葉酸受體靶向超聲造影納米微泡及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種靶向納米微泡，該納米微泡可以通過被動和主動兩種靶向效應準 確定位到葉酸受體高表達的腫瘤細胞，并被腫瘤細胞攝取，從而實現(xiàn)該腫瘤細胞的特異性 超聲分子成像，本發(fā)明還涉及該納米微泡的制備方法，屬于醫(yī)療藥物領域。
【背景技術】
[0002] 超聲檢查由于其無創(chuàng)無輻射、操作方便、價格低廉、對設備場地要求低等優(yōu)勢，是 臨床診斷腫瘤的重要手段，超聲造影在多年的臨床應用中已經(jīng)證實在腫瘤的檢出和定性診 斷中有著重要的意義。超聲造影優(yōu)于常規(guī)造影，與CT、MRI相比擁有更多的優(yōu)越性。安全高 效的超聲造影劑是超聲造影的基礎與關鍵，目前臨床常用的是二代微泡造影劑SonoVue即 脂質(zhì)微泡造影劑，但長期的臨床實踐發(fā)現(xiàn)其對腫瘤組織的特異性不強，對病變組織缺乏親 和力，并且由于微泡粒徑大多集中在2?10iim范圍內(nèi)（平均粒徑為3?5iim)，而毛細血 管內(nèi)皮間隙約為380?780nm，因此微米級微泡是無法穿透血管內(nèi)皮間隙而到達腫瘤組織 中，實際為微血管的非特異性顯影，缺乏血管外腫瘤組織細胞的特異性；盡管多數(shù)腫瘤的血 供豐富，然而對于乏血供的腫瘤就容易漏檢，這大大限制了聲學顯像對于腫瘤鑒別診斷的 效能。
[0003] 近來研究者們開始了靶向超聲微泡（第三代微泡造影劑）的研究，靶向超聲造影 劑是將特異性抗體或配體連接到聲學造影劑表面，依靠抗原-抗體/配體-受體之間特異 性識別并結合，通過血液循環(huán)積聚到帶有相應抗原/受體的靶器官或靶組織，從而使器官 或組織在超聲檢查中得到特異性增強。與普通微泡相比，靶向超聲造影通過特異性作用于 病變區(qū)生物分子組成成分，來突出顯示病變部位，從而提高超聲診斷的準確性與敏感性。
[0004] 研究表明，腫瘤細胞膜表面或腫瘤供應血管表面存在著一些受體并在腫瘤組織中 存在異常表達，與相應配體或配體類似物能特異結合。受體與配體的結合具有特異性、選擇 性、飽和性、親合力強和生物效應明顯的特點，為腫瘤的靶向診治提供了靶向途徑。其中葉 酸受體（folatereceptor,FR)是目前研究較多的一種，其是一種糖基化磷脂酰肌醇（GPI) 連接的膜糖蛋白，與葉酸（FA)具有高親和力，可通過受體介導的內(nèi)吞作用將葉酸（FA)攝入 細胞胞漿。葉酸受體（FR)在正常組織中的表達高度保守，F(xiàn)Ra主要在上皮細胞系腫瘤（如 卵巢癌、結直腸癌、子宮內(nèi)膜癌、睪丸癌、腦瘤、肺腺癌等）中高水平表達。雖然在正常細胞 中FR可選擇性的表達在細胞表面但是其呈極性分布，血液循環(huán)中的靶向制劑不能接近該 受體，亦不能進入正常細胞，而惡性腫瘤細胞中FR分布失去極性，血液循環(huán)中的靶向制劑 可接觸該受體。與大分子抗體相比，葉酸（FA)屬于小分子物質(zhì)，F(xiàn)A-FR的配體/受體結合 具有高親和力（Kd= 10-10mol/L)，化學性質(zhì)簡單，易于修飾，體積?。∕r= 441. 4)，高度化 學穩(wěn)定性和生物學穩(wěn)定性，與有機溶劑的生理相容性，低免疫原性，達到靶點時間短、血液 清除速度快、穿透能力強、低成本等諸多優(yōu)點，使得FA成為腫瘤診斷和治療理想的靶向載 體之一，并且FA的靶向作用已經(jīng)在核素PET-CT、MRI的靶向顯像中得到證實。
[0005] 經(jīng)檢索，利用有序超分子膜層層自組裝原理，構建葉酸受體介導的靶向納米超聲 造影劑未見文獻報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術問題是針對上述的技術現(xiàn)狀而提供一種新型應用于腫瘤 細胞超聲分子成像的葉酸受體靶向超聲造影納米微泡。
[0007] 本發(fā)明所要解決的又一個技術問題是針對上述的技術現(xiàn)狀而提供一種新型應用 于腫瘤細胞超聲分子成像的葉酸受體靶向超聲造影納米微泡的制備方法。
[0008] 本發(fā)明解決上述技術問題所采用的技術方案為：一種葉酸受體靶向超聲造影納米 微泡，該納米微泡由核心模板和外殼構成，其特征在于所述的核心模板為液態(tài)氟碳納米乳 化劑，所述的外殼為葉酸接枝聚乙二醇化殼聚糖衍生物，
[0009] 所述的液態(tài)氟碳納米乳化劑包括如下組分及質(zhì)量體積百分比濃度：
[0010] 全氟辛溴烷2.895%?4.825%; 甘油 2.25%?2.5%; 泊洛沙姆]88 0.4%~0.8%； 油酸 0.15%?0.25%; 蛋黃卵磷脂2.2%?2,6%; 其余為水。
[0011] 一種葉酸受體靶向超聲造影納米微泡的制備方法，其特征在于包括如下步驟：
[0012] ①將甘油、泊洛沙姆188、油酸、蛋黃卵磷脂及超純水混合配成乳化劑混懸液，將全 氟辛溴烷加入到乳化劑混懸液渦旋混合后，在超聲波作用下，形成核心模板材料；
[0013] ②配置葉酸接枝聚乙二醇化殼聚糖衍生物，形成外殼材料；
[0014] ③將核心模板材料逐滴加入到外殼材料中并磁力旋轉攪拌，離心，純化水洗，滅 菌，過濾，得到產(chǎn)物。
[0015] 進一步，步驟①中所述的核心模板材料通過如下步驟制得：
[0016] 將甘油、泊洛沙姆188、油酸及蛋黃卵磷脂渦旋混合于超純水中形成混懸液，該混 懸液在30?40°C條件下孵育0. 5小時至1. 5小時，形成乳狀液；再渦旋混合下逐滴加入全 氟辛溴烷，定容，超聲，離心，獲得納米乳化劑。
[0017] 作為優(yōu)選，所述超聲滿足如下條件：超聲用時5?15分鐘，超聲啟動5?15秒，間 隔時間5?15秒，超聲溫度20?30°C。
[0018] 進一步，步驟②中所述的外殼材料通過如下步驟制得：
[0019]將葉酸（250?300mg)、N,N'-二環(huán)己基碳二亞胺（230?250mg)、N-輕基丁二酰 亞胺（120?150mg)共同溶解于二甲基亞諷（5?6ml)中，20?30°C下反應6?8小時， 生成葉酸活性酯，過濾去除沉淀，備用；
[0020] 將a-羧基-(〇-氨基聚乙二醇（0.8?1.2g)添加到上述的葉酸活性酯中，形成 羧基-聚乙二醇-葉酸；
[0021] 將羧基_聚乙二醇-葉酸在無水嘧啶中孵育2?4小時，透析24?30小時，超純 水透析48?50小時；過濾去除不溶物，冰凍干燥獲得產(chǎn)物羧基-聚乙二醇-葉酸；
[0022] 將殼聚糖（200?250mg)溶解于重量百分比為2%的醋酸水溶液（20?25ml)中， 獲得殼聚糖醋酸水溶液，備用；
[0023] 將羧基-聚乙二醇-葉酸（200?250mg)、l_ (3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞 胺鹽酸鹽（20?25mg)、N-輕基丁二酰亞胺（10?15mg)溶解于二甲基亞砜中，預激活4? 6小時，然后逐滴加入到前述的殼聚糖醋酸水溶液中，暗室中攪拌20?24小時直至反應完 成，生成的產(chǎn)物超純水透析72?80小時，脫水，冷凍真空干燥制得葉酸-聚乙二醇-殼聚 糖干粉；
[0024] 用無水乙醇配制濃度為10mg/ml的異硫氰酸突光素溶液10?15ml，嫁接于合成 的葉酸-聚乙二醇-殼聚糖作為熒光示蹤劑，2 %醋酸水溶液配制濃度為4?6mg/ml的 葉酸-聚乙二醇-殼聚糖，磁力攪拌下將上述異硫氰酸熒光素溶液逐滴加入到制備的葉 酸-聚乙二醇-殼聚糖的醋酸水溶液中，避光反應2?3h，使兩者結合完成熒光標記，pH 調(diào)整為9. 0,離心去除上清，2%醋酸水溶液重懸至20ml，重復多次離心至上清無色，最后用 1 %的醋酸水溶液重懸沉淀，4-6°C葉酸-聚乙二醇-殼聚糖避光保存?zhèn)溆谩?br>[0025] 進一步，所述步驟③如下：
[0026] 取制備的異硫氰酸熒光素-殼聚糖-聚乙二醇-葉酸醋酸水溶液用lmol/L的氫 氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至5. 5?6. 5,取核心模板材料（2?3ml)，磁力攪拌下緩慢滴加入異硫 氰酸熒光素-殼聚糖-聚乙二醇-葉酸醋酸水溶液中，攪拌，36?38 °C孵育25?35mim， 15000rpm?16000rpm高速冷凍離心（冷凍同時離心），沉淀超純水清洗，滅菌，過濾去除雜 質(zhì)
[0027] 與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于：以液態(tài)氟碳納米乳化劑為核心模板，以葉酸 接枝聚乙二醇化殼聚糖衍生物為外殼獲得的納米微泡具有穩(wěn)定性較佳、無體外毒性作用、 靜脈注射生物相容性較好、具有較高特異性結合力的優(yōu)點。<