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一種大菱鲆增食欲素Orexin基因、重組蛋白及其制備方法與流程

文檔序號:11095820閱讀:來源:國知局

技術特征:

1.一種大菱鲆增食欲素Orexin,其特征在于:所述大菱鲆增食欲素Orexin的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.編碼權利要求1所述的大菱鲆增食欲素Orexin的Orexin基因,其特征在于:所述Orexin基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.根據(jù)權利要求2所述的Orexin基因,其特征在于:克隆所述Orexin基因所需的引物F1和R1序列如下:

F1: 5′- TGGGCAAGCGGGAGGAGGATGAGYAT -3′;

R1: 5′- ATRCTCATCCTCCTCCCGCTTGCCCA -3′。

4.含有權利要求2所述的Orexin基因的重組表達載體。

5.根據(jù)權利要求4所述的重組表達載體,其特征在于,所述重組表達載體為pET-24a-SL,其制備過程為:使用正向引物F和反向引物R,通過PCR擴增獲得所述Orexin基因,并在Orexin基因的兩端分別添加XhoI和EcoRI酶切位點,將該核苷酸序列經(jīng)過限制性內(nèi)切酶XhoI和EcoRI酶切后,插入pET-24a(+)表達載體XhoI和Eco4RI酶切位點之間,獲得重組表達載體pET-24a-orexin。

6.根據(jù)權利要求5所述的重組表達載體,其特征在于:所述正向引物F和反向引物R序列如下:

F:5′- CCGGAATTCATGACTCCCCTTCACAAAAAG-3′;

R:5′- CCGCTCGAGCACAGGAAGGGGTGTTGTGATG -3′;

PCR擴增的反應條件為:95℃5min;95℃35s,55℃退火35s,72℃延伸1min,35個循環(huán)。

7.權利要求1所述的大菱鲆增食欲素Orexin重組蛋白的制備方法,其特征在于:所述制備方法包括如下步驟:

(1)將重組表達載體pET-24a-orexin轉化大腸桿菌,將挑取的陽性克隆菌株接種于含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)瓶中,37℃振蕩培養(yǎng)過夜,次日轉接到含有LB 培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中,37℃培養(yǎng)到OD600=0.5~1.0時,加入IPTG誘導重組蛋白表達,離心收集細菌培養(yǎng)物;

(2)將誘導表達后的細菌培養(yǎng)物重懸于裂解液中,超聲破碎,將超聲破碎的細胞裂解液離心,收集沉淀即為包涵體,使用包涵體洗滌液洗滌包涵體;用溶解緩沖液溶解包涵體,4℃放置過夜;室溫下離心;將上述溶液滴加到緩沖液,將稀釋后的包涵體溶液裝入透析袋中,4℃透析過夜;

(3)利用低壓層析系統(tǒng),將透析后的包涵體溶液上樣至Ni柱;收集洗脫后的蛋白流出液;裝入透析袋中,放入緩沖液中,透析過夜;獲得純化后的增食欲素Orexin重組蛋白。

8.根據(jù)權利要求7所述的大菱鲆增食欲素Orexin重組蛋白的制備方法,其特征在于:所述步驟(1)中IPTG的濃度為0.5 ~ 0.7mmol/L,誘導表達的時間為3 ~5h。

9.根據(jù)權利要求7所述的大大菱鲆增食欲素Orexin重組蛋白的制備方法,其特征在于:所述步驟(3)中透析后的包涵體溶液以0.5 ml/min流速上樣至Ni-IDA -Sepharose CL-6B親和層析柱。

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