一種載有表皮生長因子的透明質(zhì)酸-殼聚糖微球及其制備方法和應用
【技術領域】：
[0001] 本發(fā)明設計一種載有表皮生長因子的透明質(zhì)酸-殼聚糖微球及其制備方法和以 其為活性成分的藥物組合物應用。
【背景技術】：
[0002] 燒傷是目前所有疾病中痛苦最大、治療難度最高的疾病之一。目前在燒傷治療領 域占有統(tǒng)治地位的治療體系是以促進創(chuàng)面干燥結(jié)痂，再進行切痂植皮的局部治療，結(jié)合抗 休克、抗感染、營養(yǎng)支持等全身治療。這種治療方法大大降低了大面積燒傷的死亡率，但存 在著患者痛苦大、瘢痕發(fā)生率高、醫(yī)療費用高等嚴重的弊端。因此，尋找新的治療方法和藥 物有著積極意義。在燒傷等所導致的皮膚嚴重缺損及創(chuàng)面的愈合中，以適宜的敷料(含藥或 不含藥）對創(chuàng)面進行迅速覆蓋是非常重要的，可以起到減少創(chuàng)面的體液和蛋白質(zhì)流失，防止 細菌感染及繼發(fā)的組織損傷的作用，在某些情況下，還可為增殖細胞提供支架，促進創(chuàng)面愈 合。最近20年來，這已成為嚴重燒傷等創(chuàng)傷修復領域的研究熱點方向。
[0003] 表皮生長因子（epidermal growth factor,EGF)是創(chuàng)傷修復中涉及的多種生長因 子之一。已有的研究表明，EGF是多種細胞分裂增殖的刺激原，可以促進創(chuàng)面細胞遷移，使 肉芽組織生長加快，肉芽內(nèi)DNA、RNA、膠原纖維、透明質(zhì)酸等成分增多。EGF能夠刺激創(chuàng)傷愈 合所依賴的角蛋白細胞的增殖和遷移。動物和臨床研究均表明，EGF可以明顯促進創(chuàng)面愈 合，尤其對一些難愈合創(chuàng)面作用更佳。國內(nèi)外已有的EGF給藥系統(tǒng)包括軟膏、噴霧劑、注射 劑及緩控釋系統(tǒng)等。由于表皮生長因子的半衰期短，在創(chuàng)傷面其與細胞的接觸時間較短，而 且加上其本身的不穩(wěn)定性和創(chuàng)面存在的蛋白酶的降解作用，往往會使表皮生長因子失活較 快，實際作用時間有限。因此，臨床上采用多次給藥的方式，但這樣不利于患者的順應性又 增加了經(jīng)濟負擔。而由多孔可降解基質(zhì)包封表皮生長因子形成的微球，既可達到表皮生長 因子的持續(xù)釋放，刺激創(chuàng)面細胞增殖，又可為增殖細胞提供吸附介質(zhì)，是表皮生長因子給藥 系統(tǒng)的首選。
[0004] 目前制備蛋白或多肽類藥物的緩釋微球的方法有乳化溶劑揮發(fā)法、交聯(lián)聚合法、 噴霧干燥法等。對于乳化溶劑揮發(fā)法、交聯(lián)聚合法，在制備時需用到有機溶劑或者交聯(lián)劑， 一方面會造成環(huán)境污染，另一方面成品中存在有機溶劑或者交聯(lián)劑殘留。噴霧干燥法雖然 可以不使用有機溶劑，但是干燥溫度一般較高，易引起蛋白或多肽藥物變性。
[0005] 殼聚糖和透明質(zhì)酸都為天然可降解高分子材料，均具有良好的生物相容性，因此 常被用于制備各種給藥系統(tǒng)的載體。在燒傷早期外敷殼聚糖粉末，能夠阻止燒傷早期的損 傷加重，對燒傷創(chuàng)面組織有顯著的保護作用，能夠明顯減輕甚至逆轉(zhuǎn)損傷程度。以透明質(zhì) 酸配以適量輔料制成的散劑能夠吸收燒傷創(chuàng)面滲出液，有效地保護、封閉創(chuàng)面，減輕創(chuàng)面水 腫，具有抑制疤痕組織形成及促進燒傷創(chuàng)面愈合的功能。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0006] 本發(fā)明提供一種環(huán)保、簡便的表皮生長因子緩釋微球制備方法，制備的載有表皮 生長因子的透明質(zhì)酸-殼聚糖微球，可實現(xiàn)表皮生長因子在燒燙傷創(chuàng)面的持續(xù)釋放，促進 創(chuàng)面細胞增殖，同時也發(fā)揮玻璃酸鈉和殼聚糖對燒燙傷組織的保護作用及促創(chuàng)傷愈合作 用，并為創(chuàng)面增殖細胞提供支架，從而獲得一種良好的燒燙傷治療藥物。
[0007] 本發(fā)明所提供的載有表皮生長因子的透明質(zhì)酸-殼聚糖微球，通過在保護劑作用 下離子聚合、離心沉淀、純化、凍干而得，具體制備方法如下：
[0008] ( 1)將透明質(zhì)酸、三聚磷酸鈉、表皮生長因子溶解于水中。
[0009] (2)將殼聚糖溶解于水中。
[0010] (3)將步驟（1)和步驟（2)中得到的溶液進行攪拌混合，得到含有透明質(zhì)酸-殼聚 糖微球的混懸液。
[0011] (4)將上述步驟（3)中得到的混懸液離心，棄去上清液，收集沉淀。
[0012] (5)將上述步驟（4)得到的沉淀加入純化水，振搖分散。
[0013] (6)將上述步驟（5)得到的混懸液離心，棄去上清液，收集沉淀。
[0014] (7)將沉淀凍干除去水分，得成品。
[0015] 所述的載有表皮生長因子的透明質(zhì)酸-殼聚糖微球，表皮生長因子在微球中的質(zhì) 量百分比為0. 01%~10%。
[0016] 所述的載有表皮生長因子的透明質(zhì)酸-殼聚糖微球，透明質(zhì)酸和殼聚糖的質(zhì)量比 例為透明質(zhì)酸：殼聚糖=1:3~1:9。
[0017] 所述的載有表皮生長因子的透明質(zhì)酸-殼聚糖微球，殼聚糖具有分子量低、脫乙 酰度高的特點。
[0018] 所述的載有表皮生長因子的透明質(zhì)酸-殼聚糖微球，殼聚糖的脫乙酰度大于70%， 優(yōu)選80%~95%。
[0019] 所述的載有表皮生長因子的透明質(zhì)酸-殼聚糖微球，殼聚糖的平均相對分子質(zhì)量 小于0.2父10 6，優(yōu)選小于0.1父106。
[0020] 所述載有表皮生長因子的透明質(zhì)酸-殼聚糖微球的制備方法，步驟（1)中的透明 質(zhì)酸濃度為〇· lmg/ml~0· 5mg/ml。
[0021] 所述載有表皮生長因子的透明質(zhì)酸-殼聚糖微球的制備方法，步驟（1)中的三聚 憐酸鈉濃度為〇· 〇lmg/ml~0· lmg/ml。
[0022] 所述載有表皮生長因子的透明質(zhì)酸-殼聚糖微球的制備方法，步驟（2)中的殼聚 糖濃度為 〇· 5mg/ml ~3. Omg/ml。
[0023] 所述載有表皮生長因子的透明質(zhì)酸-殼聚糖微球的制備方法，步驟（3)中的兩種 溶液的混合體積比例為步驟（1)得到的溶液：步驟（2)中得到的溶液=1:0. 5~1:2。
[0024] 所述載有表皮生長因子的透明質(zhì)酸-殼聚糖微球的制備方法，步驟（3)中的兩 種溶液的加入順序為將步驟（1)得到的溶液加入到步驟（2)中得到的溶液，加入時間為 IOmin ~30min〇
[0025] 所述載有表皮生長因子的透明質(zhì)酸-殼聚糖微球的制備方法，步驟（3)中的兩種 溶液的攪拌混合時間為IOmin~60min，混合轉(zhuǎn)速為60轉(zhuǎn)/分鐘~1000轉(zhuǎn)/分鐘，混合溫 度為室溫。
[0026] 所述載有表皮生長因子的透明質(zhì)酸-殼聚糖微球的制備方法，步驟（4)和步驟（6) 中的離心過程中離心力為5000g~20000g。
[0027] 所述載有表皮生長因子的透明質(zhì)酸-殼聚糖微球的制備方法，步驟（4)和步驟（6) 中的離心時間為15min~60min。
[0028] 所述載有表皮生長因子的透明質(zhì)酸-殼聚糖微球的制備方法，步驟（5)中加入純 化水的數(shù)量為步驟（4)中收集沉淀質(zhì)量的10倍~50倍。
[0029] 所述載有表皮生長因子的透明質(zhì)酸-殼聚糖微球的制備方法，步驟（5)和步驟（6) 中的目的為純化所得透明質(zhì)酸-殼聚糖微球，去除未反應的底物。
[0030] 所述載有表皮生長因子的透明質(zhì)酸-殼聚糖微球的制備方法，步驟（5)和步驟（6) 中可重復操作2次~4次。
[0031] 本發(fā)明的以載有表皮生長因子的透明質(zhì)酸-殼聚糖微球的藥物組合物均為外用 制劑，一般為凝膠劑、膜劑、粉末劑和軟膏劑等，均為采用常規(guī)輔料和常規(guī)方法制備而得。本 發(fā)明的以載有表皮生長因子的透明質(zhì)酸-殼聚糖微球的藥物組合物，也可以與其他藥物組 合形成復方制劑。
[0032] 本發(fā)明的以載有表皮生長因子的透明質(zhì)酸-殼聚糖微球的藥物組合物，制成燒燙 傷藥物制劑施用于燒燙傷創(chuàng)面，表皮生長因子可緩慢持續(xù)的釋放，達到保護創(chuàng)面、加快愈 合速度、改善愈合質(zhì)量等目的，從而獲得一種良好的燒燙傷治療藥物。
【具體實施方式】：
[0033] 以下通過具體實施例對本發(fā)明加以詳細說明：
[0034] 實施例1 :
[0035] 載有表皮生長因子的透明質(zhì)酸-殼聚糖微球的制備
[0036] (1)將分別將透明質(zhì)酸(平均相對分子質(zhì)量0. 12X106)0. 2g、三聚磷酸鈉0. 05g、 表皮生長因子0.1 g溶解于1000ml純化中。
[0037] (2)將殼聚糖(平均相對分子質(zhì)量0.08X 106,脫乙酰度88%) I. 2g溶解于1000 ml 純化水中。
[0038] (3)將步驟（1)得到的溶液加入到步驟（2)得到的溶液中并用電磁攪拌器不斷攪 拌混合，加入速度50ml/min，加入時間20min，攪拌轉(zhuǎn)速：300轉(zhuǎn)/min,攪拌時間30min，得到 含有透明質(zhì)酸-殼聚糖微球的混懸液。
[0039] (4)將上述步驟（3)中得到的混懸液離心，離心力1000 Og,離心時間30min ;棄去上 清液，收集沉淀。
[0040] (5)將上述步驟（4)得到的沉淀加入到純化水中，純化水的質(zhì)量為沉淀的30倍，并 用振蕩器將其振搖分散。
[0041] (6)將上述步驟（5)得到的混懸液離心，離心力1000 Og,離心時間30min ;棄去上清 液，收集沉淀。
[0042] (7)將沉淀凍干除去水分，得成品。
[0043] 實施例2 :
[0044] 載有