專利名稱：廣譜型流感疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及廣譜型流感疫苗及其制備方法。
背景技術(shù)：
流感是由流感病毒引發(fā)的呼吸道傳染性疾病，是到目前為止仍然對人類公共安全帶來巨大威脅的疾病之一，人類歷史上曾出現(xiàn)三次世界性大流感，導(dǎo)致5000萬至1億人死亡，超過兩次世界大戰(zhàn)死亡人數(shù)的總和。流感病毒的主要特點是病毒株變異快、疫情傳播速度快，危害性大。在自然界中， 人和其它動物均是流感病毒的宿主，而發(fā)生于不同宿主的病毒株重組現(xiàn)象使新的流感病毒株不斷地出現(xiàn)，給人類預(yù)防和控制流感疫情帶來嚴峻的挑戰(zhàn)。到目前為止，預(yù)防性流感疫苗是控制流感病毒引發(fā)疫情的最佳方式，針對流感病毒變異快、會發(fā)生抗原漂移或抗原突變等特點，世界衛(wèi)生組織在全球建立了流感疫情監(jiān)控網(wǎng)絡(luò)，應(yīng)用現(xiàn)代流行病學(xué)和生物技術(shù)手段，分析在下一個流感季節(jié)流行的病毒株，并以此為基礎(chǔ)，確定在全球的不同區(qū)域的疫苗生產(chǎn)用毒株，用于預(yù)防性疫苗的生產(chǎn)。流感病毒株具有高度變異性，在不同的時間或不同的地點流行的流感病毒株血清型也存在較大的差異，因此，世界衛(wèi)生組織根據(jù)流感病毒流行學(xué)調(diào)查和預(yù)測，不斷更新病毒疫苗株，以預(yù)防流感的流行和蔓延。但是流感流行病學(xué)調(diào)查和預(yù)測具有不確定性，而且相對于流感的快速爆發(fā)和流行，用流行的病毒株研制生產(chǎn)疫苗有滯后效應(yīng)等不利因素，因而不能有效地實現(xiàn)對流感的預(yù)防和控制。傳統(tǒng)流感疫苗生產(chǎn)技術(shù)路線采用雞胚培養(yǎng)法，而要在短時間內(nèi)提供大量雞胚、生產(chǎn)出滿足健康人群大規(guī)模免疫接種的流感疫苗客觀上存在很大的困難，這種矛盾在大流感爆發(fā)期間特別明顯。因此，傳統(tǒng)流感疫苗生產(chǎn)技術(shù)不利于在短時間內(nèi)生產(chǎn)出大量流感疫苗， 不能及時的在健康人群中建立有效的免疫屏障，控制流感的大規(guī)模流行和蔓延。因此，研制對不同血清型的流感病毒均有預(yù)防保護效果的疫苗——廣譜型流感疫苗成為全球疫苗研究領(lǐng)域的熱點。在甲型流感病毒粒子和病毒感染的膜上表達了三種類型的跨膜蛋白(Krystyna Mozdzanowska et al,Vaccine. 2003(21) :2616-2627)紅細胞凝集素和神經(jīng)氨酸酶是分別具有大約510個和420個氨基酸的糖蛋白，相比之下，第三個跨膜蛋白為基質(zhì)蛋白2 (M2)，它包含的胞外結(jié)構(gòu)域(M2e)在人類的流感病毒株中是高度保守的。利用M2對甲型流感病毒感染的廣泛的保護性免疫已有相關(guān)研究(Frace et al, (1999)Vaccine 17 =2237-44 ；Okuda et al, (2001)Vaccinel9 :3681-91) M2是97個氨基酸的非糖基化跨膜蛋白(Lamb et al, (1981)Proc. Natl. Acad. Sci.USA 78 :4170-4 ；Lamb et al，(1985)Cell 40:627-33)。它形成同型四聚體，在病毒顆粒的膜上以低密度表達，但在被感染的細胞的質(zhì)膜上以高密度表達。M2四聚體表現(xiàn)出pH誘導(dǎo)的質(zhì)子運輸活性，這似乎利于RNP復(fù)合物融合后從病毒膜上的釋放，防止紅細胞凝集素在成熟前受酸誘導(dǎo)的構(gòu)象變化(Steinhauer et al, (1991)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:11525-9 ；Pinto et al, (1992)Cell 69:517-28)。在 23 個氨基酸序列的]\Ce 中，N-端的 9個氨基酸是完全保守的，在它靠近膜的15個氨基酸的部分中僅顯示出相對低程度的結(jié)構(gòu)多樣性。在人類分離株HlNl，H2N2, H3N2和H5W亞型中，在7個位置出現(xiàn)了兩個可以相互替換的氨基酸，但這些分離株的大部分實際上具有同樣的序列。M2e特異性單克隆抗體14C2在體外不能防止病毒感染，但在摻入培養(yǎng)基或瓊脂覆蓋層中時能降低病毒的產(chǎn)量，減小噬菌斑的大小。表明抗體介導(dǎo)的病毒生長限制在體內(nèi)和體外是通過不同機制進行的。使用不同類型的疫苗結(jié)構(gòu)和接種形式已經(jīng)測試了主動誘導(dǎo)的M2特異性免疫的保護效力，原因是能夠?qū)е虏《旧L和死亡率的減少。Merck公司開發(fā)出預(yù)防流感的化學(xué)偶聯(lián)物，如US2004/0223976A1和CN1756562A利用流感病毒中高度保守的，具有預(yù)防保護效果的抗原片段Μ^^ΠΗΑΟ蛋白質(zhì)與載體蛋白OMP 偶聯(lián)，目前該藥物處于I期臨床階段。Acambis 公司開發(fā)出 M2e_HBc VLPsJn US 7361352B2 和 CN1913920A，同樣利用流感病毒W(wǎng)Mk片段，與乙肝核心抗原通過化學(xué)偶聯(lián)形成抗流感病毒的嵌合體分子顆粒，目前該藥物也處于I期臨床階段。HA在病毒成熟的過程中，裂解為HA1(冠狀部分)和A2(莖狀部分)。在生理狀態(tài)下，冠狀的A1暴露在病毒粒子表面，能被宿主的免疫系統(tǒng)識別并產(chǎn)生抗體，但其氨基酸變異程度很高，不同血清型病毒誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體沒有交叉保護效果，這也就是傳統(tǒng)流感病毒疫苗的缺點。A2部分被A1包裹，在正常的生理狀態(tài)下不被機體免疫系統(tǒng)所識別，其只在病毒粒子和細胞融合的過程中暴露，由包裹狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)樯煺範(fàn)顟B(tài)，對病毒核酸最終進入宿主細胞起到關(guān)鍵的作用。經(jīng)過基因序列比對分析，在A2部分中介導(dǎo)病毒和細胞融合的肽段(l-56aa)保守程度高，在甲型流感(Hmi)、季節(jié)性流感和禽流感中該序列同源性高達 90%。因此，HA2序列的保守肽段是研制廣譜型流感疫苗的熱點(Sui J，Hwang WC, Perez S， et al :Nat Struct Mol Biol. 2009Mar ； 16 (3) :265-73 ；Ekiert DC,Bhabha G,Elsliger MA et al :Science. 2009Apr 10 ；324(5924) :246-51)。目前全球流感形勢嚴峻，新的流感病毒株如禽流感病毒(H5N1)和甲型流感病毒 (HlNl)不斷出現(xiàn)，而且存在病毒重組產(chǎn)生新的、高致病性二代病毒的危險，已有的疫苗對新出現(xiàn)的病毒沒有預(yù)防保護效果。因此，急需采用全新技術(shù)路線，研制廣譜型的、對甲型 (HlNl)流感、禽流感(H5W)、該兩種病毒重組產(chǎn)生的二代病毒和季節(jié)性流感病毒都具有預(yù)防保護效果的流感疫苗，徹底控制、消除流感的危害。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種廣譜型流感疫苗及其制備方法。根據(jù)流感病毒最新研究結(jié)果，利用流感病毒中高度保守、具有預(yù)防保護效果的抗原片段Mk或撤218_72與載體蛋白P64K化學(xué)偶聯(lián)，開發(fā)出廣譜型的流感疫苗，能夠有效的應(yīng)對各型流感病毒，由該偶聯(lián)物制備的廣譜型疫苗易于大規(guī)模生產(chǎn)制備，且有效周期長，可以大量儲備?？朔藗鹘y(tǒng)流感疫苗研制、生產(chǎn)技術(shù)路線的不足，從而實現(xiàn)對各種流感病毒引發(fā)的疫情及時、有效地控制。本發(fā)明的技術(shù)方案如下本發(fā)明的目的是提供一種預(yù)防流感的偶聯(lián)物，所述的偶聯(lián)物是由流感病毒中高度保守、具有預(yù)防保護效果的抗原片段Mk及其衍生的多肽或撤218_72蛋白質(zhì)與載體蛋白共價連接而成。本發(fā)明一方面提供了一種M2e_載體蛋白偶聯(lián)物，該偶聯(lián)物是由甲型流感Hmi病毒M2蛋白質(zhì)的胞外結(jié)構(gòu)域(M2e)或其衍生的多肽與載體蛋白化學(xué)偶聯(lián)而成。其中，所述的Mk或其衍生的多肽序列如SEQ ID NO 2所示SLLTEvETpTRX1EffEX2RX3SDSSDC[SEQ ID NO:2]其中，X1為蘇氨酸、異亮氨酸或絲氨酸；X2為絲氨酸、天冬氨酸或半胱氨酸；X3為半胱氨酸、丙氨酸或絲氨酸。其中，所述的M2e或其衍生的多肽序列優(yōu)選為SEQ ID NO=I所示的氨基酸序列SLLTEVETPTRSEWECRCSDSSDC[SEQ ID NO :1]。其中，所述的載體蛋白選自腦膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白P64K，破傷風(fēng)類毒素，乙肝核心抗原，匙孔血藍蛋白，輪狀病毒衣殼蛋白，和?；蛉巳轭^瘤病毒VLP的Ll蛋白的任意一種，優(yōu)選為腦膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白P64K ；所述P64K的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO 5所示；編碼P64K的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO 6所示。 本發(fā)明一方面提供了一種HA218_72-載體蛋白偶聯(lián)物，該偶聯(lián)物是由禽流感H5W病毒的HA218_72多肽與載體蛋白化學(xué)偶聯(lián)而成。其中，所述的H/^18_72多肽具有SEQ ID NO 3所述的序列MVDGWYGYHHSNEQGSGYAADKESTQKAIDGVTNKVNSIIDKMNTQFEAVGREFC[SEQ ID NO:3]。其中，所述的載體蛋白選自腦膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白P64K，破傷風(fēng)類毒素，乙肝核心抗原，匙孔血藍蛋白，輪狀病毒衣殼蛋白，和牛或人乳頭瘤病毒VLP的Ll蛋白的任意一種；所述的載體蛋白優(yōu)選為腦膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白P64K ；所述P64K的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO 5所示；編碼P64K的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO 6所示。本發(fā)明所述的Mk及其衍生的多肽或HA218_72多肽與載體蛋白是通過硫醚鍵共價連接的。本發(fā)明所述的M2e是通過固相合成方法制備的。本發(fā)明所述的H/^18_72是將經(jīng)基因工程菌表達而來；所述HA218_72編碼基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO 4所示；所述基因工程菌優(yōu)選為大腸桿菌Ecoli. BL21。本發(fā)明一方面提供了 M2e_載體蛋白偶聯(lián)物的制備方法，先將載體蛋白用活化劑活化，再與適當(dāng)比例WMk或其衍生的多肽混合，反應(yīng)得到偶聯(lián)物；所述的Mk與載體蛋白的比例為(10-20) 1，優(yōu)選為(12-18) 1，更優(yōu)選為 15 1 ；所述偶聯(lián)反應(yīng)的pH值為6. 5-7. 5，優(yōu)選為6. 8-7. 2 ；
所述偶聯(lián)反應(yīng)的時間為18-36小吋，優(yōu)選為M小時；所述的活化齊[J為 SMCC (Succinimidyト4-(N-maleimidomethyl) cydohexane-l-carboxylate), MB S、m-maieimidobenzoyl-N-hyaroxysuccinimide ester), sulfo-MBC(m-maleimidoDenzoyl-N-hydroxysulfosuccinimide ester)的任思一 種，優(yōu)選為SMCC。本發(fā)明一方面提供了 HA218_72-載體蛋白偶聯(lián)物的制備方法，先將載體蛋白用活化 劑活化，再與適當(dāng)比例的H/^18-72混合，反應(yīng)得到偶聯(lián)物；所述的H/^18_72與載體蛋白的比例為(10-20) 1，優(yōu)選為(12-16) 1，更優(yōu)選為 15 1 ；所述偶聯(lián)反應(yīng)的pH值為為6. 5-7. 5，優(yōu)選為6. 8-7. 2 ；所述偶聯(lián)反應(yīng)的時間為18-36小吋，優(yōu)選為M小時；所述的活化劑為SMCC，MBS, suIfo-MBS的任意ー種，優(yōu)選為SMCC。本發(fā)明一方面提供了一種廣譜型流感疫苗，所述的疫苗含有任意ー種M2e或其衍 生的多肽與載體蛋白的偶聯(lián)物及相應(yīng)的佐劑。本發(fā)明一方面提供了一種廣譜型流感疫苗，所述的疫苗含有所HA218_72_載體蛋白 偶聯(lián)物及相應(yīng)的佐劑。本發(fā)明一方面提供了一種廣譜型流感疫苗，所述的疫苗含有Mh或其衍生的多肽 與載體蛋白偶聯(lián)物的任意ー種和HA218_72-載體蛋白偶聯(lián)物及相應(yīng)的佐劑。本發(fā)明的廣譜型流感疫苗的毒副作用小，安全性高，耐受性好，能夠有效預(yù)防甲型 H1N1，禽流感H5W流感病毒和其他病毒亞型的感染。用本發(fā)明的疫苗免疫小鼠，能夠誘導(dǎo) 小鼠產(chǎn)生高水平的抗體，井能保護免疫小鼠對病毒的致死劑量攻擊。


圖1為腦膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白P64K PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳2為腦膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白P64K的反相色譜圖譜圖3為腦膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白P64K的肽譜(胰蛋白酶)圖4為腦膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白P64K的電泳圖譜圖5為腦膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白P64K的質(zhì)譜分析圖譜圖6為Mh的反相高效液相色譜圖譜圖7為Mh的質(zhì)譜分析圖譜圖8為M2e_P64K偶聯(lián)物的SDS凝膠電泳9為M2e_P64K偶聯(lián)物的凝膠色譜10為HA2(18_72)PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果圖11為HA2(18d的載體構(gòu)建圖12為H/^18_72的Mono Q純化過程圖譜圖13為H/^18_72的SOURCE純化過程圖譜圖 14 為 H/^18_72 的 SDS-PAGE 圖譜圖15為H/^18_72的反相高效液相色譜 16 為 H/^18_72-P64K 的 SDS-PAGE 圖譜
圖17為HA218_72-P64K的凝膠色譜18為M&-P64K偶聯(lián)物的免疫原性分析抗體效價19為M&-P64K偶聯(lián)物的免疫原性分析抗體亞型鑒定20為M&-P64K偶聯(lián)物的免疫原性分析血清交叉反應(yīng)圖21為H/^18_72-P64K偶聯(lián)物的免疫原性分析抗體效價圖
實施例本發(fā)明的實施方案通過下列實施例舉例說明。然而，應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的實施方案不限于這些實施例的特定細節(jié)，因為對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，其其他的變化是已知的，或根據(jù)直接公開的內(nèi)容和附屬的權(quán)利要求是顯而易見的。因此，凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。本文引用的參考文獻以其全文通過引用并入本文。下述實施例中所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所述試劑和生物材料，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。實施例1、腦膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白(P64K)的制備1、腦膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白(P64K)編碼基因的克隆根據(jù)GenBank Accession No. X77920. 1的腦膜炎奈瑟氏菌的序列，采用Primer5. 0 軟件設(shè)計引物，上游引物5-CATGCCATGGCTTTAGTTGAATTGAA-3，下游引物5-CCGGAATTCTTA TTTTTTCTTTTGCGGAG-3，其中下劃線部分分別為NcoI和EcoRI的酶切位點。將腦膜炎奈瑟氏菌CMCC四336(購自中國醫(yī)學(xué)細菌保藏中心，簡稱CMCC)于100°C條件下煮沸l(wèi)Omin，吸取 3 μ 1作為模板，進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系為3 μ 1模板，10XPCR緩沖液5 μ 1，IOmmol/ L dNTPl μ 1，Pyrobest高保真DNA聚合酶(上海生工產(chǎn)品)1 μ 1，終濃度為0. 5 μ mol/L的上下游引物各0. 5 μ 1，加超純水至50 μ 1。PCR反應(yīng)條件為先94°C預(yù)變性5min ；然后94°C 變性45s，50°C退火45s，72°C延伸^iiin ；共30個循環(huán)，最后72°C延伸IOmin。將PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖1所示。其中，泳道1為DL2000DNA分子量標準， 泳道2為P64K編碼基因的PCR擴增產(chǎn)物。結(jié)果表明，擴增得到ISOObp左右的P64K的編碼基因。對上述獲得的P64K的編碼基因進行測序，測序結(jié)果表明，其核苷酸序列如序列表中 SEQ ID NO :6所示，其編碼的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO :5所示。2、載體和工程菌的構(gòu)建回收上述目的片段，將回收的PCR產(chǎn)物和pET28a載體分別用NcoI和EcoRI進行雙酶切，產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，切膠回收酶切片段，將酶切產(chǎn)物與載體pET28a 的酶切產(chǎn)物以1 3的摩爾比進行混合，經(jīng)T4DNA連接酶室溫過夜連接，連接產(chǎn)物用CaCl2 法轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細胞，12小時后，挑取單克隆，用菌落PCR法篩選陽性克隆，得到表達 P64K的大腸桿菌工程菌。3、工程菌株大規(guī)模培養(yǎng)、腦膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白(P64K)的純化和檢測將上述步驟2獲得的表達P64K的大腸桿菌工程菌經(jīng)三級培養(yǎng)放大，最后轉(zhuǎn)至500L 的肉湯培養(yǎng)基中，發(fā)酵罐參數(shù)設(shè)置為攪拌速度350-400rpm，溫度35-37°C，溶氧控制在 30-40 %，培養(yǎng)36-48小時后，終止培養(yǎng)。將培養(yǎng)液經(jīng)連續(xù)高速離心進行固液分離以收集菌體，將收集到的菌體經(jīng)高壓勻漿后，離心去除菌體碎片，在上清液中加入固體硫酸銨，依次進行疏水層析、陰離子交換層析(Q-sepharose FF GE)和凝膠過濾(s印hadex s200GE)，得到 P64K 的原液。按照《中國人民共和國藥典》2005年版第三部要求和質(zhì)量標準對上述獲得的P64K 原液進行純度、殘留雜質(zhì)和結(jié)構(gòu)鑒別，具體的檢測結(jié)果如圖1-5所示。其中，圖2為腦膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白(P64K)的反相高效液相色譜圖，檢測波長為觀此！!!，結(jié)果如圖中所示只有一個峰，其色譜保留時間為7. 71分鐘，色譜純度為100% ；圖3為腦膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白(P64K)肽譜(胰蛋白酶)，結(jié)果顯示，上述獲得的腦膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白(P64K)與 P64K標準品(古巴分子免疫中心提供)的譜圖完全一致；圖4為腦膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白(P64K)的電泳圖譜，P64K表示上述獲得的由大腸桿菌工程菌表達的腦膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白(P64K)，LMWP表示低分子量蛋白標準品(GE公司提供)，在電泳譜圖上，上述獲得的 P64K只有一條帶，純度為100%;圖5為腦膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白P64K的質(zhì)譜分析圖，分子量為61923. 7Da，與氨基酸序列推算的理論分子量一致。實施例2、M2e肽的制備l、iCe肽的固相合成以]\Ce肽序列 SLLTEVETPTRSETOCRCSDSSDC[SEQ ID NO :1]C末端的氨基酸Cys 為起始反應(yīng)物，將其上的NH2用Fmoc保護，與載體iTrityl chloride resin (也可為Rink Amide resin或Wang resin)反應(yīng)，摩爾比為1 1. 5，以DCM或DMF為反應(yīng)溶劑，堿性條件下混合， 反應(yīng)2小時左右；用堿性溶劑哌啶脫去連接在載體上第一個氨基酸氨基上的保護基Fmoc， 用DMF沖洗，去除過量的氨基酸，F(xiàn)moc等小分子物質(zhì)；再加入活化劑DIC/H0BT混合物，以活化Cys N端的自由氨基，15分鐘活化完畢后，加入第二個氨基酸(見SEQ ID N0:1)，依次循環(huán)，完成Mk肽上所有氨基酸的連接。合成完畢后，利用三氟乙酸切除載體Trityl chloride resin,以及M2e肽側(cè)鏈上的保護基團，以得到完整的無保護基的M2e肽鏈。2、M2e肽的純化和結(jié)構(gòu)確證合成完畢后，利用制備高效液相色譜法純化Mk肽，固定相為0. 1 %的CF3COOH/ H2O,流動相為0. 1 %的CF3C00H/CH3CN，具體的檢測結(jié)果如圖6-7所示。圖6為Mk肽的反相高效液相色譜圖，檢測波長為280nm，結(jié)果顯示，色譜保留時間為22. 53& η，色譜純度為 96. 52%。圖7 SiCe肽的質(zhì)譜分析圖，質(zhì)譜分子量為沈70. 7Da，與氨基酸序列推算的理論
分子量一致。實施例3、M2e肽-P64K偶聯(lián)物的制備1、P64K 的活化以 SMCC(Succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cydohexane-1-carboxylate)為活化劑，將摩爾比為1 20的P64K SMCC在pH 7. 2的磷酸鹽緩沖液里混合，室溫攪拌2 小時，加入適量甘氨酸終止反應(yīng)，然后用超濾杯(MW:30KDa)超濾活化的P64K，以除去未反應(yīng)的SMCC和過量的甘氨酸。2、偶聯(lián)物的制備與純化活化的P64K在已知濃度的情況下與M2e以摩爾比1 15的比例在pH6. 5，4°C的條件下反應(yīng)Mh，用巰基乙醇終止反應(yīng)。用超濾杯(MW:30KDa)純化制得的偶聯(lián)物，除去未參加反應(yīng)的Mk和巰基乙醇等。實施例4、Μ2Θ-Ρ64Κ偶聯(lián)物的結(jié)構(gòu)分析 SDS-PAGE檢測載體蛋白P64K與Mk的偶聯(lián)度，如圖8所示，泳道4為標準Marker，泳道3為M2e-P64K偶聯(lián)物。利用凝膠色譜SuperdeX200，根據(jù)被檢測分子的大小差異分離不同組分，分離條件流速:0. 5ml/min ；時間:55min ；檢測波長:280nm ；溫度室溫；流動相磷酸鹽緩沖液 pH6. 5。得到M2e-P64K的凝膠色譜圖如圖9所示，紅色曲線為P64K，藍色曲線為P64K-M& 偶聯(lián)物。根據(jù)如下表的方法計算分子量P64K與M2e的偶聯(lián)比例
分子量(KDa)P64k(KDa)M2(KDa)M2偶聯(lián)數(shù)量P64k69. 25P64k-M2 (條帶 1)93. 37569. 2524. 1259. 0P64k-M2 (條帶 2)189. 03138. 550. 539. 4 由上表可以得出，P64K與M2e的偶聯(lián)比例為1 9，即1個P64K分子可以偶聯(lián)9 個]\Ce分子。實施例5、HA218_72多肽的制備1、HA218_72表達載體的構(gòu)建根據(jù)大腸桿菌的密碼子偏性，人工合成編碼成熟的H/^18_72多肽的全長DNA序列， 其核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0:4所示。以上述合成的重組序列為模板，采用I^rimer 5. 0軟件設(shè)計引物，上游引物5’GCC GGATCCGATGACGATGACAAAATGGTGGACGGCTGGTACGGC3，下游引物5，GCACGATCCGCTCGAGGCAGTTG TTAAACTCGCGGCCCACGGCC3’，下劃線分別為BamHI和BioI酶切位點。采用PCR的方法，擴增 H/^18_72 基因。PCR 反應(yīng)體系為5 μ LlO XPCR 緩沖液，4 μ L 2. 5mmol/L dNTP，Pyrobest 高保真DNA聚合酶0. 5 μ L，兩條引物終濃度為0. 5 μ mol/L,模板0. 5 μ L，超純水H2O補充反應(yīng)體系至50 μ L0 PCR反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性5min后進入PCR循環(huán)。PCR反應(yīng)參數(shù)為94°C變性45s，55 °C退火45s，72 °C延伸45s ；30個循環(huán)后，72°C延伸IOmin。將PCR擴增產(chǎn)物進行 1. 5%瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收目的片段。將PCR回收產(chǎn)物與pET28a載體分別進行BamHlAhoI雙酶切，經(jīng)1. 5 %瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖10所示。其中，泳道1為上述步驟1的PCR產(chǎn)物經(jīng)BamHIAhoI雙酶切的酶切產(chǎn)物，切膠回收酶切片段。PCR酶切產(chǎn)物與pET28a酶切產(chǎn)物按1 3比例經(jīng)T4DNA連接酶連接過夜，CaCl2法轉(zhuǎn)化ToplO感受態(tài)。37°C培養(yǎng)12小時后，挑選單克隆，用菌落PCR法篩選陽性克隆。2、H/^18_72 小量表達將測序結(jié)果正確的表達載體？討28￡1-撤218_72用CaCl2法轉(zhuǎn)化Ecoli. BL21感受態(tài)細胞。如圖11所示。挑選單菌落接種于5ml LB培養(yǎng)基中(卡那霉素60 μ g/ml)，37°C培養(yǎng)過夜。將過夜菌按1 100接種至IOml LB培養(yǎng)基中(卡那霉素60yg/ml)，37°C搖菌至0D_ =0. 4-1. 0，留取Iml培養(yǎng)物后，加入IPTG至終濃度lmmol/L，37°C誘導(dǎo)過夜。取Iml樣品， 離心，收集菌體，超聲破碎，然后4°C，12000rpm，離心lOmin。10% SDS-PAGE檢測上清和沉淀中HA218_72的表達狀況。
3、HA218_72的純化和檢測挑取高表達菌株單菌落至5mL LLB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜作為種子。將種子按1 100 接種到2 X YT培養(yǎng)基中培養(yǎng)池，加入IPTG至終濃度為lmmol/L誘導(dǎo)表達Mi后離心收集菌體。每克濕重的菌體加入5mL緩沖液A (20m mmol/L Tris，pH 6. 5)重懸，超聲破碎20min后離心取上清液經(jīng)0. 22 μ m過濾后進行Mono Q離子交換層析。使用緩沖液B(20mmol/L Tris, 500mmol/L NaCl,pH 6. 5)進行階段洗脫，先用20%的緩沖液B洗雜蛋白，再用30%的緩沖液B洗脫目的蛋白，收集洗脫峰，見圖12。通過kphadex G25將上一步純化產(chǎn)物更換緩沖液至緩沖液C(5%乙腈，0.05%三氟乙酸)中進行SOURCE反相層析，使用緩沖液D(80%乙腈，0. 05%三氟乙酸)進行階段洗脫，首先用25%的緩沖液D洗雜蛋白，接著用35%的緩沖液D洗脫目的蛋白，收集洗脫峰，見圖13。將收集到的目的蛋白冷凍干燥后置-20°C保存。 純化產(chǎn)物的SDS-PAGE結(jié)果如圖14所示。使用HPLC檢測目的蛋白的純度，色譜柱為ZORBAX 300SB-C8，溶液A為含0. 1 %三氟乙酸的超純水，溶液B為含0. 三氟乙酸和90%乙腈的超純水，洗脫的梯度過程為0至 100%的溶液B用時30min。檢測結(jié)果顯示目的蛋白的純度在95. 7% (圖15)。實施例6、HA218_72-P64K偶聯(lián)物的制備1、P64K 的活化以 SMCC(Succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cydohexane-1-carboxylate)為活化劑，將摩爾比為1 20的P64K SMCC在pH 7. 2的磷酸鹽緩沖液里混合，室溫攪拌2 小時，加入適量甘氨酸終止反應(yīng)，然后用超濾杯(MW:30KDa)超濾活化的P64K，以除去未反應(yīng)的SMCC和過量的甘氨酸。2、偶聯(lián)物的制備與純化活化的P64K在已知濃度的情況下與M2e以摩爾比1 15的比例在pH 6. 5，4°C的條件下反應(yīng)過夜，用巰基乙醇終止反應(yīng)。用超濾杯(MW:30KDa)純化制得的偶聯(lián)物，除去未參加反應(yīng)的Mk和巰基乙醇等。實施例7、HA218_72-P64K偶聯(lián)物的結(jié)構(gòu)表征SDS-PAGE檢測載體蛋白P64K與HA218_72的偶聯(lián)程度，如圖16所示，泳道1為分子量標準Marker，泳道4為HA218_72_P64K偶聯(lián)物。利用凝膠色譜SUperdeX200，根據(jù)被檢測分子的大小差異分離不同組分。分離條件為流速:0. 5ml/min ；時間:55min ；檢測波長:280nm ；溫度室溫；流動相磷酸鹽緩沖液 PH6. 5。檢測結(jié)果如圖17所示，藍色曲線為P64K ；紅色曲線為Η/^18_72_Ρ64Κ偶聯(lián)物。根據(jù)如下表的方法計算分子量Ρ64Κ與Η/^18_72的偶聯(lián)比例
權(quán)利要求
1.一種HA218_72-載體蛋白偶聯(lián)物，是由禽流感H5m病毒HA218_72多肽與載體蛋白化學(xué)偶聯(lián)而成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的偶聯(lián)物，其特征在于，所述的撤218_72多肽具有SEQID NO 3 所述的序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的偶聯(lián)物，其特征在于，所述的載體蛋白選自腦膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白P64K，破傷風(fēng)類毒素，乙肝核心抗原，匙孔血藍蛋白，輪狀病毒衣殼蛋白，和牛或人乳頭瘤病毒VLP的Ll蛋白的任意一種；優(yōu)選為腦膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白P64K，所述P64K的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO 5所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的偶聯(lián)物，其特征在于，所述的HA218_72多肽與載體蛋白通過硫醚鍵共價連接。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的偶聯(lián)物，其特征在于，所述的HA218_72多肽是經(jīng)基因工程菌表達而來；所述HA218_72多肽編碼基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO 4所示；所述基因工程菌優(yōu)選為大腸桿菌Ecoli. BL21。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項所述的偶聯(lián)物的制備方法，是先將載體蛋白用活化劑活化，再與適當(dāng)比例的H/^18-72多肽混合，反應(yīng)得到偶聯(lián)物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述的HA218_72多肽與載體蛋白的比例為 (10-20) 1，優(yōu)選為(12-16) 1，更優(yōu)選為 15 1 ；所述偶聯(lián)反應(yīng)的PH值為為6. 5-7. 5，優(yōu)選為6. 8-7. 2 ；所述偶聯(lián)反應(yīng)的時間為18-36小時，優(yōu)選為M小時；所述的活化劑為SMCC，MBS, suIfo-MBS的任意一種，優(yōu)選為SMCC。
8.一種廣譜型流感疫苗，其特征在于，所述的疫苗含有權(quán)利要求1中所述的偶聯(lián)物和相應(yīng)的佐劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了廣譜型流感疫苗及其制備方法。該疫苗包含由流感病毒中高度保守、具有預(yù)防保護效果的抗原片段M2e或HA218-72與載體蛋白化學(xué)偶聯(lián)而成的偶聯(lián)物。由該偶聯(lián)物制備的廣譜型疫苗易于大規(guī)模生產(chǎn)制備，且有效周期長，可以大量儲備。克服了傳統(tǒng)流感疫苗研制、生產(chǎn)技術(shù)路線的不足，從而實現(xiàn)對各種流感病毒引發(fā)的疫情及時、有效地控制。
文檔編號C07K14/11GK102397559SQ20111036266
公開日2012年4月4日 申請日期2010年6月11日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月11日
發(fā)明者劉方杰, 孫宇石, 張琪, 李先鐘, 楊思儀, 王鑫, 白先宏, 程虹, 胡品良, 闞偉 申請人:北京精益泰翔技術(shù)發(fā)展有限公司