專利名稱：一種酪蛋白降血壓肽的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及多肽的制備及初步分離技術(shù)。
背景技術(shù)：
IfiI Jili, iii^^j ACE φ (Angiotensin-converting Enzyme Inhibitory Peptides, ACEIP)是一類能夠降低人體血壓的小分子肽，它是血管緊張素轉(zhuǎn)換酶 (Angiotensin-converting Enzyme, ACE)的抑制劑，可通過抑制血管緊張素I向血管緊張素II轉(zhuǎn)換以及阻止ACE降解緩激肽而起到降低血壓的作用。盡管目前的多種化學(xué)合成肽類可以抑制ACE活性，但都有一定的副作用，且由于他們的作用時間不長，停藥后會使血壓反彈，而大量的實驗證明乳蛋白來源的ACE抑制肽具有較高的體內(nèi)降壓作用，主要集中在小分子的肽類。1979年Oshima等最早報道食品蛋白源ACE抑制肽是由細(xì)菌膠原酶降解明膠獲得的六條活性肽，并證實抑制ACE活性的肽分子量主要集中在1500u以下。1982年 Maruyamas第一次從酪蛋白的胰蛋白酶水解液中分離出具有ACE抑制作用的十二肽、七肽、 六肽和五肽。目前酶法制備酪蛋白降血壓肽的方法包括直接酶解法和利用微生物間接酶解法，直接酶解又可分為單酶水解和復(fù)合酶水解。Nakamura和Yamamoto等采用微生物間接酶解法從酸牛乳、干酪中得到了具ACE抑制作用的降血壓肽；Maruyama^Saito、Miguel、 Jiang等陸續(xù)從酪蛋白的酶水解液中得到大量的具ACE抑制作用的降壓肽。目前已有的文獻(xiàn)報道的無論是單酶或復(fù)合酶水解酪蛋白，均為一步酶解法，上述方法得到的降血壓肽的分子量主要集中在1500u左右。本發(fā)明模擬人體胃腸道消化的方式，采用胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶單酶和復(fù)合酶兩步酶解法制備酪蛋白降血壓肽，較一步酶解法得到的降血壓肽分子量更小、 體內(nèi)吸收更容易。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種以酪蛋白為原料生產(chǎn)降血壓肽的方法，通過模擬人體胃腸道消化的方式，采用兩步酶解法獲得具有高ACE抑制活性，且易于體內(nèi)吸收的小分子降血壓肽。本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的，一種酪蛋白降血壓肽的制備方法如下(1)酪蛋白為原料，加水配制成質(zhì)量濃度為 3%的酪蛋白懸濁液，85°C 95°C保持IOmin使酪蛋白變性，冷卻至室溫后調(diào)節(jié)pH = 1. 5 2. 0，水解溫度為35°C 40°C，每Ig酪蛋白加胃蛋白酶25000U 35000U，水解時間為1 3h ；(2)酶解結(jié)束后80°C 90°C保持IOmin滅酶，冷卻至室溫后4000r/min離心；(3)取步驟(2)所得上清液，調(diào)節(jié)pH = 7. 5 8. 0，水解溫度為45°C 50°C，每Ig 酪蛋白加胰蛋白酶10000U 20000U和胰凝乳蛋白酶10000U 20000U，水解時間為4 6h ；(4)酶解結(jié)束后80°C 90°C保持IOmin滅酶，冷卻至室溫后4000r/min離心，上清液真空濃縮后冷凍干燥得酪蛋白降血壓肽粗品。(5)取步驟(4)的酪蛋白降血壓肽粗品，配制20mg/ml的多肽溶液IOOmL,加入30g 的DA201-C大孔吸附樹脂，30°C條件下靜態(tài)吸附3 5h，依次用25%、50 %、75%、100%乙醇洗脫1 3h，收集并濃縮75%的乙醇洗脫組分。(6)取步驟(5)中的75%的乙醇洗脫組分，利用S印hadex G-IO凝膠層析進(jìn)一步分離，超純水lmL/min的流速進(jìn)行洗脫，收集第二個洗脫峰，真空濃縮后冷凍干燥得粉末狀酪蛋白降血壓肽。本發(fā)明所具有的優(yōu)點(1)本發(fā)明提出了一種制備酪蛋白降血壓肽的新方法，通過模擬人體胃腸道消化的方式，采用兩步酶解法。此法安全、無毒副作用，工藝簡單易行，便于工業(yè)化生產(chǎn)。(2)本發(fā)明制備的降血壓肽分子量分布在IOOOu以下、主要集中在600u左右，易于體內(nèi)吸收，且具高ACE抑制活性。(3)本發(fā)明制備的降血壓肽來源于牛乳酪蛋白，因此具有安全、無毒副作用，對正常血壓無作用等特點，可用于制備降血壓藥物和食品。
具體實施例方式實施例1本發(fā)明所述一種酪蛋白降血壓肽的制備方法，以酪蛋白為原料，每1. 5g酪蛋白加水100mL，85°C 95°C保持IOmin使酪蛋白變性，冷卻至室溫后調(diào)節(jié)pH = 1. 8，水解溫度為 37°C，每Ig酪蛋白加胃蛋白酶29000U，水解2h，在80°C 90°C條件下保持IOmin滅酶，冷卻至室溫后4000r/min離心，將上清液調(diào)節(jié)pH = 7. 8，水解溫度為48°C，每Ig酪蛋白加胰蛋白酶15000U和胰凝乳蛋白酶15000U，水解5h，在80°C 90°C條件下保持IOmin滅酶，冷卻至室溫后4000r/min離心，將上清液真空濃縮后冷凍干燥得白色或淡黃色的粉末狀酪蛋白降血壓肽粗品。取酪蛋白降血壓肽粗產(chǎn)品配制20mg/ml的多肽溶液，每IOOmL溶液加30g DA201-C大孔吸附樹脂，30°C條件下靜態(tài)吸附4h，依次用25 %、50 %、75 %、100 %乙醇洗脫 2h，收集并濃縮75%的洗脫組分。75%的乙醇洗脫組分利用S印hadex G-IO凝膠層析進(jìn)一步分離，超純水lmL/min的流速洗脫，收集第二個洗脫峰，真空濃縮后冷凍干燥得酪蛋白降血壓肽產(chǎn)品。實施例2與實施例1類似，其區(qū)別在于每3g酪蛋白加水lOOmL，pH = 2.0，每Ig酪蛋白加胃蛋白酶20000U，水解時間為3h。
權(quán)利要求
1.一種酪蛋白降血壓肽的制備方法，其特征在于其步驟為(1)酪蛋白懸濁液在85 95°C條件下保持IOmin變性，冷卻至室溫，調(diào)節(jié)PH后加入胃蛋白酶，反應(yīng)1 3h后滅酶，冷卻后離心取上清液；(2)取步驟(1)所得上清液調(diào)節(jié)pH，加入胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，反應(yīng)4 6h后滅酶，冷卻后離心取上清液；(3)取步驟(2)所得上清液，真空濃縮后冷凍干燥得到白色或淡黃色的酪蛋白降血壓肽粗品；(4)取步驟(3)所得酪蛋白降血壓肽粗品用DA201-C大孔吸附樹脂吸附，然后乙醇梯度洗脫，收集并濃縮75%的乙醇洗脫組分；(5)取步驟(4)所得到的75%的乙醇洗脫組分利用葡聚糖S印hadexG_10凝膠層析分離得到酪蛋白降血壓肽。
2.如權(quán)利要求1所述一種酪蛋白降血壓肽的制備方法，其特征是步驟(1)中酪蛋白懸濁液質(zhì)量濃度為 3%，加酶量為每Ig酪蛋白加胃蛋白酶25000U 35000U，pH = 1. 5 2. 0，水解溫度為35°C 40°C。
3.如權(quán)利要求1所述一種酪蛋白降血壓肽的制備方法，其特征是步驟(2)中加酶量為每Ig酪蛋白加胰蛋白酶10000U 20000U和胰凝乳蛋白酶10000U 20000U，pH = 7. 5 8. 0，水解溫度為45°C 50°C。
4.如權(quán)利要求1所述一種酪蛋白降血壓肽的制備方法，其特征是步驟(1)和(2)中滅酶條件為80 90°C保持lOmin，冷卻至室溫后4000r/min離心。
5.如權(quán)利要求1所述一種酪蛋白降血壓肽的制備方法，其特征是步驟(4)中取酪蛋白降血壓肽粗品溶于水中，加入DA201-C大孔吸附樹脂下靜態(tài)吸附3 5h，依次用體積分?jǐn)?shù)為25 %、50 %、75 %、100 %的乙醇洗脫1 3h，收集并濃縮75 %的乙醇洗脫組分，實現(xiàn)酪蛋白降血壓肽的初步分離。
6.如權(quán)利要求1所述一種酪蛋白降血壓肽的制備方法，其特征是步驟(4)中將75% 的乙醇洗脫組分通過Si^phadex G-IO凝膠層析進(jìn)一步分離，收集第二個洗脫峰，真空濃縮后冷凍干燥獲得粉末狀酪蛋白降血壓肽。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種酪蛋白降血壓肽的制備方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。該方法包括以下步驟將酪蛋白懸濁液加熱變性，冷卻后調(diào)節(jié)pH加入胃蛋白酶，反應(yīng)完成后滅酶，離心，調(diào)節(jié)上清液pH后再加入胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶繼續(xù)反應(yīng)，反應(yīng)完成后滅酶，離心，上清液經(jīng)真空濃縮和冷凍干燥后得到酪蛋白降血壓肽粗品，利用大孔吸附樹脂和葡聚糖凝膠層析分離得到具有ACE抑制活性的酪蛋白降血壓肽。該方法通過模擬胃腸道消化的方式，利用兩步酶解制備的小分子肽，具有高ACE抑制活性，無毒副作用，易于體內(nèi)吸收，可用于制備降血壓藥物和食品。
文檔編號C07K1/36GK102296100SQ20111026619
公開日2011年12月28日 申請日期2011年9月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月9日
發(fā)明者呂兵, 王劍峰, 王桂春, 陸劍平 申請人:江南大學(xué)