專利名稱：一種抗流感病毒寡核苷酸的結(jié)構(gòu)、制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程藥物領(lǐng)域及有機(jī)合成領(lǐng)域，具體地說是一種靶向程序細(xì)胞死 tia 5 (PDCD5, Programmed cell deathprotein 5) ^n^fiJit^^l^ (IV, influenza virus) 感染的寡核苷酸(ASODN，antisense oligodexynucleotide)的序列藥物的新結(jié)構(gòu)、修飾方法及其治療藥物。
背景技術(shù)：
流感病毒感染可引起急性呼吸道傳染病。該病潛伏期短，傳染性強(qiáng)，傳播迅速。甲型流感威脅最大，且易發(fā)生變異，易引起暴發(fā)流行。1918年至1920年，著名的"西班牙流感〃在全球范圍內(nèi)造成了 2000萬-4000萬人死亡。此后，1957甲型流感病毒(H2N2)所致的〃亞洲流感"、1968由甲型流感病毒(H3N2)所致的"香港流感"、1977年由甲型流感病毒(HlNl)所致的"俄羅斯流感"、1997年以來出現(xiàn)的高致病性禽流感病毒(AIV，avian influenza virus)，以及2009年出現(xiàn)的甲型流感病毒(HlNl)感染，都嚴(yán)重威脅了人們健康和正常生活。流感作為急性呼吸道傳染病嚴(yán)重威脅著人們的健康，對于兒童、老年人、其它慢性病患者等高危人群尤其嚴(yán)重，而且也已成為社會(huì)勞動(dòng)力損失、醫(yī)療負(fù)擔(dān)加重乃至社會(huì)不安定的主要原因之一。由于流感病毒變異，常規(guī)疫苗不能有效預(yù)防流感的發(fā)生和流行。過去用于治療流感的兩種較低廉的抗病毒藥物三環(huán)癸胺(amantadine)和金剛乙胺(remantadine)對人體內(nèi)流感病毒幾乎不起作用，且耐藥較為普遍。新近上市的神經(jīng)氨酸酶抑制劑(例如達(dá)菲和帕納米韋)雖效果較好，但隨著臨床廣泛應(yīng)用，耐藥毒株分離的報(bào)道也相繼出現(xiàn)。目前仍缺乏可靠的方法對流感的發(fā)生和流行進(jìn)行有效的控制，有效的預(yù)防和控制流感病毒方法的已成當(dāng)務(wù)之急。因此研究特異性高、毒副作用小的新型抗流感病毒藥物對治療與預(yù)防具有重要現(xiàn)實(shí)意義。病毒是一種嚴(yán)格的細(xì)胞內(nèi)寄生物。病毒感染致病涉及病毒與機(jī)體兩個(gè)復(fù)雜生物系統(tǒng)及其二者間的相互作用。一方面，宿主表現(xiàn)出對病毒感染的主動(dòng)限制；另一方面，病毒會(huì)主動(dòng)地通過對宿主細(xì)胞的生物大分子進(jìn)行修飾，以使宿主細(xì)胞為它的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄等提供必需的細(xì)胞機(jī)器。在短時(shí)間內(nèi)不影響細(xì)胞存活且能為宿主細(xì)胞所能容忍的前提下，增強(qiáng)抗病毒信號或者阻斷病毒復(fù)制所需的宿主細(xì)胞因子可以有效的抗病毒以及降低耐藥毒株產(chǎn)生的頻率。PD⑶5是一種凋亡效應(yīng)分子，表達(dá)廣泛，進(jìn)化保守，具有促進(jìn)凋亡和促進(jìn) Parapotosis的效應(yīng)，其編碼區(qū)全長559bp，編碼的PDCD5蛋白由125個(gè)氨基酸組成，具有促進(jìn)多種腫瘤細(xì)胞凋亡和抑制增殖的效應(yīng)。流感病毒感染引起細(xì)胞病變(cytopathic effect, CPE)和凋亡，因此，抑制PD⑶5可能保護(hù)細(xì)胞免受病毒傷害。核酸藥物是一類全新的基因靶向創(chuàng)新藥物，長期以來一直是國際研究的熱點(diǎn)，特別是近幾年小核酸的發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步將核酸藥物的研究推向一個(gè)前所未有的發(fā)展高潮。目前幾乎所有大的國際制藥公司均投入巨資進(jìn)行核酸藥物的研發(fā)，如諾華和輝瑞公司分別與ISIS和Eyetech公司共同開發(fā)的核酸藥物Vitravene和Macugen已批準(zhǔn)上市，另有幾十個(gè)正在進(jìn)行臨床研究。反義寡核苷酸是一類經(jīng)過人工合成的寡核苷酸片段，長度多為15 30個(gè)核苷酸。 通過堿基互補(bǔ)的原理，干擾相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，或者整個(gè)基因組的復(fù)制，其優(yōu)點(diǎn)在于其理論上的高度靶特異性，是一種理想的具有精確選擇性的基因靶向治療藥物。由于反義寡核苷酸作用的高度特異性，因此被認(rèn)為是極具潛力的抗腫瘤和抗病毒新藥。國外已有一些著名制藥企業(yè)已將反義藥物作為其新藥研究開發(fā)的重點(diǎn)方向之一。反義藥物，其能與特定基因雜交，進(jìn)而在基因水平干擾致病蛋白的產(chǎn)生，具有比傳統(tǒng)藥物更高的特異性和高效性。但是由于反義寡核苷酸的作用靶點(diǎn)必須定位于胞內(nèi)，反義核酸只有在進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)才能起到其應(yīng)有的效果，但它本身是陰離子多聚體，相對分子質(zhì)量大、極性強(qiáng)、電負(fù)性強(qiáng)，這些特性使其難以透過細(xì)胞膜的類脂雙分子層進(jìn)入細(xì)胞，故反義藥物細(xì)胞攝取率低。有報(bào)道稱僅有 2%的反義藥物被細(xì)胞攝取，因此，細(xì)胞攝取是反義藥物研發(fā)過程中的一大挑戰(zhàn)，所以導(dǎo)向入胞是反義藥物及其他細(xì)胞攝取率的藥物研究的一項(xiàng)重要任務(wù)。目前提高反義藥物細(xì)胞攝取量的方法主要有偶聯(lián)多聚陽離子、與陽離子脂質(zhì)體形成反義寡核苷酸脂質(zhì)體復(fù)合物、偶聯(lián)跨膜肽等。這些物質(zhì)雖然能有效地提高反義藥物的細(xì)胞攝取量，但由于它們潛在的細(xì)胞毒性使其臨床應(yīng)用受到了一定的限制，因此亟待尋找更加合適的靶向修飾分子，提高反義寡核苷酸類化合物的胞內(nèi)攝取與藥效。金剛乙胺是一種人工合成抗病毒藥，通過阻止病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞，并抑制病毒的復(fù)制，從而抑制病毒繁殖，起到抗病毒的效果。雖然目前金剛乙胺是不錯(cuò)的抗流感病毒藥物，但流感病毒的抗原漂移使其對金剛乙胺產(chǎn)生了一定的耐藥性。本實(shí)驗(yàn)室以宿主基因PDCD5為靶點(diǎn)，設(shè)計(jì)合成了反義核酸藥物，并證明了其對流感病毒感染所致細(xì)胞病變(cytopathic effect, CPE)有抑制作用，我們命名該序列為 PR0P5，進(jìn)一步為了提高該序列的抗流感活性，克服PR0P5的細(xì)胞攝取率低的缺點(diǎn)，本研究利金剛乙胺或者脂肪鏈偶聯(lián)到PR0P5分子上，以期能夠借助金剛乙胺的透膜性及靶向性提高PR0P5在細(xì)胞中的攝取量，并提高其治療流感的效用。修飾后對該序列的抗流感活性進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)該序列的抗流感活性有了很大的提高。用熒光標(biāo)記的修飾及未修飾序列，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞中的熒光強(qiáng)度，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過修飾的序列進(jìn)入細(xì)胞的速度和量都有很大程度的提尚。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種抗流感病毒藥物設(shè)計(jì)的靶向宿主靶標(biāo)PDCD5阻斷流感病毒復(fù)制、抑制流感病毒致病的寡核苷酸序列修飾結(jié)構(gòu)，制備方法及其藥物。本發(fā)明的主要內(nèi)容是利用化學(xué)合成方法用脂肪鏈或金剛乙胺修飾靶向宿主蛋白 PD⑶5抗甲型流感活性較高的ASODN序列PR0P5，提高了其透膜性，并因此提高該序列的抗流感活性。設(shè)計(jì)了分別在3，、5，修飾脂肪鏈(P-ZF、ZF-P)或者金剛乙胺(P_JG、JG-P)和在 3’端修飾脂肪鏈并在5’端修飾金剛乙胺(JG-P-ZF) 5種針對反義寡核苷酸PR0P5的修飾方法，初步篩選結(jié)果顯示3’端脂肪鏈修飾(P-JG)抑制病毒Hmi (A/京防/86-1)所致CPE 作用最佳，JG-P和P-zf次之。進(jìn)而實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，修飾后的PR0P5序列對H3N2(A/魯防/9/93)及金剛乙胺耐藥株H3N2(A/京防/073103/2009)流感病毒所致CPE抑制IC5tl都降低了 30% 60%，進(jìn)一步用熒光素(FAM)標(biāo)記的PR0P5序列及金剛乙胺修飾的PR0P5序列驗(yàn)證了修飾對細(xì)胞攝取反義序列的影響，結(jié)果表明金剛乙胺修飾在一定程度上提高了細(xì)胞對反義序列的攝取，說明修飾都是提高細(xì)胞對反義核酸序列攝取的有效修飾手段。根據(jù)本發(fā)明，對新型生物工程藥物ASODN可以進(jìn)行有效的化學(xué)修飾。根據(jù)本發(fā)明，P-JG、JG-P, P-ZF, ZF-P, JG-P-ZF能特異性抑制流感病毒的復(fù)制，有可能成為治療及預(yù)防流感病毒感染相關(guān)疾病的新型生物工程藥物。根據(jù)本發(fā)明，為增強(qiáng)反義寡核苷酸的核酸酶抗性、生物利用度及組織靶向性等，本發(fā)明包含了 PR0P5硫代修飾、甲基修飾、金剛乙胺修飾或脂肪鏈修飾。根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的寡核苷酸及其修飾物可按本領(lǐng)域已知方法配成非腸道給藥的制劑。根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的寡核苷酸及其修飾物治療組成可應(yīng)用單獨(dú)的有效成分或組合物形式包括聯(lián)合其他寡核苷酸及其衍生物形式，還可以含有治療上可以接受的載體材料，如脂質(zhì)體、融合肽或病毒載體等。根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的治療組成，依不同情況包括特定藥物的藥物動(dòng)力學(xué)、藥代動(dòng)力學(xué)、給藥模式、給藥途徑、受者的年齡、體重、肝腎功能狀態(tài)、疾病的性質(zhì)、程度及治療時(shí)限等，以適宜的劑量給藥。本發(fā)明的實(shí)施對嚴(yán)重危害人類健康的流感病毒感染的治療具有重要的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。


圖1 PR0P5單端金剛乙胺修飾形成螯合物的成路線圖
圖2 PR0P5單端脂肪鏈修飾形成螯合物合成路線3 PR0P5的金剛乙胺或脂肪鏈螯合物劑量依賴性抑制Hmi型流感病毒所致CPE圖4 PR0P5的金剛乙胺或脂肪鏈螯合物劑量依賴性抑制H3N2型流感病毒所致CPE圖5 PR0P5的金剛乙胺或(和)脂肪鏈螯合物劑量依賴性抑制金剛乙胺耐藥株 H3N2型流感病毒所致CPE圖6 RP-HPLC分析PR0P5純度圖像圖7 RP-HPLC分析P-JG純度圖像圖 8 RP-HPLC 分析 FAM-P-JG 純度圖像圖9熒光倒置顯微鏡觀察0 32小時(shí)不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞對FAM-P和FAM-P-JG的攝取圖10流式細(xì)胞術(shù)檢測0 32小時(shí)細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度值圖11流式細(xì)胞術(shù)測定0 32小時(shí)金剛乙胺修飾對PR0P5透膜的促進(jìn)率圖12熒光倒置顯微鏡觀察0 60分鐘不同時(shí)間點(diǎn)A549細(xì)胞對FAM-P和 FAM-P-JG的攝取圖13流式細(xì)胞術(shù)檢測0 60分鐘細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度值圖14流式細(xì)胞術(shù)測定0 60分鐘金剛乙胺修飾對PR0P5透膜的促進(jìn)率
具體實(shí)施例方式實(shí)施例一本實(shí)施例主要說明經(jīng)過金剛乙胺及脂肪鏈修飾的PR0P5的合成及其在體外A549 細(xì)胞或者M(jìn)DCK細(xì)胞水平抑制Hmi型、H3N2所致CPE活性的研究。材料與方法1.寡核苷酸PR0P5的設(shè)計(jì)和合成檢索GeneBank中的核酸序列數(shù)據(jù)庫，選擇NCBI公布的PD⑶5 mRNA參考序列 NM_004708. 2，對其進(jìn)行RNA 二級結(jié)構(gòu)的計(jì)算機(jī)模擬，選擇了 5個(gè)不穩(wěn)定的莖環(huán)結(jié)構(gòu)作為反義寡核苷酸的作用靶點(diǎn)。通過與GeneBank聯(lián)機(jī)blast序列比對，所選擇的靶序列具有很好的特異性，不會(huì)干擾人類其它正常基因的表達(dá)，在基因上的靶位為151 170，命名該序列為PR0P5。其序列為5，CCCTGTGCTTTGCTTCCTGT3，。寡核苷酸采用8909型自動(dòng)DNA合成儀合成全硫代修飾的反義寡核苷酸。合成完畢濃氨水切割并脫保護(hù)15小時(shí)(hour，h) 后，經(jīng)Micro Pure II反相純化柱(Oligo Prep 0P120，SAVANT)純化，紫外定量后真空干燥，-20°C保存?zhèn)溆谩?. PR0P5單端修飾金剛乙胺(JG)的螯合物的設(shè)計(jì)合成設(shè)計(jì)合成5 ’端金剛乙胺修飾的PROP 5序列(JG-P)，3 ’端金剛乙胺修飾的PROP 5 序列(P-JG)，并進(jìn)行純化與純度分析。合成路線圖見附圖1，偶聯(lián)的工藝設(shè)計(jì)及化合物合成步驟如下1)鹽酸金剛乙胺經(jīng)堿性化合物處理后加入到含有琥珀酸酐的有機(jī)溶劑中，于0 60°C條件下攪拌1 12小時(shí)，蒸除溶劑后重結(jié)晶得到白色結(jié)晶(化合物2)。2)將化合物2溶解于有機(jī)溶劑中，加入2- (4-氨基丁基)_1，3_丙二醇和縮水劑， 于0 50°C條件攪拌1 6小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后蒸除溶劑，重結(jié)晶得白色結(jié)晶(化合物3)。3)將化合物3溶解于有機(jī)溶劑中，然后將DMTCl加入到反應(yīng)體系中，于-10 50°C 下反應(yīng)1 3小時(shí)，蒸除溶劑，然后萃取，濃縮的白色固體(化合物4)。4)化合物4溶解于有機(jī)溶劑中，然后將琥珀酸酐加入到反應(yīng)體系中，于10 80°C 下反應(yīng)1 4小時(shí)，蒸除溶劑重結(jié)晶得白色固體(化合物5)。5)化合物4溶解于有機(jī)溶劑中，然后將磷酰化試劑加入到反應(yīng)體系中，于-10 40°C下惰性氣體保護(hù)反應(yīng)0.5 4小時(shí)，蒸除溶劑，然后萃取，濃縮的白色固體(化合物6)。6)將化合物5的溶液與CPG混合，0 50°C下反應(yīng)5 40小時(shí)，過濾的白色載體 7。7)將載體7 (20. OOmg)裝入DNA合成儀，合成P-JG，然后濃氨水切割，過OPC柱， HPLC分離純化。離心抽干。8)將固體6溶解，裝入DNA合成儀，合成JG_P。反應(yīng)結(jié)束后經(jīng)濃氨水切割，過OPC 柱，HPLC分離純化。離心抽干。在上述過程1)中，反應(yīng)所使用的堿性化合物可以是無機(jī)堿性化合物CaO、MgO、 Na2C03、NaHCO3> Κ0Η、NaOH、K2CO3, KHCO3, KF其中之一。在2~)中反應(yīng)所使用的縮水劑為羰基二咪唑(⑶I)，N-羥基琥珀酰亞胺(HOSu)酯，N-羥基苯并三唑酯(HOBt)，二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)，二異丙基碳二亞胺(DIC)，1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDCI)，4-N， N-二甲基吡啶(DMAP)，4-(4，6-二甲氧基三嗪)-4-甲基嗎啉氯化物(DMT-MM)中的一種或
7幾種。在上述各步反應(yīng)中，所用有機(jī)溶劑為乙腈、丙酮、四氫呋喃、N，N-二甲基亞酰胺、二甲基亞砜、1，2_ 二氯乙烷、三氯乙烷、二氯甲烷、氯仿、和二氧六環(huán)其中之一；重結(jié)晶所用溶劑為水、乙醇、甲醇、異丙醇、丙酮、乙腈、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、四氫呋喃、乙醚、石油醚中的一種或幾種。3. PR0P5單端修飾脂肪鏈形成螯合物的設(shè)計(jì)合成設(shè)計(jì)合成5’端脂肪鏈修飾的PROP 5序列(ZF-P)，3’端脂肪鏈修飾的PROP 5序列(P-ZF)，并進(jìn)行純化與純度分析。合成路線見附圖2，偶聯(lián)的工藝設(shè)計(jì)及操作過程如下 1)將二十二酸1溶解于有機(jī)溶劑中，將氨基醇2的溶液加入到其中，加入縮水劑DCC，于0 60°C條件下攪拌1 12小時(shí)，蒸除溶劑后重結(jié)晶得淺黃色結(jié)晶(化合物3)。2)將化合物3溶解于有機(jī)溶劑中，然后將DMTCl加入到反應(yīng)體系中，于-10 50°C 下反應(yīng)1 3小時(shí)，蒸除溶劑，然后萃取，濃縮的淺黃色蠟狀固體(化合物4)。3)化合物4溶解于有機(jī)溶劑中，然后將琥珀酸酐加入到反應(yīng)體系中，于10 80°C 下反應(yīng)1 4小時(shí)，蒸除溶劑重結(jié)晶得淺黃色固體(化合物5)。4)化合物4溶解于有機(jī)溶劑中，然后將磷?；噭┘尤氲椒磻?yīng)體系中，于-10 40°C下惰性氣體保護(hù)反應(yīng)0. 5 4小時(shí)，蒸除溶劑，然后萃取，濃縮的白色泡沫狀固體(化合物6)。5)將化合物5的溶液與CPG混合，0 50°C下反應(yīng)5 40小時(shí)，過濾得白色載體 7。6)將載體7裝入DNA合成儀，合成P-ZF，然后濃氨水切割，過OPC柱，HPLC分離純
化。離心抽干。7)將固體6溶解，裝入DNA合成儀，合成ZF_P。反應(yīng)結(jié)束后經(jīng)濃氨水切割，過OPC 柱，HPLC分離純化。離心抽干。4. PR0P5 3’端脂肪鏈修飾并且5’端金剛乙胺修飾螯合物(JG_P_ZF)的合成參照材料與方法3合成的固體7，將載體7裝入DNA合成儀，合成P_ZF，參照材料與方法2合成的固體6，并溶解，裝入DNA合成儀，合成JG-P-ZF。反應(yīng)結(jié)束后經(jīng)濃氨水切割， 過OPC柱，HPLC分離純化。離心抽干。5. A549細(xì)胞、MDCK細(xì)胞、病毒和對照藥物病毒在10日齡SPF雞胚傳代，收集尿囊液，測定其血凝(Hemagglutination，HA) 效價(jià)，取HA價(jià)>1 26者，混勻、分裝、保存于-70°C備用。使用的病毒毒株為A/京防 /86-1 (HlNl)、A/ 魯防 /9/93 (H3N2)，金剛乙胺耐藥病毒株 A/ 京防 /073103/2009 (H3N2)。 A549細(xì)胞培養(yǎng)液為含10%胎牛血清(Gibco)的FlI培養(yǎng)液；MDCK細(xì)胞培養(yǎng)液為含10%胎牛血清(Gibco)的DMEM培養(yǎng)液，細(xì)胞孵育培養(yǎng)條件為5%濃度C02，37°C，病毒感染和CPE測定時(shí)使用含胎牛血清和5mg/ml胰蛋白酶的維持液?？沽鞲胁《娟栃詫φ账幬餅榻饎傄野?。6.偶聯(lián)金剛乙胺及脂肪鏈后的PR0P5抑制Hmi型流感病毒所致CPE的劑量依賴作用A549細(xì)胞貼壁培養(yǎng)至對數(shù)生長期，胰酶消化收集細(xì)胞，將A549細(xì)胞鋪96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，次日60 80%長滿。用含F(xiàn)BS的FlI培養(yǎng)基倍比稀釋PR0P5、JG-P, P-JG,ZF-P 及 P-ZF 至 0. 125,0. 25,0. 5,1. 0,2. 0 μ mol/L( μ Μ)。以 PBS (ρΗ7. 5)沖洗一次，加入 100TCID50/0. Iml 的 Η3Ν2 型病毒稀釋液 50 μ 1，37°C感染孵育 60min。再以 PBS (pH7. 5)沖洗一次，分別加入100 μ 1不同濃度的JG-P、P-JG, ZF-P, P-ZF和同濃度PR0P5，同時(shí)設(shè)立鹽酸金剛乙胺陽性藥對照、病毒感染對照和正常Α549細(xì)胞對照。37°C培養(yǎng)2天(d)。利用 CellTiter96 Aqueous One Solution 試劑盒(Promega 產(chǎn)品)測定 CPE 程度(以 OD490 表示)，計(jì)算藥物抑制Hmi型流感病毒所致CPE抑制率和IC5(1。7.偶聯(lián)金剛乙胺及脂肪鏈后的PR0P5抑制H3N2型流感病毒所致CPE的劑量依賴作用參照實(shí)施例一材料與方法6將A549細(xì)胞鋪96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，次日60 80%長滿。用含 1 % FBS 的 F12K 培養(yǎng)基倍比稀釋 PR0P5、JG-P、P-JG, ZF-P 及 P-ZF 至 0. 1,0. 2、 0. 4,0. 8、1. 6μΜ。用 PBS(ρΗ7. 5)沖洗一次，加入 100TCID50/0. Iml 的 Η3Ν2 型病毒稀釋液50μ 1，37°C感染孵育60min。再以PBS(pH7. 5)沖洗一次，分別加入100 μ 1不同濃度的 JG-P、P-JG、ZF-P、P-ZF和同濃度PR0P5，同時(shí)設(shè)立鹽酸金剛乙胺陽性藥對照、病毒感染對照和正常 A549 細(xì)胞對照。37°C培養(yǎng) 2 天(d)。利用 CellTiter96 Aqueous One Solution 試劑盒(Promega產(chǎn)品)測定CPE程度(以O(shè)D49tl表示)，計(jì)算藥物抑制H3N2型流感病毒所致 CPE抑制率和IC5tl。8.偶聯(lián)金剛乙胺及脂肪鏈后PR0P5抑制金剛乙胺耐藥毒株H3N2型流感病毒所致 CPE的劑量依賴作用參照實(shí)施例一材料與方法6將MDCK細(xì)胞鋪板96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，次日60 80 % 長滿。用含1 % FBS的DMEM培養(yǎng)基倍比稀釋PR0P5、JG-P, P-JG, ZF-P, P-ZF及JG-P-ZF至 0. 1、0. 2、0. 4、0. 8、1. 6μΜ。以 PBS(pH7. 5)沖洗一次，加入 100TCID50/0. Iml 的金剛乙胺耐藥H3N2型病毒稀釋液50μ 1，37°C感染孵育60min。再以PBS (pH7. 5)沖洗一次，分別加入 100 μ 1不同濃度的JG-P、P-JG、ZF-P、P-ZF、JG-P-ZF和同濃度PR0P5，同時(shí)設(shè)立鹽酸金剛乙胺陽性藥對照、病毒感染對照和正常A549細(xì)胞對照。37°C培養(yǎng)3天(d)。利用CellTiter96 Aqueous One Solution試劑盒(Promega產(chǎn)品)測定CPE程度(以O(shè)D49tl表示)，計(jì)算藥物抑制H3N2型流感病毒所致CPE抑制率和IC5tl。結(jié)果1.偶聯(lián)化合物的合成合成分別得到新PR0P5的5’端或3’端金剛乙胺修飾的化合物JG-P和P-JG ；PR0P5 的5’端或3’端脂肪鏈修飾的化合物ZF-P和P-ZF ；及5’端金剛乙胺并且3’脂肪鏈修飾的化合物JG-P-ZF，對合成后樣品進(jìn)行RP-HPLC分析，化合物純度在95%以上。RP-HPLC分析結(jié)果顯示，未進(jìn)行任何修飾的反義寡核苷酸PR0P5與螯合物的色譜保留時(shí)間不一致，偶聯(lián)后化合物的色譜保留時(shí)間增加。2.偶聯(lián)金剛乙胺或脂肪鏈后的PR0P5抑制Hmi型流感病毒所致CPE的劑量依賴作用PR0P5、JG-P, P-JG, ZF-P, P-ZF及金剛乙胺抑制Hmi型流感病毒所致CPE檢測結(jié)果得出，PR0P5組抑制Hmi型流感病毒所致CPE的IC5tl為0. 625 μ Μ,鹽酸金剛乙胺陽性藥對照組抑制Hmi型流感病毒所致CPE的IC5tl為0. 746 μ Μ, P-ZF組抑制Hmi型流感病毒所致CPE的IC5tl為0. 137 μ Μ，如圖3所示，與未修飾相比，3’端脂肪鏈修飾后PR0P5對流感病毒所致CPE的抑制IC5tl降低了 78%左右，5，端金剛乙胺修飾后JG-P抑制Hmi型流感病毒所致CPE的IC5tl為0. 141 μ Μ，3’端金剛乙胺修飾后P-JG抑制Hmi型流感病毒所致CPE的 IC50為0. 214 μ Μ，5，端或者3，端金剛乙胺修飾后JG-P或者P-JG抑制Hmi型流感病毒所致CPE的IC5tl為分別下降了 77%或者65%左右。3.偶聯(lián)金剛乙胺或脂肪鏈后的PR0P5抑制Η3Ν2型流感病毒所致CPE的劑量依賴作用PR0P5、JG-P, P-JG, ZF-P, P-ZF及金剛乙胺抑制Η3Ν2型流感病毒所致CPE檢測結(jié)果得出，PR0P5組抑制Η3Ν2型流感病毒所致CPE的IC5tl為0. 325 μ Μ,鹽酸金剛乙胺對Η3Ν2 型流感病毒所致CPE抑制作用劑量依賴關(guān)系不明顯，P-ZF組抑制Η3Ν2型流感病毒所致CPE 的IC5tl為0. 175 μ Μ，如圖4所示，與未修飾相比，3’端脂肪鏈修飾后PR0P5對流感病毒所致 CPE的抑制IC5tl降低了 46%左右，5，端金剛乙胺修飾后JG-P抑制Hmi型流感病毒所致CPE 的IC5tl為0. 213 μ Μ，3，端金剛乙胺修飾后P-JG抑制Hmi型流感病毒所致CPE的IC5tl為 0. 141 μ Μ，5’端或者3’端金剛乙胺修飾后JG-P或者P-JG抑制Hmi型流感病毒所致CPE 的IC5tl為分別下降了 34%或者56%左右。4.偶聯(lián)金剛乙胺及脂肪鏈后PR0P5抑制金剛乙胺耐藥毒株Η3Ν2型流感病毒所致 CPE的劑量依賴作用PJG抑制金剛乙胺耐藥Η3Ν2型流感病毒所致CPE檢測結(jié)果得出，PR0P5組抑制金剛乙胺耐藥Η3Ν2型流感病毒所致CPE的IC5tl為0. 391 μ Μ，鹽酸金剛乙胺對金剛乙胺耐藥 Η3Ν2型流感病毒所致CPE抑制作用無劑量依賴性，JG-P-ZF組抑制金剛乙胺耐藥Η3Ν2型流感病毒所致CPE的IC5tl為0. 316 μ Μ, P-ZF組抑制金剛乙胺耐藥Η3Ν2型流感病毒所致CPE 的IC5tl為0. 164 μ Μ，如圖5所示，與未修飾相比，3’端脂肪鏈修飾后PR0P5對金剛乙胺耐藥 Η3Ν2型流感病毒所致CPE的IC5tl降低了 47%左右。結(jié)論通過3’端偶聯(lián)金剛乙胺或者脂肪鏈，或者5’端偶聯(lián)金剛乙胺可以在各個(gè)濃度下都提高了 PR0P5對流感病毒Hmi所致CPE抑制率，并有效降低抑制流感病毒Hmi所致CPE 的 ic5Q。通過3’端偶聯(lián)金剛乙胺或者脂肪鏈，或者5’端偶聯(lián)金剛乙胺可以在各個(gè)濃度下都提高了 PR0P5對流感病毒H3N2所致CPE抑制率，并有效降低抑制流感病毒H3N2所致CPE 的 ic5Q。通過3’端偶聯(lián)脂肪鏈，PR0P5對金剛乙胺耐藥流感病毒H3N2所致CPE抑制IC5tl 降低了 47%。PR0P5對甲型流感病毒的抑制存在普遍性，金剛乙胺修飾或者脂肪鏈修飾后， PR0P5抵抗甲型流感病毒感染的活性增強(qiáng)。實(shí)施例二 ；本實(shí)施例主要說明靶向人PDCD5基因抗流感病毒反義寡核苷酸(PR0P5)金剛乙胺修飾物熒光標(biāo)素(FAM)標(biāo)記的設(shè)計(jì)、合成和促進(jìn)細(xì)胞攝取效率的驗(yàn)證。材料與方法1. A549 細(xì)胞A549細(xì)胞培養(yǎng)液為含10%胎牛血清(Gibco)的FlI培養(yǎng)液，貼壁培養(yǎng)至對數(shù)生長期，用胰酶消化收集細(xì)胞，鋪6孔培養(yǎng)板，貼壁培養(yǎng)至70%細(xì)胞融合加藥進(jìn)行試驗(yàn)。細(xì)胞孵育培養(yǎng)條件為5%濃度C02，37°C，加藥時(shí)使用含胎牛血清和5mg/ml胰蛋白酶的維持液。2.金剛乙胺與PR0P5的偶聯(lián)及熒光素修飾參照實(shí)施例材料與方法1和2，使用優(yōu)化合成路線及各步反應(yīng)條件進(jìn)行合成，合成高純度的3’端與金剛乙胺偶聯(lián)的PR0P5-金剛乙胺序列(P-JG)并借助各類分析手段確保得到的偶聯(lián)化合物純度高、結(jié)構(gòu)正確。所得產(chǎn)物在5’端修飾熒光素(FAM)得到5’端FAM 標(biāo)記3’端金剛乙胺修飾的螯合物(FAM-P-JG)。參照實(shí)施例材料與方法1合成PR0P5序列， 將PR0P5序列同樣用熒光素標(biāo)記得到5’端FAM修飾的PR0P5序列(FAM-P)。3.熒光顯微鏡觀察細(xì)胞對FAM-P和FAM-P-JG的攝取一用含1 %胎牛血清和5mg/ml胰蛋白酶的F12K培養(yǎng)基稀釋FAM-P和FAM-P-JG至 1. ομ M，細(xì)胞1. 0 μ M給藥0、l、2、4、8、16、32h后將細(xì)胞培養(yǎng)液棄去，用PBS (pH = 7. 4)將6 孔培養(yǎng)板中的細(xì)胞洗3遍，洗去胞外的熒光物質(zhì)，之后向6孔培養(yǎng)板中加入2ml PBS (pH = 7. 4)緩沖液，置熒光顯微鏡下觀察熒光強(qiáng)度并拍照。4.流式細(xì)胞儀分析檢測細(xì)胞對FAM-P和FAM-P-JG的攝取一用含1 %胎牛血清和5mg/ml胰蛋白酶的F12K培養(yǎng)基稀釋FAM-P和FAM-P-JG至 1.0μM，細(xì)胞1.0μM給藥0、l、2、4、8、16、32h后將細(xì)胞培養(yǎng)液棄去，PBS(pH = 7. 4)洗3遍， 胰酶消化并收集細(xì)胞，PBS (pH = 7. 4)重懸細(xì)胞后，1000r/min離心5min，棄上清，沉淀用含
0.胎牛血清的PBS重懸成均勻的細(xì)胞懸液，采用流式細(xì)胞儀檢測不同時(shí)間點(diǎn)的胞內(nèi)熒光值強(qiáng)度。5.熒光顯微鏡觀察細(xì)胞對FAM-P和FAM-P-JG的攝取二用含1 %胎牛血清和5mg/ml胰蛋白酶的F12K培養(yǎng)基稀釋FAM-P和FAM-P-JG至
1.Ομ M，細(xì)胞1. O μ M給藥0、15、30、45、60min后將細(xì)胞培養(yǎng)液棄去，用PBS (pH = 7. 4)將6 孔培養(yǎng)板中的細(xì)胞洗3遍，洗去胞外的熒光物質(zhì)，之后向6孔培養(yǎng)板中加入2ml PBS (pH = 7. 4)緩沖液，置熒光顯微鏡下觀察熒光強(qiáng)度并拍照。6.流式細(xì)胞儀分析檢測細(xì)胞對FAM-P和FAM-P-JG的攝取二用含1 %胎牛血清和5mg/ml胰蛋白酶的F12K培養(yǎng)基稀釋FAM-P和FAM-P-JG至 1. ΟμΜ，細(xì)胞1. ΟμΜ給藥0、15、30、45、60min后后將細(xì)胞培養(yǎng)液棄去，PBS (pH = 7. 4)洗3 遍，胰酶消化并收集細(xì)胞，PBS (pH = 7. 4)重懸細(xì)胞后，1000r/min離心5min，棄上清，沉淀用含0. 胎牛血清的PBS重懸成均勻的細(xì)胞懸液，采用流式細(xì)胞儀檢測不同時(shí)間點(diǎn)的胞內(nèi)熒光值強(qiáng)度。結(jié)果1.金剛乙胺與PR0P5螯合物的合成合成得到新的5 ’端FAM修飾和3 ’端金剛乙胺修飾PR0P5的化合物FAM-P-JG和5 ’ 端FAM修飾PR0P5的化合物FAM-P，對合成后樣品進(jìn)行RP-HPLC分析，化合物純度在95 %以上(FAM-P-JG純度81. 27%). RP-HPLC分析結(jié)果顯示，只進(jìn)行FAM任何修飾的反義寡核苷酸FAM-P與偶聯(lián)化合物FAM-P-JG的色譜保留時(shí)間不一致，偶聯(lián)金剛乙胺后化合物FAM-P-JG 的色譜保留時(shí)間增加，典型的分析圖像如圖6、圖7、圖8所示。2.熒光顯微鏡觀察PR0P5偶聯(lián)金剛乙胺前后的胞內(nèi)攝取一
由于FAM-P與FAM-P-JG的5，端都帶有熒光素(FAM)，F(xiàn)AM在波長480 520nm范圍內(nèi)激發(fā)出綠色熒光，因此可以利用FAM在激發(fā)光下發(fā)出綠色熒光的強(qiáng)度比較其細(xì)胞攝取量的多少。熒光顯微鏡觀察結(jié)果如圖9所示，PR0P5與金剛乙胺偶聯(lián)后形成的化合物FAM-P-JG 作用于A549細(xì)胞后的熒光強(qiáng)度強(qiáng)于FAM-P，在Ih之前，顯微鏡觀察FAM-P-JG與FAM-P的熒光強(qiáng)度相差不大，而在4h時(shí)，F(xiàn)AM-P-JG熒光強(qiáng)度比FAM-P要強(qiáng)，且均比池時(shí)的熒光強(qiáng)度強(qiáng)， 隨著孵育時(shí)間增加，熒光強(qiáng)度進(jìn)一步增強(qiáng)，且FAM-P-JG組的熒光強(qiáng)度明顯強(qiáng)于FAM-P組。3.流式細(xì)胞術(shù)定量分析PR0P5偶聯(lián)金剛乙胺后細(xì)胞攝取的差異一熒光顯微鏡檢測可以直接的觀察到藥物在細(xì)胞內(nèi)的分布，但由于其無法準(zhǔn)確定量，因此采用流式細(xì)胞術(shù)定量檢測PR0P5偶聯(lián)金剛乙胺前后A549細(xì)胞對藥物FAM-P和 FAM-P-JG攝取的差異。各個(gè)時(shí)間點(diǎn)金剛乙胺修飾組的熒光強(qiáng)度值都比未用金剛乙胺修飾的要高，并且在0 32h中強(qiáng)度值一直在增加，如圖10所示，但計(jì)算修飾后對細(xì)胞攝取的促進(jìn)增加的百分比可以得出，隨著時(shí)間的延長，修飾對細(xì)胞攝取的促進(jìn)的程度在降低，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的促進(jìn)程度如圖11所示。由于在Ih細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度，已經(jīng)相當(dāng)高，所以下步實(shí)驗(yàn)將 O-Ih的時(shí)間段進(jìn)行了進(jìn)一步的細(xì)化。4.熒光顯微鏡觀察PR0P5偶聯(lián)金剛乙胺前后胞內(nèi)攝取二熒光顯微鏡觀察結(jié)果如圖12所示，PR0P5與金剛乙胺偶聯(lián)后形成的化合物 FAM-P-JG作用于A549細(xì)胞后的熒光強(qiáng)度強(qiáng)于FAM-P。在45min以前，F(xiàn)AM-P-JG與FAM-P的熒光強(qiáng)度看似相差不大，而在45min及其以后，F(xiàn)AM-P-JG熒光強(qiáng)度明顯比FAM-P要強(qiáng)。5.流式細(xì)胞術(shù)定量分析不同時(shí)間點(diǎn)PR0P5偶聯(lián)金剛乙胺后細(xì)胞攝取的差異二采用流式細(xì)胞術(shù)定量檢測0-60min各個(gè)時(shí)間點(diǎn)PR0P5偶聯(lián)金剛乙胺前后(FAM-P 與FAM-P-JG)A549細(xì)胞對藥物攝取(細(xì)胞自發(fā)熒光值2. 6左右)的差異，發(fā)現(xiàn)0-60min各個(gè)時(shí)間點(diǎn)FAM-P-JG組的熒光強(qiáng)度值都比FAM-P的要高，如圖13所示，但計(jì)算修飾后對細(xì)胞攝取的促進(jìn)增加的百分比可以得出，隨著時(shí)間的延長，在0-60min中修飾對細(xì)胞攝取的促進(jìn)的程度先降低后升高，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的促進(jìn)程度如圖14所示。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果證明FAM-P-JG組的細(xì)胞攝取能力均比FAM-P組強(qiáng)，且細(xì)胞攝取量呈現(xiàn)時(shí)間依賴性。但在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)上，偶聯(lián)金剛乙胺對反義序列PR0P5進(jìn)入細(xì)胞的促進(jìn)效率不同，在加入反義藥物的幾秒鐘內(nèi)，F(xiàn)AM-P-JG組的細(xì)胞熒光強(qiáng)度比FAM-P組增強(qiáng)了 90% 130%，而在30分鐘 (minute,min)時(shí)促進(jìn)度降低到了 80%左右，在60min時(shí)，促進(jìn)程度又回升到了 120%左右， 可能是因?yàn)镕AM-P-JG的極性較低，比FAM-P序列對細(xì)胞膜有著更高的親和力，F(xiàn)AM-P-JG初加入時(shí)就比FAM-P更多的吸附在細(xì)胞膜上，所以用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示金剛乙胺修飾對反義序列入胞的促進(jìn)度非常高，在加入反義序列的30min左右應(yīng)該是反義序列在細(xì)胞膜上吸附與脫落達(dá)到平衡的一個(gè)時(shí)間段，此時(shí)反義序列在細(xì)胞膜表面分布尚未大量進(jìn)入細(xì)胞，所以該時(shí)間點(diǎn)的熒光數(shù)據(jù)應(yīng)該是明確顯示了修飾對反義序列與細(xì)胞親和作用的提高，此后，反義序列開始進(jìn)入細(xì)胞，由于細(xì)胞表面FAM-P-JG比FAM-P序列的濃度要高，所以更快的在細(xì)胞中累積，所以促進(jìn)程度又有可能上升。加入反義序列Ih至3 整個(gè)過程中，金剛乙胺修飾對反義序列入胞的促進(jìn)程度逐漸降低，原因可能是金剛乙胺修飾后反義序列入胞較快，培養(yǎng)基中的序列濃度降低也比FAM-P快，降低了序列靠近細(xì)胞膜的幾率，同時(shí)修飾后細(xì)胞內(nèi)FAM-P-JG反義序列濃度的升高也比FAM-P快，F(xiàn)AM-P-JG有可能比 FAM-P在細(xì)胞內(nèi)外產(chǎn)生更高的序列濃度差，這樣就增加了 FAM-P-JG進(jìn)入細(xì)胞的難度，所以FAM-P-JG與FAM-P序列在細(xì)胞中的濃度也逐漸趨于平衡。結(jié)論FAM-P-JG比FAM-P具有更高的細(xì)胞攝取效率，金剛乙胺修飾可以降低ASODN序列的電負(fù)性，提高細(xì)胞對反義序列的攝取效率，提高反義藥物的細(xì)胞利用度。
權(quán)利要求
1.一種脂肪鏈或金剛乙胺修飾的寡核苷酸的結(jié)構(gòu)、制備方法，及其在制備用于治療流感病毒感染及其相關(guān)疾病的藥物中的用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脂肪鏈或者金剛乙胺修飾的寡核苷酸，其結(jié)構(gòu)通式選自下列五類結(jié)構(gòu)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的寡核苷酸，其特征是經(jīng)過不同化學(xué)修飾。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的化學(xué)修飾，其化學(xué)修飾為硫代修飾。
5.根據(jù)權(quán)利要求1，2，3，4所述的脂肪鏈或金剛乙胺修飾的寡核苷酸，可以制成各種不同的劑型，通過不同的給藥途徑用于流感病毒感染及其相關(guān)性疾病的治療。
6.根據(jù)權(quán)利要求1，2，3，4，5所述的脂肪鏈或金剛乙胺修飾的寡核苷酸，其特征在于， 通過如下步驟合成1)鹽酸金剛乙胺經(jīng)堿性化合物處理后加入到含有琥珀酸酐的有機(jī)溶劑中，于O 60°C 條件下攪拌1 12小時(shí)，蒸除溶劑后重結(jié)晶得到白色結(jié)晶(化合物2)；2)將化合物2溶解于有機(jī)溶劑中，加入2-(4-氨基丁基)-1，3-丙二醇和縮水劑，于O 50°C條件攪拌1 6小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后蒸除溶劑，重結(jié)晶得白色結(jié)晶(化合物3)；3)將化合物3溶解于有機(jī)溶劑中，然后將DMTCl加入到反應(yīng)體系中，于-10 50°C下反應(yīng)1 3小時(shí)，蒸除溶劑，然后萃取，濃縮的白色固體(化合物4)；4)化合物4溶解于有機(jī)溶劑中，然后將琥珀酸酐加入到反應(yīng)體系中，于10 80°C下反應(yīng)1 4小時(shí)，蒸除溶劑重結(jié)晶得白色固體(化合物5)；5)化合物4溶解于有機(jī)溶劑中，然后將磷?；噭┘尤氲椒磻?yīng)體系中，于-10 40°C 下惰性氣體保護(hù)反應(yīng)0.5 4小時(shí)，蒸除溶劑，然后萃取，濃縮的白色固體(化合物6)；6)將化合物5的溶液與CPG混合，O 50°C下反應(yīng)5 40小時(shí)，過濾的白色載體7；7)將載體7(20. OOmg)裝入DNA合成儀，合成P-JG，然后濃氨水切割，過OPC柱，HPLC分離純化，離心抽干；8)將固體6溶解，裝入DNA合成儀，合成JG-P，反應(yīng)結(jié)束后經(jīng)濃氨水切割，過OPC柱， HPLC分離純化，離心抽干；或者a)將二十二酸1溶解于有機(jī)溶劑中，將氨基醇2的溶液加入到其中，加入縮水劑DCC， 于0 60°C條件下攪拌1 12小時(shí)，蒸除溶劑后重結(jié)晶得淺黃色結(jié)晶(化合物3)；b)將化合物3溶解于有機(jī)溶劑中，然后將DMTCl加入到反應(yīng)體系中，于-10 50°C下反應(yīng)1 3小時(shí)，蒸除溶劑，然后萃取，濃縮的淺黃色蠟狀固體(化合物4)；c)化合物4溶解于有機(jī)溶劑中，然后將琥珀酸酐加入到反應(yīng)體系中，于10 80°C下反應(yīng)1 4小時(shí)，蒸除溶劑重結(jié)晶得淺黃色固體(化合物5)；d)化合物4溶解于有機(jī)溶劑中，然后將磷?；噭┘尤氲椒磻?yīng)體系中，于-10 40°C 下惰性氣體保護(hù)反應(yīng)0. 5 4小時(shí)，蒸除溶劑，然后萃取，濃縮的白色泡沫狀固體(化合物 6)；e)將化合物5的溶液與CPG混合，0 50°C下反應(yīng)5 40小時(shí)，過濾得白色載體7；f)將載體7裝入DNA合成儀，合成P-ZF，然后濃氨水切割，過OPC柱，HPLC分離純化， 離心抽干；g)將固體6溶解，裝入DNA合成儀，合成ZF-P，反應(yīng)結(jié)束后經(jīng)濃氨水切割，過OPC柱， HPLC分離純化，離心抽干；或者將f)中載體7裝入DNA合成儀，合成P-ZF，5)中合成的化合物6溶解，裝入DNA合成儀反應(yīng)，合成JG-P-ZF，反應(yīng)結(jié)束后經(jīng)濃氨水切割，過OPC柱，HPLC分離純化，離心抽干。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一類寡核苷酸的合成工藝，在上述過程1)中，反應(yīng)所使用的堿性化合物可以是無機(jī)堿性化合物CaO、MgO、Na2C03、NaHCO3> KOH、NaOH、K2CO3, KHCO3, KF其中之一，在2)中反應(yīng)所使用的縮水劑為羰基二咪唑(⑶I)，N-羥基琥珀酰亞胺(HOSu)酯， N-羥基苯并三唑酯(HOBt)，二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)，二異丙基碳二亞胺(DIC)，1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDCI)，4-N，N-二甲基吡啶(DMAP)，4-G，6-二甲氧基三嗪)-4-甲基嗎啉氯化物(DMT-MM)中的一種或幾種；在a)中反應(yīng)所使用的縮水劑為羰基二咪唑，N-羥基琥珀酰亞胺酯，N-羥基苯并三唑酯，二環(huán)己基碳二亞胺，二異丙基碳二亞胺，1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亞胺，4-N，N-二甲基吡啶，4-(4，6-二甲氧基三嗪)-4-甲基嗎啉氯化物中的一種或幾種。
8.根據(jù)權(quán)利要求6，在上述各步反應(yīng)中，所用有機(jī)溶劑為乙腈、丙酮、四氫呋喃、N，N-二甲基亞酰胺、二甲基亞砜、1，2-二氯乙烷、三氯乙烷、二氯甲烷、氯仿、和二氧六環(huán)其中之一； 重結(jié)晶所用溶劑為水、乙醇、甲醇、異丙醇、丙酮、乙腈、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、四氫呋喃、乙醚、石油醚中的一種或幾種。
9.根據(jù)權(quán)利要求6，在e)中所使用的載體可以是通過固相或液相合成。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種抗流感病毒寡核苷酸藥物的結(jié)構(gòu)和用途。具體說是發(fā)現(xiàn)金剛乙胺或者脂肪鏈修飾靶向抗病毒的宿主靶標(biāo)程序死亡蛋白5(PDCD5)抗流感病毒病毒(IV)反義寡核苷酸的結(jié)構(gòu)，制備方法和用途。本實(shí)驗(yàn)室用化學(xué)合成的方法把金剛乙胺或者脂肪鏈偶聯(lián)在篩選到的抗流感反義序列上，RS-HPLC發(fā)現(xiàn)反義序列的電負(fù)性和極性被降低，用熒光素標(biāo)記的方法在A549細(xì)胞上證明了修飾促進(jìn)了細(xì)胞對反義序列的攝取，在A549和MDCK細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)修飾能夠提高反義序列的抗甲型流感病毒H1N1、H3N2及金剛乙胺耐藥株H3N2所致細(xì)胞病變的活性，因此，本發(fā)明涉及到用化學(xué)修飾的方法降低核酸類藥物極性，提高核酸類藥物的生物利用度、降低用藥量、提高抗病毒療效的新型核酸藥物改進(jìn)的方法。
文檔編號C07H1/00GK102351932SQ20111018864
公開日2012年2月15日 申請日期2011年7月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月7日
發(fā)明者丁曉然, 劉娟, 周喆, 張京玉, 楊靜, 王升啟, 趙海豹, 鐘芝茵, 魯?shù)さ?申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所