專利名稱：從鯊魚皮分離純化生物醫(yī)藥用膠原蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種分離純化生物醫(yī)學(xué)用膠原蛋白的方法，特別是涉及一 種從鯊魚皮中分離純化生物醫(yī)學(xué)用膠原蛋白的方法。
背景技術(shù)：
膠原蛋白或稱膠原是由動物細胞合成的一種生物性高分子，廣泛存在 于動物骨、腳、軟骨和皮膚及其它結(jié)締組織中，約占哺乳動物總蛋白的1/ 3，是人體重要的細胞外基質(zhì)成份，膠原具有良好的生物學(xué)特性，可作為組 織的支持物，對細胞、組織乃至器官行使正常功能并對外傷修復(fù)有重大影 響。國內(nèi)外對膠原蛋白的利用主要分為兩大類 一是著眼于膠原蛋白獨特 的宏觀物理性能，即纖維性能，用于相紙底片、紡織、造紙等；二是著眼 于其內(nèi)在性能，即膠原的生物功能，用于食品保健、飼料、美容化妝品、 醫(yī)用材料等，膠原具有重要的生物學(xué)性質(zhì)，力學(xué)性能高、促進細胞生長、 止血、生物相容性和生物降解性，可用作皮膚燒傷、燙傷的修補，治療和 護理，能夠減輕燒傷、燙傷的程度，杜絕感染，其在治療燒、燙傷方面起 著非常重要的作用，它可加工成"人工皮膚"，直接敷于燒、燙傷之皮膚
表面，尤其對于大面積、深度在ni級以上重患者，類人膠原蛋白可用作人
工血管，實用血管嫁接以及人體受損組織的修補，例如因突發(fā)疾病，胃出 血、穿孔、膠原蛋白可結(jié)合抗生索，細胞促生因子等對受損組織可進行修 補，膠原蛋白可與骨粉、骨蛋白結(jié)合后用于肢體延伸，膠原蛋白可制作人 工器官、心臟起搏器，人體內(nèi)臟的充填物等，膠原蛋白也是一種新型的生 物發(fā)酵培養(yǎng)基，含氨基酸種類齊全，具有微生物培養(yǎng)的獨特功效，是細菌 學(xué)培養(yǎng)、生物發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳原料之一。此外，由膠原制備的材料，可 以擴散到皮膚的深層，對人的皮膚有很好的營養(yǎng)作用，同時由于其分子中含有大量的羥基，它有著相當好的保濕作用。據(jù)調(diào)查在2003年最暢銷保養(yǎng) 品評比中，膠原蛋白最受青睞，膠原蛋白在國外流行多年，歐美不少化妝 品研發(fā)中心推出含膠原蛋白成份保養(yǎng)品，全球膠原蛋白目前產(chǎn)值超過40億 美元。關(guān)于膠原蛋白提取純化方面，雖然方法各異，但大多數(shù)是從魷魚、 鱈魚等小型魚類及家畜的皮中提取，小型魚類本身所含膠原蛋白量少，原 料有限，而從家畜皮膚中提取的此類蛋白溶解度低，并且以牛類為原料不 易被世界許多貿(mào)易組織所接受，目前提取膠原蛋白的步驟包含萃取、分離 和提純，萃取又分為酸法、堿法中性鹽法和酶法等，工藝繁瑣，也有用基 因工程方法制備蛋白，但同時又增加了成本，由于上述這些分離技術(shù)存在 的這些缺陷，使得制得的膠原蛋白產(chǎn)率、產(chǎn)量、質(zhì)量都不高，以使生物醫(yī) 學(xué)用膠原蛋白價格高昂，最后，大大影響了膠原蛋白的廣泛應(yīng)用，因此， 降低膠原蛋白純化成本和提高蛋白質(zhì)量是關(guān)鍵。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是要提供一種從鯊魚皮分離純化生物醫(yī)藥用膠原蛋白的 方法，它不但能有效地從鯊魚皮膚中提取高質(zhì)量膠原蛋白，而且，工藝簡 單，成本低廉，產(chǎn)率較高。
為了達到上述的目的本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的本發(fā)明的從鯊魚皮分離純 化生物醫(yī)藥用膠原蛋白的方法所使用的原料為鯊魚皮，且從中分離純化生 物醫(yī)學(xué)用膠原蛋白的方法操作如下
(1) 、將鯊魚皮用pH值為7. 4-7. 6的低濃度磷酸鹽緩沖液浸泡沖洗去掉鱗 和殘肉，并切成小塊，再用去離子水浸泡沖洗3 5次；
(2) 、清洗干凈的魚皮且用原料量五倍的pH值為7. 4-7. 6的中濃度磷酸鹽 緩沖液浸泡70 75小時后，勻漿15min，在溫度為4'C，轉(zhuǎn)速為10000rpm， 離心15min，取上清液；
(3) 、再沉淀重復(fù)(2)的過程一次，將合并上清液，加硫酸銨至飽和度80 %，在溫度為4。C，轉(zhuǎn)速為8000rpm，離心15min，保留沉淀；
(4) 、將沉淀溶在pH值為7.0的中濃度磷酸緩沖液中；
(5) 、用G-75， 100， 150葡聚糖層析上述溶解液，收集蛋白溶出液于溫 度為4。C，轉(zhuǎn)速為10000rpm，離心15 min，上清液濃縮，冷凍干燥后得到生 物醫(yī)學(xué)用膠原蛋白。
所述的低濃度磷酸鹽緩沖液是濃度為8 — 12 mM， pH值為7. 4-7. 6的磷酸 氫二鈉緩沖液，所述的中濃度磷酸鹽緩沖液是濃度為80 — 120 mM, pH值為 7. 4-7. 6的磷酸氫二鈉緩沖液，所述的中濃度磷酸緩沖液的濃度為180 — 220mM， pH值為7.0，其用量為1.5 g/ml。
由于本發(fā)明以鯊魚皮為材料，通過堿洗、透析等方法提取和純化膠原
蛋白，因此具有以下優(yōu)點
1、 鯊魚皮原料豐富，價格低廉， 一般作為下腳料，以其作為蛋白提取 原料，大大降低了成本，據(jù)悉，目前市場上的鯊魚碎皮、頭皮價格在
6000-8000元/噸，年總產(chǎn)量1000噸左右；
2、 所得膠原蛋白經(jīng)檢測己達到電泳純，質(zhì)量高；
3、 所得鯊魚皮膠原蛋白能溶于中性及酸性溶液中，較之其他來源的膠 原蛋白有更大的溶解性，能應(yīng)用于更多領(lǐng)域；
4、 所得鯊魚皮膠原蛋白變性溫度顯著高于其他來源蛋白變性溫度，這 在作為生物醫(yī)學(xué)材料上具有獨特應(yīng)用價值；
5、 成本低，工藝流程放大時受儀器、材料等的限制小，只需增加人力 成本即可。
具體實施例方式
以下將對本發(fā)明的從鯊魚皮分離純化生物醫(yī)藥用膠原蛋白的方法作進 一步的詳細描述。
本實施例中所用的材料為馬膠鯊皮。具體步驟如下
1、 將冰凍保存的馬膠鯊皮30g用濃度為10mM，pH值為7.4-7.6的磷酸氫 二鈉緩沖液浸泡沖洗去掉鱗和殘肉，切成0.5 cmX0.5cm小塊，再用去離子 水浸泡沖洗3 5次；
2、 清洗干凈的魚皮用濃度為100mM， pH值為7.4-7.6的磷酸氫二鈉緩沖 液250ml浸泡72小時后，勻漿15min，以溫度為4。C、轉(zhuǎn)速為10000rpm、離心 15min，取上清液；
3、 沉淀重復(fù)2的過程一次，合并上清液，加硫酸銨至飽和度80%，以 轉(zhuǎn)速為8000rpm，溫度為4'C，離心15min，保留沉淀；
4、 將沉淀溶在約20 ml的濃度為200mM, pH值為7. O的磷酸緩沖液中；
5、 用G-75， 100， 150葡聚糖層析上述溶解液，收集蛋白溶出液于溫度 為4'C 、轉(zhuǎn)速為10000rpm，離心15min，上清液濃縮，冷凍干燥后得到生物 醫(yī)學(xué)用膠原蛋白。
經(jīng)上述分離、純化的馬膠鯊皮膠原蛋白在濃縮膠4-5%、分離膠7.5-8% 的SDS-PAGE上體現(xiàn)清晰的三條譜帶，低分子量肽鏈含量較高，分子質(zhì)量分 別為134 kDa和118 kDa;高分子量肽鏈含量較少，其分子質(zhì)量約為205 kDa 。該高分子量肽鏈比從陸地和其它海洋魚類獲得的P -肽鏈的分子量高。
從馬膠鯊皮分離到的膠原蛋白的變性溫度是40.3rC，這與膠原蛋白的 空間結(jié)構(gòu)存在0 -折疊和無規(guī)巻曲相一致，這個變性溫度顯著不同于用黏度 法測定的海洋魚類膠原蛋白的變性溫度，從日本鱸魚膠原蛋白的熱變性溫 度為3(TC、金槍魚的變性溫度29. 7°C、淡水魚鱗的熱變性溫度為32.3t:、 牛皮膠原蛋白的變性溫度為38"C的事實推測，從青鯊頭皮分離到的膠原蛋 白具有獨特的空間結(jié)構(gòu)特征和氨基酸構(gòu)成特點，這在作為生物醫(yī)學(xué)材料上 有具有獨特的應(yīng)用價值。
權(quán)利要求
1、一種從鯊魚皮中分離純化生物醫(yī)學(xué)用膠原蛋白的方法，其特征在于選取原料為鯊魚皮，制備方法如下(1)、將鯊魚皮用pH值為7.4-7.6的低濃度磷酸鹽緩沖液浸泡沖洗去掉鱗和殘肉，并切成小塊，再用去離子水浸泡沖洗3～5次；(2)、清洗干凈的魚皮且用原料量五倍的pH值為7.4-7.6的中濃度磷酸鹽緩沖液浸泡70～75小時后，勻漿15min，在溫度為4℃，轉(zhuǎn)速為10000rpm，離心15min，取上清液；(3)、再沉淀重復(fù)(2)的過程一次，合并上清液，加硫酸銨至飽和度80％，在溫度為4℃，轉(zhuǎn)速為8000rpm，離心15min，保留沉淀；(4)、將沉淀溶在pH值為7.0的中濃度磷酸緩沖液中；(5)、用G-75，100，150葡聚糖層析上述溶解液，收集蛋白溶出液于溫度為4℃，轉(zhuǎn)速為10000rpm，離心15min，上清液濃縮，冷凍干燥后得到生物醫(yī)學(xué)用膠原蛋白。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的從鯊魚皮中分離純化生物醫(yī)學(xué)用膠原蛋白 的方法，其特征在于所述的低濃度磷酸鹽緩沖液是濃度為8 — 12 mM, pH值 為7. 4-7. 6的磷酸氫二鈉緩沖液。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的從鯊魚皮中分離純化生物醫(yī)學(xué)用膠原蛋白 的方法，其特征在于所述的中濃度磷酸鹽緩沖液是濃度為80—120 mM， pH 值為7. 4-7. 6的磷酸氫二鈉緩沖液。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的從鯊魚皮中分離純化生物醫(yī)學(xué)用膠原蛋白 的方法，其特征在于所述的中濃度磷酸緩沖液的濃度為180 — 220mM, pH值 為7.0，其用量為1.5 g/ml。
全文摘要
一種從鯊魚皮中分離純化生物醫(yī)學(xué)用膠原蛋白的方法。其原料選取鯊魚皮，操作如下鯊魚皮用pH值為7.4-7.6的低濃度磷酸鹽緩沖液浸泡沖洗去掉鱗和殘肉，切成小塊，用去離子水浸泡沖洗3～5次；清洗干凈的魚皮且用原料量五倍的pH值為7.4-7.6的中濃度磷酸鹽緩沖液浸泡70～75小時后，勻漿15min，溫度為4℃，轉(zhuǎn)速10000rpm，離心15min，取上清液；沉淀重復(fù)上一步過程，合并上清液，加硫酸銨至飽和度80％，溫度為4℃，轉(zhuǎn)速8000rpm，離心15min，保留沉淀；將沉淀溶在pH值7.0的中濃度磷酸緩沖液中；用G-75，100，150葡聚糖層析上述溶解液，收集蛋白溶出液于溫度4℃，轉(zhuǎn)速10000rpm，離心15min，上清液濃縮，冷凍干燥后得生物醫(yī)學(xué)用膠原蛋白。本發(fā)明用于從鯊魚皮中分離純化生物醫(yī)學(xué)用膠原蛋白的方法。
文檔編號C07K1/00GK101307093SQ200710040590
公開日2008年11月19日 申請日期2007年5月14日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月14日
發(fā)明者何培民, 吳文惠, 周培根, 燕 李, 繆輝南, 蔡春爾 申請人:上海水產(chǎn)大學(xué)