本發(fā)明屬于靈芝液體培養(yǎng)基技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種高產(chǎn)靈芝多糖和靈芝酸的靈芝液體培養(yǎng)基及其制備方法。
背景技術(shù)：
靈芝是擔(dān)子菌綱，多孔菌科，靈芝屬，并具有上千年藥用價(jià)值的藥用真菌。靈芝含有豐富的活性成分，以多糖和屬三萜類的靈芝酸為主要活性成分。藥理研究顯示，靈芝多糖具有抗癌、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗衰老、抗氧化等作用；靈芝酸可抑制腫瘤細(xì)胞、艾滋病毒以及細(xì)菌。
目前，市面上所銷售的靈芝分為野生靈芝和人工培育靈芝，野生靈芝生于闊葉樹的基部或朽木上，有時(shí)也生于針葉樹上。隨著靈芝的藥用價(jià)值被人們廣泛認(rèn)識(shí)，現(xiàn)金深山老林的野生靈芝資源也在不斷的減少，雖然一年生的靈芝繁殖力不弱，但多還沒有將靈芝孢子噴出，還未成熟就被人們采摘，所以野生靈芝資源現(xiàn)在在逐年銳減。為滿足人們對(duì)靈芝的大量需求，人們開始采用人工方式培育靈芝。傳統(tǒng)的靈芝培養(yǎng)基是采用木屑和一些農(nóng)作物秸稈，如棉籽殼、麥麩、玉米芯等作為栽培原料，但是這種栽培原料中木屑占據(jù)了很大的比重，長(zhǎng)久下去會(huì)造成嚴(yán)重的樹木資源短缺，更重要的是，這些原料中各營(yíng)養(yǎng)成分不是很明確，也不能明確其所起的作用，進(jìn)而不能實(shí)現(xiàn)原料可控性，最終不能很好的控制其靈芝的生長(zhǎng)及品質(zhì)需求。
雖然現(xiàn)有技術(shù)中也慢慢的采用營(yíng)養(yǎng)成分明確的培養(yǎng)基培養(yǎng)靈芝，但其培養(yǎng)的靈芝所產(chǎn)靈芝多糖和靈芝酸卻比較低。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的上述不足，本發(fā)明提供了一種高產(chǎn)靈芝多糖和靈芝酸的靈芝液體培養(yǎng)基及其制備方法，可有效解決現(xiàn)有技術(shù)中靈芝培養(yǎng)基成分不明確，無法實(shí)現(xiàn)原料可控性以及大量使用木材造成樹木資源短缺的問題，同時(shí)還可提高靈芝多糖和靈芝酸含量。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：
一種高產(chǎn)靈芝多糖和靈芝酸的靈芝液體培養(yǎng)基，200ml，ph5.8的na2hpo4·12h2o-kh2po4緩沖溶液中包括以下物質(zhì)：0.3-0.5gnh4h2po4、0.1-0.15gkh2po4、0.05-0.1gk2hpo4、0.05-0.08gna2hpo4、0.03-0.06gmgso4、0.12-0.16gcacl2、2.2-2.6mgfeso4·7h2o、1.3-1.4mgznso4.7h2o、1-2mgmnso4·h2o、0.15-0.3mgcocl2·6h2o、0.15-0.3mgcuso4·5h2o、0.1-0.3g酵母浸膏、1.5-3g木質(zhì)素磺酸鹽和0.01-0.03mgvb1。
進(jìn)一步地，一種高產(chǎn)靈芝多糖和靈芝酸的靈芝液體培養(yǎng)基，200ml，ph5.8的na2hpo4·12h2o-kh2po4緩沖溶液中包括以下物質(zhì)：0.4gnh4h2po4、0.12gkh2po4、0.08gk2hpo4、0.06gna2hpo4、0.04gmgso4、0.14gcacl2、2.4mgfeso4·7h2o、1.32mgznso4.7h2o、1mgmnso4·h2o、0.2mgcocl2·6h2o、0.2mgcuso4·5h2o、0.2g酵母浸膏、2g木質(zhì)素磺酸鹽和0.02mgvb1。
進(jìn)一步地，200ml，ph5.8的na2hpo4·12h2o-kh2po4緩沖溶液通過以下方法制備得到：將46.94gna2hpo4·12h2o和9.078gkh2po4分別溶于蒸餾水中，并定容至1000ml，然后分別量取10mlna2hpo4·12h2o和190mlkh2po4，混勻，制得200ml，ph5.8的na2hpo4·12h2o-kh2po4緩沖溶液。
上述高產(chǎn)靈芝多糖和靈芝酸的靈芝液體培養(yǎng)基的制備方法，包括以下步驟：
(1)制備ph5.8的na2hpo4·12h2o-kh2po4緩沖溶液：將46.94gna2hpo4·12h2o和9.078gkh2po4分別溶于蒸餾水中，并定容至1000ml，然后分別量取10mlna2hpo4·12h2o和190mlkh2po4，混勻，制得；
(2)將除木質(zhì)素磺酸鹽和vb1以外的其他成分加入步驟(1)制備的緩沖溶液中，混勻后過2層紗布，然后向?yàn)V液中加入木質(zhì)素磺酸鹽，混勻后置于高壓蒸汽滅菌鍋中滅菌，滅菌溫度為121℃，滅菌時(shí)間為20min，最后冷卻至室溫；
(3)然后向步驟(2)所得物質(zhì)中加入vb1，混勻，制得高產(chǎn)靈芝多糖和靈芝酸的靈芝液體培養(yǎng)基。
本發(fā)明提供的高產(chǎn)靈芝多糖和靈芝酸的靈芝液體培養(yǎng)基及其制備方法，具有以下有益效果：
(1)本發(fā)明選用工業(yè)化木質(zhì)素磺酸鹽作為靈芝合成培養(yǎng)基的碳源，與傳統(tǒng)培養(yǎng)基中的木屑作為碳源相比，其來源廣泛易得，成本低，環(huán)境友好，不會(huì)造成環(huán)境資源的短缺現(xiàn)象。
(2)本發(fā)明選用成分明確，可達(dá)到對(duì)靈芝生長(zhǎng)的可控性。
(3)本發(fā)明選用緩沖液體系調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的ph值，使靈芝生長(zhǎng)條件達(dá)到最佳。
(4)采用本發(fā)明制備的培養(yǎng)基培養(yǎng)靈芝，其所產(chǎn)靈芝多糖和靈芝酸均較高。
附圖說明
圖1為靈芝菌絲對(duì)碳源的利用程度。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1
一種高產(chǎn)靈芝多糖和靈芝酸的靈芝液體培養(yǎng)基，200ml，ph5.8的na2hpo4·12h2o-kh2po4緩沖溶液中包括以下物質(zhì)：0.3gnh4h2po4、0.1gkh2po4、0.05gk2hpo4、0.05gna2hpo4、0.03gmgso4、0.12gcacl2、2.2mgfeso4·7h2o、1.3mgznso4.7h2o、1mgmnso4·h2o、0.15mgcocl2·6h2o、0.15mgcuso4·5h2o、0.1g酵母浸膏、1.5g木質(zhì)素磺酸鈉和0.01mgvb1。
上述高產(chǎn)靈芝多糖和靈芝酸的靈芝液體培養(yǎng)基的制備方法，包括以下步驟：
(1)制備ph5.8的na2hpo4·12h2o-kh2po4緩沖溶液：將46.94gna2hpo4·12h2o和9.078gkh2po4分別溶于蒸餾水中，并定容至1000ml，然后分別量取10mlna2hpo4·12h2o和190mlkh2po4，混勻，制得；
(2)將除木質(zhì)素磺酸鈉和vb1以外的其他成分加入步驟(1)制備的緩沖溶液中，混勻后過2層紗布，然后向?yàn)V液中加入木質(zhì)素磺酸鈉，混勻后置于高壓蒸汽滅菌鍋中滅菌，滅菌溫度為121℃，滅菌時(shí)間為20min，最后冷卻至室溫；
(3)然后向步驟(2)所得物質(zhì)中加入vb1，混勻，制得高產(chǎn)靈芝多糖和靈芝酸的靈芝液體培養(yǎng)基。
采用上述高產(chǎn)靈芝多糖和靈芝酸的靈芝液體培養(yǎng)基培育靈芝，其過程為：
將靈芝菌絲接種到pda平板培養(yǎng)基中，于30℃恒溫箱中培養(yǎng)7天，然后取培養(yǎng)后的菌種，再將其菌絲接種于pda液體培養(yǎng)基中，在120r/min，30℃條件下培養(yǎng)7天，取菌液2ml，接種于上述200ml高產(chǎn)靈芝多糖和靈芝酸的靈芝液體培養(yǎng)基中，再置于120r/min，30℃條件下培養(yǎng)30天。
實(shí)施例2
一種高產(chǎn)靈芝多糖和靈芝酸的靈芝液體培養(yǎng)基，200ml，ph5.8的na2hpo4·12h2o-kh2po4緩沖溶液中包括以下物質(zhì)：0.5gnh4h2po4、0.15gkh2po4、0.1gk2hpo4、0.08gna2hpo4、0.06gmgso4、0.16gcacl2、2.6mgfeso4·7h2o、1.4mgznso4.7h2o、2mgmnso4·h2o、0.3mgcocl2·6h2o、0.3mgcuso4·5h2o、0.3g酵母浸膏、3g木質(zhì)素磺酸鈉和0.03mgvb1。
上述高產(chǎn)靈芝多糖和靈芝酸的靈芝液體培養(yǎng)基的制備方法，包括以下步驟：
(1)制備ph5.8的na2hpo4·12h2o-kh2po4緩沖溶液：將46.94gna2hpo4·12h2o和9.078gkh2po4分別溶于蒸餾水中，并定容至1000ml，然后分別量取10mlna2hpo4·12h2o和190mlkh2po4，混勻，制得；
(2)將除木質(zhì)素磺酸鈉和vb1以外的其他成分加入步驟(1)制備的緩沖溶液中，混勻后過2層紗布，然后向?yàn)V液中加入木質(zhì)素磺酸鈉，混勻后置于高壓蒸汽滅菌鍋中滅菌，滅菌溫度為121℃，滅菌時(shí)間為20min，最后冷卻至室溫；
(3)然后向步驟(2)所得物質(zhì)中加入vb1，混勻，制得高產(chǎn)靈芝多糖和靈芝酸的靈芝液體培養(yǎng)基。
采用上述高產(chǎn)靈芝多糖和靈芝酸的靈芝液體培養(yǎng)基培育靈芝，其過程與實(shí)施例1相同。
實(shí)施例3
一種高產(chǎn)靈芝多糖和靈芝酸的靈芝液體培養(yǎng)基，200ml，ph5.8的na2hpo4·12h2o-kh2po4緩沖溶液中包括以下物質(zhì)：0.4gnh4h2po4、0.12gkh2po4、0.08gk2hpo4、0.06gna2hpo4、0.04gmgso4、0.14gcacl2、2.4mgfeso4·7h2o、1.32mgznso4.7h2o、1mgmnso4·h2o、0.2mgcocl2·6h2o、0.2mgcuso4·5h2o、0.2g酵母浸膏、2g木質(zhì)素磺酸鈉和0.02mgvb1。
上述高產(chǎn)靈芝多糖和靈芝酸的靈芝液體培養(yǎng)基的制備方法，包括以下步驟：
(1)制備ph5.8的na2hpo4·12h2o-kh2po4緩沖溶液：將46.94gna2hpo4·12h2o和9.078gkh2po4分別溶于蒸餾水中，并定容至1000ml，然后分別量取10mlna2hpo4·12h2o和190mlkh2po4，混勻，制得；
(2)將除木質(zhì)素磺酸鈉和vb1以外的其他成分加入步驟(1)制備的緩沖溶液中，混勻后過2層紗布，然后向?yàn)V液中加入木質(zhì)素磺酸鈉，混勻后置于高壓蒸汽滅菌鍋中滅菌，滅菌溫度為121℃，滅菌時(shí)間為20min，最后冷卻至室溫；
(3)然后向步驟(2)所得物質(zhì)中加入vb1，混勻，制得高產(chǎn)靈芝多糖和靈芝酸的靈芝液體培養(yǎng)基。
采用上述高產(chǎn)靈芝多糖和靈芝酸的靈芝液體培養(yǎng)基培育靈芝，其過程與實(shí)施例1相同。
實(shí)施例4
一種靈芝液體培養(yǎng)基，200ml，ph5.8的na2hpo4·12h2o-kh2po4緩沖溶液中包括以下物質(zhì)：0.4gnh4h2po4、0.12gkh2po4、0.08gk2hpo4、0.06gna2hpo4、0.04gmgso4、0.14gcacl2、2.4mgfeso4·7h2o、1.32mgznso4.7h2o、1mgmnso4·h2o、0.2mgcocl2·6h2o、0.2mgcuso4·5h2o、0.2g酵母浸膏、2g木質(zhì)素硫酸鈉和0.02mgvb1。
上述靈芝液體培養(yǎng)基的制備方法，包括以下步驟：
(1)制備ph5.8的na2hpo4·12h2o-kh2po4緩沖溶液：將46.94gna2hpo4·12h2o和9.078gkh2po4分別溶于蒸餾水中，并定容至1000ml，然后分別量取10mlna2hpo4·12h2o和190mlkh2po4，混勻，制得；
(2)將除木質(zhì)素硫酸鈉和vb1以外的其他成分加入步驟(1)制備的緩沖溶液中，混勻后過2層紗布，然后向?yàn)V液中加入木質(zhì)素硫酸鈉，混勻后置于高壓蒸汽滅菌鍋中滅菌，滅菌溫度為121℃，滅菌時(shí)間為20min，最后冷卻至室溫；
(3)然后向步驟(2)所得物質(zhì)中加入vb1，混勻，制得靈芝液體培養(yǎng)基。
采用上述靈芝液體培養(yǎng)基培育靈芝，其過程與實(shí)施例1相同。
實(shí)施例5
一種靈芝液體培養(yǎng)基，200ml，ph5.8的na2hpo4·12h2o-kh2po4緩沖溶液中包括以下物質(zhì)：0.4gnh4h2po4、0.12gkh2po4、0.08gk2hpo4、0.06gna2hpo4、0.04gmgso4、0.14gcacl2、2.4mgfeso4·7h2o、1.32mgznso4.7h2o、1mgmnso4·h2o、0.2mgcocl2·6h2o、0.2mgcuso4·5h2o、0.2g酵母浸膏、2g粉狀纖維素(cellulosefibers)和0.02mgvb1。
上述靈芝液體培養(yǎng)基的制備方法，包括以下步驟：
(1)制備ph5.8的na2hpo4·12h2o-kh2po4緩沖溶液：將46.94gna2hpo4·12h2o和9.078gkh2po4分別溶于蒸餾水中，并定容至1000ml，然后分別量取10mlna2hpo4·12h2o和190mlkh2po4，混勻，制得；
(2)將除纖維素和vb1以外的其他成分加入步驟(1)制備的緩沖溶液中，混勻后過2層紗布，然后向?yàn)V液中加入纖維素，混勻后置于高壓蒸汽滅菌鍋中滅菌，滅菌溫度為121℃，滅菌時(shí)間為20min，最后冷卻至室溫；
(3)然后向步驟(2)所得物質(zhì)中加入vb1，混勻，制得靈芝液體培養(yǎng)基。
采用上述靈芝液體培養(yǎng)基培育靈芝，其過程與實(shí)施例1相同。
實(shí)施例6
一種靈芝液體培養(yǎng)基，200ml，ph5.8的na2hpo4·12h2o-kh2po4緩沖溶液中包括以下物質(zhì)：0.4gnh4h2po4、0.12gkh2po4、0.08gk2hpo4、0.06gna2hpo4、0.04gmgso4、0.14gcacl2、2.4mgfeso4·7h2o、1.32mgznso4.7h2o、1mgmnso4·h2o、0.2mgcocl2·6h2o、0.2mgcuso4·5h2o、0.2g酵母浸膏、1g木質(zhì)素磺酸鈉、1g木質(zhì)素硫酸鈉和0.02mgvb1。
上述靈芝液體培養(yǎng)基的制備方法，包括以下步驟：
(1)制備ph5.8的na2hpo4·12h2o-kh2po4緩沖溶液：將46.94gna2hpo4·12h2o和9.078gkh2po4分別溶于蒸餾水中，并定容至1000ml，然后分別量取10mlna2hpo4·12h2o和190mlkh2po4，混勻，制得；
(2)將除木質(zhì)素磺酸鈉、木質(zhì)素硫酸鈉和vb1以外的其他成分加入步驟(1)制備的緩沖溶液中，混勻后過2層紗布，然后向?yàn)V液中加入木質(zhì)素磺酸鈉、木質(zhì)素硫酸鈉，混勻后置于高壓蒸汽滅菌鍋中滅菌，滅菌溫度為121℃，滅菌時(shí)間為20min，最后冷卻至室溫；
(3)然后向步驟(2)所得物質(zhì)中加入vb1，混勻，制得靈芝液體培養(yǎng)基。
采用上述靈芝液體培養(yǎng)基培育靈芝，其過程與實(shí)施例1相同。
實(shí)驗(yàn)例
1、測(cè)定靈芝菌絲對(duì)碳源的利用程度
分別將實(shí)施例3-6培養(yǎng)靈芝的錐形瓶與含50ml濃度為0.02mol/l的ba(oh)2溶液的錐形瓶通過橡皮膠管連接，兩錐形瓶均用封口膜密封，每?jī)商烊∫淮螛?，同時(shí)，每?jī)商煜蚺囵B(yǎng)靈芝的錐形瓶中注入300ml經(jīng)鈉石灰過濾過的空氣，然后用1/44mol/l的草酸溶液滴定ba(oh)2溶液，測(cè)得co2產(chǎn)生量，進(jìn)而判斷靈芝菌絲對(duì)碳源的利用程度，測(cè)定結(jié)果見圖1。
其中，cellulose為纖維素，sl為木質(zhì)素磺酸鈉，kl為木質(zhì)素硫酸鈉，blend為含有木質(zhì)素磺酸鈉和木質(zhì)素硫酸鈉。
由圖1可知，靈芝菌絲生長(zhǎng)以木質(zhì)素磺酸鈉為碳源時(shí)，co2產(chǎn)生量最多，說明靈芝菌絲在相同培養(yǎng)條件下，對(duì)木質(zhì)素磺酸鹽利用的最好。
2、靈芝多糖含量的測(cè)定
將實(shí)施例3-6培養(yǎng)30天后的培養(yǎng)液分別置于高壓蒸汽滅菌鍋中滅菌，滅菌溫度為121℃，滅菌時(shí)間為20min，然后冷卻至室溫，接著抽濾，除去菌絲，再用培養(yǎng)基中所用的ph5.8的na2hpo4·12h2o-kh2po4緩沖溶液定容至200ml。
采用苯酚-濃硫酸法測(cè)定葡萄糖含量，即取定容后的培養(yǎng)液0.2ml，用蒸餾水定容至2ml，再分別添加5％的苯酚溶液1.5ml，濃硫酸6ml，混勻，放置5min，然后90℃水浴10min，取出立即放入冰水中冷卻至室溫，以蒸餾水代替培養(yǎng)液作為空白對(duì)照，在490nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值，制作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算靈芝多糖含量。
實(shí)施例3-6所得靈芝多糖濃度分別為0.710g/l、0.623g/l、0.573g/l和0.661g/l。說明采用實(shí)施例3中的培養(yǎng)基培養(yǎng)靈芝，其靈芝多糖含量明顯比實(shí)施例4-6中的培養(yǎng)基培養(yǎng)的靈芝產(chǎn)的靈芝多糖含量要高。
現(xiàn)有培養(yǎng)基成分及含量：葡萄糖35g、蛋白胨3.5g、kh2po41g、mgso40.5g、vb10.01g，將各成分加入1000ml蒸餾水中，混勻，置于121℃滅菌20min，制得靈芝發(fā)酵培養(yǎng)基，采用該培養(yǎng)基培養(yǎng)靈芝，其過程與實(shí)施例3相同。
采用上述方法測(cè)現(xiàn)有培養(yǎng)基培養(yǎng)靈芝后產(chǎn)的靈芝多糖含量，其含量為0.587g/l。
實(shí)施例3與現(xiàn)有培養(yǎng)基培養(yǎng)的靈芝，所產(chǎn)靈芝多糖含量進(jìn)行比較，進(jìn)一步說明了實(shí)施例3可有效提高靈芝產(chǎn)靈芝多糖。
3、靈芝酸含量的測(cè)定
將實(shí)施例3-6培養(yǎng)30天后的培養(yǎng)液分別置于高壓蒸汽滅菌鍋中滅菌，滅菌溫度為121℃，滅菌時(shí)間為20min，然后冷卻至室溫，接著抽濾，除去菌絲，再用培養(yǎng)基中所用的ph5.8的na2hpo4·12h2o-kh2po4緩沖溶液定容至200ml。
取定容后的培養(yǎng)液0.2ml，用蒸餾水定容至2ml，再分別添加5％香草醛-冰乙酸溶液0.4ml，高氯酸1.6ml，迅速混勻，70℃水浴15min，取出后立即放入冰水浴中冷卻至室溫，再加入8ml乙酸乙酯，混勻，于560nm處測(cè)吸光度，制作靈芝酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算靈芝酸含量。
實(shí)施例3-6所得靈芝酸含量分別為0.578g/l、0.417g/l、0.356g/l和0.429g/l。
說明采用實(shí)施例3中的培養(yǎng)基培養(yǎng)靈芝，其靈芝酸含量明顯比實(shí)施例4-6中的培養(yǎng)基培養(yǎng)的靈芝產(chǎn)的靈芝酸含量要高。
現(xiàn)有培養(yǎng)基成分及含量：葡萄糖35g、蛋白胨3.5g、kh2po41g、mgso40.5g、vb10.01g，將各成分加入1000ml蒸餾水中，混勻，置于121℃滅菌20min，制得靈芝發(fā)酵培養(yǎng)基，采用該培養(yǎng)基培養(yǎng)靈芝，其過程與實(shí)施例3相同。
采用上述方法測(cè)現(xiàn)有培養(yǎng)基培養(yǎng)靈芝后產(chǎn)的靈芝酸含量，其含量為0.345g/l。
實(shí)施例3與現(xiàn)有培養(yǎng)基培養(yǎng)的靈芝，所產(chǎn)靈芝酸含量進(jìn)行比較，進(jìn)一步說明了實(shí)施例3可有效提高靈芝產(chǎn)靈芝酸。