙酮中的至少一種。

18、作為一種優(yōu)選的方案，所述ecm溶液中天然血管外膜脫細(xì)胞基質(zhì)的濃度為0.001～1.0g/ml；所述高分子溶液的中高分子材料的濃度為0.01～1.0g/ml。本發(fā)明中ecm溶液和高分子溶液的濃度均比較小，這是因?yàn)椴捎梦⒘康膃cm更有利于促進(jìn)自組裝形成水凝膠。

19、作為一種優(yōu)選的方案，所述靜電噴霧的條件為：電壓為6～18kv，ecm溶液流速為0.8～8ml/h，接收速度1000～6000rpm、接收時長10～120min；

20、作為一種優(yōu)選的方案，所述靜電紡絲的條件為：電壓為6～12kv，高分子溶液流速為0.1～0.8ml/h，接收速度1000～6000rpm、接收時長10～120min。

21、制備過程中兩種溶液流速決定人工血管中ecm水凝膠和高分子材料纖維的比例，從而影響人工血管的結(jié)構(gòu)和性能。

22、本發(fā)明通過控制天然血管外膜脫細(xì)胞基質(zhì)、高分子材料的濃度以及靜電噴霧和靜電紡絲過程中溶液的流速可以綜合控制人工血管的空間結(jié)構(gòu)及水凝膠與高分子材料的比例，進(jìn)而綜合控制人工血管的自愈能力和層級降解速度。

23、進(jìn)一步地，所述電噴-靜電紡絲技術(shù)按照如下方式進(jìn)行：將ecm溶液和高分子溶液分別裝入兩個注射器中，將注射器分別安裝在兩個微量注射泵上，分別調(diào)整兩個注射泵速度、接收器直徑、接收器轉(zhuǎn)速、接收器距離等條件來調(diào)控ecm溶液和高分子溶液的電噴-電紡絲過程，調(diào)節(jié)所獲得人工血管的細(xì)胞外基質(zhì)與合成材料比例、血管直徑、表面孔隙率、孔隙大小、空間結(jié)構(gòu)和表面形貌，制備結(jié)束后，將人工血管自然風(fēng)干，從而制得多層狀結(jié)構(gòu)的水凝膠人工血管。

24、作為一種優(yōu)選的方案，所述自組裝凝膠化的條件為：肝素溶液的濃度為0.5～2mg/ml，溫度為30～40℃，ph為7.3～7.5，時間為2～4h。在本發(fā)明所選的凝膠化條件下，所得到的人工血管具有最佳的綜合性能。適當(dāng)提高肝素溶液的濃度不僅有利于提高復(fù)合材料的抗凝血性能，同時可以促進(jìn)ecm的自組裝過程，有利于形成更穩(wěn)定的水凝膠結(jié)構(gòu)。

25、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：

26、1、本發(fā)明充分模擬天然血管的結(jié)構(gòu)和力學(xué)特點(diǎn)，選擇高強(qiáng)度的可降解合成高分子材料作為支撐材料，天然血管外膜脫細(xì)胞基質(zhì)作為水凝膠組分構(gòu)建材料，顯著提高了人工血管的生物相容性，有助于人工血管在宿主體內(nèi)的再生與重建。兩種材料采用靜電紡絲結(jié)合靜電噴霧技術(shù)構(gòu)建人工血管前體，可調(diào)節(jié)兩種材料的比例和人工血管空間結(jié)構(gòu)，提供了一種多層狀結(jié)構(gòu)的小口徑人工血管。

27、2、本發(fā)明充分利用血管外膜的結(jié)構(gòu)和組成特點(diǎn)，應(yīng)用溫和的去細(xì)胞方案獲得天然血管外膜脫細(xì)胞基質(zhì)。直接采用六氟異丙醇將血管外膜溶解，同時采用靜電噴霧和靜電紡絲構(gòu)建人工血管前體。在肝素溶液中通過自組裝方式凝膠化同時負(fù)載抗凝劑肝素，賦予了材料抗血栓能力。

28、3、本發(fā)明所采用的血管細(xì)胞外基質(zhì)水凝膠具有優(yōu)異的自我修復(fù)能力，在生理?xiàng)l件下可以自我修復(fù)，有利于人工血管移植后減少出血情況。且血管細(xì)胞外基質(zhì)水凝膠有良好的生物降解性，聚合材料相對緩慢的降解速度，使得人工血管的層級降解過程和組織再生能夠相匹配。

29、4、本發(fā)明的血管細(xì)胞外基質(zhì)水凝膠含有多種血管再生相關(guān)蛋白組分，可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞黏附和增值、平滑細(xì)胞成熟和細(xì)胞外基質(zhì)重建，有助于人工血管在體內(nèi)的重建。

30、5、本發(fā)明無需分步制備血管內(nèi)層、中層和外層以形成層狀結(jié)構(gòu)，且在凝膠化過程中即可實(shí)現(xiàn)肝素藥物的負(fù)載，大大簡化了工藝過程和提高了藥物的利用率。