本發(fā)明涉及一種靈芝的提取方法，特別是一種多糖含量高的靈芝的提取方法。

背景技術(shù)：

靈芝為多孔菌科真菌赤芝或紫芝的干燥子實體。靈芝是一種珍貴的藥用真菌，屬于擔(dān)子菌綱多孔菌科靈芝屬，在我國有兩千多年的藥用史。靈芝首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，歷代醫(yī)家都認(rèn)為靈芝能治療多種疾病，是滋補(bǔ)強(qiáng)壯扶正固本的珍貴藥物。

靈芝多糖是靈芝中最有效的成分之一，存在于靈芝的子實體、孢子粉和菌絲體中，具有抑制腫瘤、增強(qiáng)機(jī)體對自由基清除的能力，故能減少自由基對機(jī)體的損傷、有延緩衰老之功效，還可以提高免疫力、抗炎癥、降血脂、降血糖等作用。如果將靈芝進(jìn)行提取，更能有利于靈芝藥效的發(fā)揮，現(xiàn)有技術(shù)中對靈芝進(jìn)行提取時，通常是直接將靈芝粉碎成粉，或是加水煎煮后，濃縮成浸膏，浸膏粉碎即可，但是發(fā)明人在研究過程中發(fā)現(xiàn)，采用現(xiàn)有技術(shù)對靈芝進(jìn)行提取時，靈芝的有效成分多糖不易測出，使得靈芝的的藥效還不夠理想。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的，是提供一種多糖含量高的靈芝的提取方法，本發(fā)明對靈芝的具體提取工藝進(jìn)行了改進(jìn)，使得靈芝的有效成分多糖容易測出，且測出的多糖含量高，使得靈芝的藥效好。

本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的。

一種多糖含量高的靈芝的提取方法，取靈芝，用浸泡液浸泡后，加乙酸乙酯，超聲提取后，過濾，濾液濃縮成濃縮液，備用；藥渣加入水煎煮，過濾，濾液離心后，取上清液，濃縮至60-70℃下相對密度為1.1-1.2的浸膏，浸膏與上述濃縮液合并，干燥后粉碎成細(xì)粉，即得。

前述的多糖含量高的靈芝的提取方法，取靈芝，用浸泡液浸泡后，加6-8倍量濃度為70-80％的乙酸乙酯，超聲提取2-3次，每次30-40min，提取溫度為55-65℃，提取功率為55-65w，提取液合并，過濾，濾渣備用；濾液濃縮成常溫下相對密度為1.1-1.2g/ml的濃縮液，備用；藥渣加入8-10倍量的水煎煮2-3次，每次1-2h，煎煮液合并，過濾，濾液在2800-3200r/min下離心5-10min后，取上清液，濃縮至60-70℃下相對密度為1.1-1.2的浸膏，浸膏與上述濃縮液合并，干燥后粉碎成細(xì)粉，即得。

前述的多糖含量高的靈芝的提取方法，取靈芝，用浸泡液浸泡后，加7倍量濃度為75％的乙酸乙酯，超聲提取3次，每次35min，提取溫度為55-65℃，提取功率為60w，提取液合并，過濾，濾渣備用；濾液濃縮成常溫下相對密度為1.1-1.2g/ml的濃縮液，備用；藥渣加入9倍量的水煎煮3次，每次1.5h，煎煮液合并，過濾，濾液在3000r/min下離心8min后，取上清液，濃縮至60-70℃下相對密度為1.1-1.2的浸膏，浸膏與上述濃縮液合并，干燥后粉碎成細(xì)粉，即得。

前述的多糖含量高的靈芝的提取方法，所述浸泡液按體積份計算，主要由濃度為20-30％的陳皮汁5-15份、濃度為70-80％的食鹽水溶液20-30份、檸檬汁5-15份、梨汁5-15份、西瓜汁10-20份和水50-60份混合而成。

前述的多糖含量高的靈芝的提取方法，所述浸泡液按體積份計算，主要由濃度為20-30％的陳皮汁7-13份、濃度為70-80％的食鹽水溶液22-28份、檸檬汁7-13份、梨汁7-13份、西瓜汁12-18份和水52-58份混合而成。

前述的多糖含量高的靈芝的提取方法，所述浸泡液按體積份計算，主要由濃度為20-30％的陳皮汁10份、濃度為70-80％的食鹽水溶液25份、檸檬汁10份、梨汁10份、西瓜汁15份和水55份混合而成。

發(fā)明人對靈芝的提取工藝進(jìn)行了長期的大量的研究發(fā)現(xiàn)，采用本發(fā)明方法對靈芝進(jìn)行提取時，使得靈芝的有效成分多糖容易測出，且測出的多糖含量高，使得靈芝的藥效好。因此本發(fā)明工藝促進(jìn)了靈芝中有效成分的溶出率，特別是多糖的溶出率，多糖是靈芝中重要的成分，具有很強(qiáng)的藥理活性，多糖的溶出率提高后，可有效提高靈芝的藥效。

申請人靈芝提取方法進(jìn)行了大量的研究，部分實驗如下：

實驗例多糖含量測定

1測定項目：

1.1靈芝1：按實施例1加工得到的靈芝粉。

1.2靈芝2：取靈芝，加6-8倍量水煎煮后2-3h后，過濾，濾液濃縮至60-70℃下相對密度為1.1-1.2的浸膏，浸膏干燥，粉碎，即得靈芝粉。

1.3靈芝3：將靈芝烘干后，直接粉碎得到的靈芝粉。

2方法

2.1苯酚溶液的配制

精確稱量分析純苯酚晶體5g于250ml，加入蒸餾水60ml，放入50℃水浴中使其溶解，再于100ml容量瓶中定容，即得5％苯酚溶液。苯酚可以被空氣氧化，所以苯酚溶液現(xiàn)配現(xiàn)用。

2.2樣品多糖提取方法

2.2.1靈芝1樣品溶液：取靈芝1，0.5g于500ml燒杯中，加入15ml95％乙醇，于60℃恒溫水浴槽中加熱30分鐘，過濾。重復(fù)以上操作兩次，以除去單糖、雙糖以及低聚糖等干擾性成分。經(jīng)過濾后的樣品于100℃沸水中提取一段時間，過濾后取濾液加蒸餾水定容至500ml。

2.2.2靈芝2樣品溶液：取靈芝2，0.5g于500ml燒杯中，加入15ml95％乙醇，于60℃恒溫水浴槽中加熱30分鐘，過濾。重復(fù)以上操作兩次，以除去單糖、雙糖以及低聚糖等干擾性成分。經(jīng)過濾后的樣品于100℃沸水中提取一段時間，過濾后取濾液加蒸餾水定容至500ml。

2.2.3靈芝3樣品溶液：取靈芝3，0.5g于500ml燒杯中，加入15ml95％乙醇，于60℃恒溫水浴槽中加熱30分鐘，過濾。重復(fù)以上操作兩次，以除去單糖、雙糖以及低聚糖等干擾性成分。經(jīng)過濾后的樣品于100℃沸水中提取一段時間，過濾后取濾液加蒸餾水定容至500ml。

2.3分光光度法測定多糖含量

2.3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。精確稱量充分干燥過的分析純葡萄糖50mg，加水定容至500ml容量瓶中，得到0.1mg/ml葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。取50ml洗凈的容量瓶6只。分別用移液管準(zhǔn)確加入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液5ml、10ml、15ml、20ml、25ml、30ml，加入蒸餾水定容，即得到濃度分別為0.01mg/ml、0.02mg/ml、0.03mg/ml、0.04mg/ml、0.05mg/ml、0.06mg/ml的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。測定時取1ml各濃度葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液加入到20ml具塞比色管中，迅速入5％苯酚溶液以及98％濃硫酸適量，搖勻后放置于室溫下顯色20min。另取lml蒸餾水，同上加入苯酚溶液和濃硫酸，做空白參比溶液。在指定波長處測定吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算標(biāo)準(zhǔn)曲線方程和相關(guān)系數(shù)r。

2.3.2靈芝1多糖含量測定：取lml靈芝1樣品溶液加入到20ml具塞比色管中，采用與標(biāo)準(zhǔn)液顯色相同方法依次加入苯酚溶液和濃硫酸，于特定波長處測定吸光度，將吸光度帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計算得出樣品液濃度c。按下式計算出所取多糖含量，多糖含量(％)＝cv/m，c為樣品液濃度，v為樣品液體積，m為取樣的質(zhì)量。

2.3.3靈芝2多糖含量測定：取lml靈芝2樣品溶液加入到20ml具塞比色管中，采用與標(biāo)準(zhǔn)液顯色相同方法依次加入苯酚溶液和濃硫酸，于特定波長處測定吸光度，將吸光度帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計算得出樣品液濃度c。按下式計算出所取多糖含量，多糖含量(％)＝cv/m，c為樣品液濃度，v為樣品液體積，m為取樣的質(zhì)量。

2.3.4靈芝3多糖含量測定：取lml靈芝3樣品溶液加入到20ml具塞比色管中，采用與標(biāo)準(zhǔn)液顯色相同方法依次加入苯酚溶液和濃硫酸，于特定波長處測定吸光度，將吸光度帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計算得出樣品液濃度c。按下式計算出所取多糖含量，多糖含量(％)＝cv/m，c為樣品液濃度，v為樣品液體積，m為取樣的質(zhì)量。

3結(jié)果

3.1最大吸收波長的確定

取lml0.05mg/ml葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入苯酚溶液和濃硫酸后反應(yīng)一段時間后。在450-520nm波長區(qū)間進(jìn)行光譜掃描，確定其最大吸收波長，發(fā)現(xiàn)在488nm波長處，所得吸光度值最大，無其他雜峰，則最佳測定波長選用488nm。

3.2苯酚溶液用量的確定

取相同濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液1ml于6支20ml具塞比色管中，分別加入0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml、1.2ml、1.4ml的5％苯酚溶液，再依次加入5ml98％濃硫酸，混合搖勻。放置于20℃溫度下顯色30分鐘，在488nm波長處測定吸光度值。當(dāng)加入苯酚溶液1.0ml時，吸光度值最大，加入苯酚溶液過多反而會引起吸光度降低，所以實驗中5％苯酚溶液的最佳加入量應(yīng)當(dāng)為1ml。

3.3濃硫酸用量的確定

取相同濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液lml加入到五支編號的具塞比色管中，各加入5％苯酚溶液lml，依次滴加濃硫酸4.0ml、4.5ml、5.0ml、5.5m、6.0ml。于488nm波長處測定其吸光度，發(fā)現(xiàn)硫酸加入量為5ml時所測得的吸光度值達(dá)到最大，加入硫酸過少則反應(yīng)不夠完全。加入硫酸過多可能導(dǎo)致其他副反應(yīng)，導(dǎo)致測定結(jié)果降低，所以最佳硫酸加入量為5ml。

3.4顯色溫度的確定

分別取一定濃度葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液lml加入到五支編號的具塞比色管中，各向其中加入5％苯酚溶液lml，迅速滴加98％濃硫酸5ml，分別放于20℃、30℃、40℃、50℃、60℃溫度下顯色30min，在489nm波長處測定其吸光度。在各溫度下，測得的吸光度基本不變，所以溫度對反應(yīng)吸光度基本無影響，在室溫下就能夠完全反應(yīng)。

3.5顯色時間的確定

分別取一定濃度葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液lml加入到五支編號的具塞比色管中，各向其中加入5％苯酚溶液lml，迅速滴加98％濃硫酸5ml，分別于室溫下顯色10min、20min、30min、40min、50min，在488nm波長處測定其吸光度。發(fā)現(xiàn)，反應(yīng)10分鐘吸光度值較小，顯色時間從20到50分鐘，樣品溶液的吸光度基本不變，所以反應(yīng)時間控制在20分鐘以上就基本能夠反應(yīng)完全。所以反應(yīng)時間控制在20分鐘以上就能達(dá)到最佳效果。

綜合以上測定結(jié)果，得出苯酚硫酸法最佳測定條件參數(shù)：1m樣品液，5％苯酚溶液加入量為1ml，98％濃硫,酸加入量為5ml，顯色溫度室溫即可，顯色時間為20分鐘以上，最大吸收波長為488nm。

3.6標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精確稱量充分干燥過的分析純葡萄糖50mg，加水定容至500ml容量瓶中，得到0.1mg/ml葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。取50ml洗凈的容量瓶6只，分別用移液管準(zhǔn)確加入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液5ml、10ml、15ml、20ml、25ml、30ml。加入蒸餾水定容，即得到濃度分別為0.01mg/ml、0.02mg/ml、0.03mg/ml、00.04mg/ml、0.05mg/ml、0.06mg/ml的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。測定時取1ml各濃度葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液加入到20ml具塞比色管中，迅速加入5％苯酚溶液以及98％濃硫酸適量，搖勻后放置于室溫下顯色20min。另取lml蒸餾水，同上加入苯酚溶液和濃硫酸，做空白參比溶液。在指定波長處測定吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算標(biāo)準(zhǔn)曲線方程和相關(guān)系數(shù)r。準(zhǔn)確稱量葡萄糖0.0520g。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y＝9.0803x-0.0385，相關(guān)系數(shù)r值為0.9984，線性較好，線性范圍10.5-63.0ug/ml。

3.7重復(fù)性試驗

采用苯酚硫酸法平行取樣品溶液測定5次，得到rsd＝1.18％，說明精密度較高，能滿足定量分析的要求。

3.8加標(biāo)回收率

分別準(zhǔn)確移取靈芝1樣品溶液、靈芝2樣品溶液和靈芝3樣品溶液各0.5ml于20ml具塞比色管中，分別準(zhǔn)確移取0.005mg/ml、0.010mg/ml、0.015mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液，0.5ml加入樣液中，測定多糖含量計算平均回收率。平均回收率為97.64％，97.50％，97.61％。rsd為1.2％，1.1％，1.3％。回收率高，說明此法結(jié)果準(zhǔn)確率高。

4含量測定結(jié)果

分別取靈芝1、靈芝2和靈芝3，平行分成6份，制成靈芝1樣品溶液、靈芝2樣品溶液和靈芝3樣品溶液，按上述方法進(jìn)行測定，記錄數(shù)據(jù)，結(jié)果取平均值。得到結(jié)果見表1。

表1靈芝多糖含量測定結(jié)果

由表可知，本發(fā)明工藝進(jìn)行提取得到的靈芝中多糖的含量較高。靈芝品質(zhì)好。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明對靈芝的具體提取工藝進(jìn)行了改進(jìn)，使得靈芝的有效成分多糖容易測出，且測出的多糖含量高，使得靈芝的藥效好。

具體實施方式

實施例1。

取靈芝，用浸泡液浸泡后，加7倍量濃度為75％的乙酸乙酯，超聲提取3次，每次35min，提取溫度為55-65℃，提取功率為60w，提取液合并，過濾，濾渣備用；濾液濃縮成常溫下相對密度為1.1-1.2g/ml的濃縮液，備用；藥渣加入9倍量的水煎煮3次，每次1.5h，煎煮液合并，過濾，濾液在3000r/min下離心8min后，取上清液，濃縮至60-70℃下相對密度為1.1-1.2的浸膏，浸膏與上述濃縮液合并，干燥后粉碎成細(xì)粉，即得。

所述浸泡液由濃度為25％的陳皮汁10l、濃度為75％的食鹽水溶液25l、檸檬汁10l、梨汁10l、西瓜汁15l和水55l混合而成。

實施例2.

取靈芝，用浸泡液浸泡后，加8倍量濃度為80％的乙酸乙酯，超聲提取3次，每次40min，提取溫度為55-65℃，提取功率為65w，提取液合并，過濾，濾渣備用；濾液濃縮成常溫下相對密度為1.1-1.2g/ml的濃縮液，備用；藥渣加入10倍量的水煎煮3次，每次2h，煎煮液合并，過濾，濾液在3200r/min下離心10min后，取上清液，濃縮至60-70℃下相對密度為1.1-1.2的浸膏，浸膏與上述濃縮液合并，干燥后粉碎成細(xì)粉，即得。

所述浸泡液由濃度為30％的陳皮汁15l、濃度為80％的食鹽水溶液30l、檸檬汁15l、梨汁15l、西瓜汁20l和水60l混合而成。

實施例3.

取靈芝，用浸泡液浸泡后，加6倍量濃度為70％的乙酸乙酯，超聲提取2次，每次30min，提取溫度為55-65℃，提取功率為55w，提取液合并，過濾，濾渣備用；濾液濃縮成常溫下相對密度為1.1-1.2g/ml的濃縮液，備用；藥渣加入8倍量的水煎煮2次，每次1h，煎煮液合并，過濾，濾液在2800r/min下離心5min后，取上清液，濃縮至60-70℃下相對密度為1.1-1.2的浸膏，浸膏與上述濃縮液合并，干燥后粉碎成細(xì)粉，即得。

所述浸泡液由濃度為20％的陳皮汁7l、濃度為70％的食鹽水溶液22l、檸檬汁7l、梨汁7l、西瓜汁12l和水52l混合而成。