本發(fā)明涉及DNA檢測
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及一種從多種混合DNA中超靈敏檢測痕量DNA的方法和試劑。
背景技術(shù)：
：在科研、臨床或健康體檢等領(lǐng)域中進行基因檢測時經(jīng)常需要進行非傷害性取樣，即通過獲取人的毛發(fā)、指甲、糞便(含有腸道脫落細胞)、尿液、唾液、食物殘渣(含有口腔脫落細胞)、嘔吐物(含有消化道脫落細胞)、霉變生菌的組織或體液等復(fù)雜樣本中對某一物種(通常是人)的特定DNA區(qū)域進行檢測；在法醫(yī)、刑偵等領(lǐng)域也時有發(fā)生樣本保存不善或特定環(huán)境下取樣的情況。這些樣本成分往往及其復(fù)雜。從這些樣本中提取的DNA往往含有大量的非目標(biāo)物種DNA。例如，從糞便樣本中提取的DNA是很多種DNA的混合物。其中大約60％的DNA來源于腸道細菌，剩余的絕大部分DNA來源于動物或植物食物殘渣，可用于檢測的結(jié)腸黏膜脫落細胞的DNA占總DNA的千分之一甚至更少。目前實驗室常用的DNA檢測方案如QPCR、時間飛行質(zhì)譜、一代測序、高通量測序等都基于PCR(聚合酶鏈式反應(yīng))技術(shù)。而在大量的非目標(biāo)物種DNA干擾存在的情況下，基于引物結(jié)合模板并延伸的PCR技術(shù)特異性會很差。從而導(dǎo)致以上常用的DNA檢測方案會受到不同程度的影響。尤其在使用高通量測序技術(shù)對摻有大量混合物種DNA的痕量目標(biāo)DNA進行目標(biāo)區(qū)域測序時，需要投入大量的DNA樣本，以保證痕量目標(biāo)DNA有足夠的拷貝數(shù)以對其準確檢測。這時無用的其它物種DNA也越多，干擾作用也就越強。因此如何有效去除大量的非目標(biāo)物種DNA的干擾并進行靈敏準確的特定DNA目標(biāo)區(qū)域富集檢測成為科研技術(shù)人員要解決的技術(shù)難題。目前現(xiàn)有的技術(shù)解決方案為在DNA抽提的過程中針對細菌等原核細胞和真核細胞的特性不同進行一定程度的區(qū)分。細菌等原核細胞較真核細胞不容易裂解，所以在抽提DNA時不進行加熱裂解，而采用比較溫和的裂解方案就可以減少總DNA中細菌DNA的含量。但實際自然環(huán)境下細菌自身就會裂解死亡并釋放DNA，并且這種技術(shù)方案針對其它真核細胞DNA沒有篩選去除作用，所以該方案效果往往不是很好。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明提供一種從多種混合DNA中超靈敏檢測痕量DNA的方法和試劑，解決了現(xiàn)有檢測技術(shù)針對含有大量外源DNA污染的復(fù)雜樣本檢測靈敏度低的技術(shù)問題。根據(jù)本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提供一種從多種混合DNA中超靈敏檢測痕量DNA的方法，包括：(a)使用探針對含有待檢測位點或待檢測區(qū)域的目標(biāo)DNA的接頭連接產(chǎn)物進行探針預(yù)富集，其中上述探針是雙鏈寡核苷酸，上述接頭連接產(chǎn)物的兩端的接頭均包括通用引物的結(jié)合位點；(b)使用針對上述待檢測位點或待檢測區(qū)域的上游特異性引物和下游特異性引物，以及兩端的通用引物對探針預(yù)富集產(chǎn)物進行特異性富集，再對特異性富集產(chǎn)物進行通用引物擴增。進一步地，上述探針是通過PCR擴增得到的一對或多對覆蓋待檢測位點或待檢測區(qū)域的雙鏈寡核苷酸。進一步地，上述探針帶有親和標(biāo)記；優(yōu)選地，上述親和標(biāo)記是位于上述探針兩條鏈的5’端的生物素標(biāo)記。進一步地，上述步驟(b)使用多條上述上游特異性引物組成的引物組和多條上述下游特異性引物組成的引物組。進一步地，上述探針長度為150-200bp。進一步地，每一個上述上游特異性引物和下游特異性引物距離上述待檢測位點或待檢測區(qū)域的距離為1-20個堿基，優(yōu)選1-5個堿基。進一步地，上述待檢測位點或待檢測區(qū)域包括點突變、插入、缺失和基因融合中的至少一種。進一步地，上述方法還包括：(c)對上述步驟(b)的擴增產(chǎn)物進行測序，以檢測上述待檢測位點或待檢測區(qū)域。根據(jù)本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提供一種從多種混合DNA中超靈敏檢測痕量DNA的試劑，包括：(a)探針，上述探針是雙鏈寡核苷酸，用于對含有待檢測位點或待檢測區(qū)域的目標(biāo)DNA的接頭連接產(chǎn)物進行探針預(yù)富集，其中，上述接頭連接產(chǎn)物的兩端的接頭均包括通用引物的結(jié)合位點；(b)上游特異性引物和下游特異性引物，以及通用引物，用于對探針預(yù)富集產(chǎn)物進行特異性富集，以及對特異性富集產(chǎn)物進行通用引物擴增。進一步地，上述探針是通過PCR擴增得到的一對或多對覆蓋待檢測位點或待檢測區(qū)域的雙鏈寡核苷酸。本發(fā)明的方法使用目標(biāo)區(qū)域探針對DNA進行預(yù)富集，去除了絕大部分外源DNA和非目標(biāo)區(qū)域DNA。該方法允許盡可能多地加入總DNA，進而增加目標(biāo)痕量DNA的拷貝數(shù)。本發(fā)明使用雙鏈探針對待檢測目標(biāo)區(qū)域的兩條鏈都進行捕獲，增加了痕量DNA的利用率。本發(fā)明還使用上游特異性引物和下游特異性引物，以及兩端的通用引物對探針預(yù)富集產(chǎn)物進行特異性富集，再對特異性富集產(chǎn)物進行通用引物擴增，進一步降低了外源DNA和非目標(biāo)區(qū)域DNA的含量，提高了痕量DNA的含量，解決了現(xiàn)有檢測技術(shù)針對含有大量外源DNA污染的復(fù)雜樣本檢測靈敏度低的技術(shù)問題。附圖說明圖1為本發(fā)明實施例中使用PCR的方法進行探針制作的原理示意圖；圖2為本發(fā)明實施例中使用雙鏈DNA探針進行雜交預(yù)富集的原理示意圖；圖3為本發(fā)明實施例中對探針預(yù)富集產(chǎn)物進行特異性PCR富集及終文庫構(gòu)建的過程。圖4為本發(fā)明實施例中構(gòu)建的文庫的電泳檢測結(jié)果圖，其中Library表示文庫電泳結(jié)果，M表示Takara100bpMarker。具體實施方式下面通過具體實施方式結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步詳細說明。目前傳統(tǒng)的商業(yè)化探針制作為基因合成方法，該方法對探針長度有限制(一般100nt以上的探針合成準確度較差)，而且價格昂貴。而本發(fā)明使用PCR方法進行探針制作，不僅使探針成本極大降低，而且能夠制作更長的特異性更好的探針。使用雙鏈DNA探針進行雜交預(yù)富集，相較于傳統(tǒng)的單鏈探針而言，可以同時富集目標(biāo)區(qū)域的兩條鏈，使富集效率和靈敏度更高。使用PCR的方法進行探針制作的原理，如圖1所示，探針長度一般為150-200bp。探針兩條鏈的5’端有生物素標(biāo)記，以便使用親和素進行捕獲。探針是雙鏈寡核苷酸，覆蓋待檢測位點或待檢測區(qū)域。在具體應(yīng)用中，針對待檢測位點或待檢測區(qū)域的個數(shù)，可以使用一對或多對這樣的雙鏈寡核苷酸探針。使用雙鏈DNA探針進行雜交預(yù)富集的原理，如圖2所示，樣本中含有大量外源物種DNA和其它非目標(biāo)區(qū)域DNA，以及痕量的目標(biāo)區(qū)域DNA(即含有待檢測位點或待檢測區(qū)域的DNA)。使用探針包含目標(biāo)區(qū)域DNA的接頭連接產(chǎn)物進行探針預(yù)富集，即可提高目標(biāo)區(qū)域DNA在樣本中的相對含量。由于探針仍可能有非特異性結(jié)合，故會產(chǎn)生非特異性預(yù)富集產(chǎn)物。這就需要下一步使用特異性引物進行特異性擴增。對探針預(yù)富集產(chǎn)物進行特異性PCR富集及終文庫構(gòu)建，如圖3所示，使用針對待檢測位點或待檢測區(qū)域的上游特異性引物和下游特異性引物，以及兩端的通用引物對探針預(yù)富集產(chǎn)物進行特異性富集，再對特異性富集產(chǎn)物進行通用引物擴增，即得到終文庫。對終文庫進行測序，即可檢測待檢測位點或待檢測區(qū)域的突變情況，本發(fā)明中，待檢測位點或待檢測區(qū)域突變情況包括點突變、插入、缺失和基因融合中的至少一種。探針預(yù)富集的非特異性產(chǎn)物由于只有通用引物與之結(jié)合，而并無特異性引物與之結(jié)合，所以無法進行PCR富集。如圖3所示，上游特異性引物和下游特異性引物可以分別是多條引物組成的引物組，即上游特異性引物組和下游特異性引物組，也就是多個待檢測位點或待檢測區(qū)域特異性引物的混合物。引物組中的每條引物可以分別針對特定的一種待檢測位點或待檢測區(qū)域。特異性引物組分為上游組和下游組，分別對待檢測DNA的兩條鏈進行擴增。在本發(fā)明優(yōu)選實施例中，每一個上游特異性引物和下游特異性引物距離待檢測位點或待檢測區(qū)域的距離一般為1-20個堿基，優(yōu)選1-5個堿基。對應(yīng)于本發(fā)明實施例的方法，本發(fā)明實施例還提供一種從多種混合DNA中超靈敏檢測痕量DNA的試劑，包括：(a)探針，上述探針是雙鏈寡核苷酸，用于對含有待檢測位點或待檢測區(qū)域的目標(biāo)DNA的接頭連接產(chǎn)物進行探針預(yù)富集，其中，上述接頭連接產(chǎn)物的兩端的接頭均包括通用引物的結(jié)合位點；(b)上游特異性引物和下游特異性引物，以及通用引物，用于對探針預(yù)富集產(chǎn)物進行特異性富集，以及對特異性富集產(chǎn)物進行通用引物擴增。以下通過實施例詳細說明本發(fā)明的技術(shù)方案，應(yīng)當(dāng)理解，實施例僅是示例性的，不能理解為對本發(fā)明保護范圍的限制。實施例中使用的試劑，在沒有特別說明的情況下，均為市售的常規(guī)試劑。實施例本實施例對樣本進行文庫構(gòu)建并對NRAS、KRAS、PI3KA、EGFR4個基因的7個位點進行檢測，具體如下：1.含有隨機單分子標(biāo)簽的接頭設(shè)計IDX1-S：CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNNNggaattaGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT(SEQIDNO：1)；IDX2-S：CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNNNatccggcGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT(SEQIDNO：2)；IDX3-S：CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNNNcaggccgGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT(SEQIDNO：3)；ADT-AS：pGATCGGAAGAGC(SEQIDNO：4)；ADT-AS序列5’端磷酸基團修飾。IDX1-S、IDX2-S、IDX3-S(均為接頭的第一鏈)分別與ADT-AS序列退火成雙鏈，構(gòu)成三個接頭ADT1、ADT2、ADT3。2.本實施例針對NRAS、KRAS、PIK3CA、EGFR這4個基因的常見7個突變點進行檢測。針對NRAS的Q61K設(shè)計用于制作探針的引物：NRAS-Q61K-F:CCTTACCCTCCACACCCCCA(SEQIDNO：5)；NRAS-Q61K-R:GTTAATATCCGCAAAT(SEQIDNO：6)。針對KRAS的G12D設(shè)計用于制作探針的引物：KRAS-G12D-F:GTGACATGTTCTAATATAGTC(SEQIDNO：7)；KRAS-G12D-R:TAATATGCATATTAAAACAAG(SEQIDNO：8)。針對PIK3CA的E545K設(shè)計用于制作探針的引物：PIK3CA-E545K-F:TATTTTACAGAGTAACAGAC(SEQIDNO：9)；PIK3CA-E545K-R:AGATCAGCCAAATTCAGTTA(SEQIDNO：10)。針對EGFR的E746-A750設(shè)計用于制作探針的引物：EGFR-E746-A750-F:ACAATTGCCAGTTAACGTCT(SEQIDNO：11)；EGFR-E746-A750-R:CAGACATGAGAAAAGGTGGG(SEQIDNO：12)。針對EGFR的V769_D770insASV設(shè)計用于制作探針的引物：EGFR-V769_D770insASV-F:AGCTTTTCCTCCATGAGTAC(SEQIDNO：13)；EGFR-V769_D770insASV-R:GATGCCCAGCAGGCGGCA(SEQIDNO：14)。針對EGFR的T790M設(shè)計用于制作探針的引物：EGFR-T790M-F:TCCACCGTGCAGCTCATC(SEQIDNO：15)；EGFR-T790M-R:ATCTCCCCTCCCCGTATCTC(SEQIDNO：16)。針對EGFR的L858R設(shè)計用于制作探針的引物：EGFR-L858R-F:ACTTGGAGGACCGTCGCTTG(SEQIDNO：17)；EGFR-L858R-R:AGTGGGAAGGCAGCCTGGT(SEQIDNO：18)。所有用于制作探針的引物5’端使用生物素標(biāo)記修飾。用于制作探針的DNA模板為健康人的基因組DNA。探針制作實驗體系(表1)及PCR程序如下：表1PCR程序如下：a)98℃1分鐘；b)15個循環(huán)程序如下：98℃30秒60℃30秒72℃30秒c)72℃1分鐘d)4℃保存。使用60μlAmpureXPbeads進行純化后所有探針等物質(zhì)的量混合。3.本實施例針對NRAS、KRAS、PIK3CA、EGFR這4個基因的常見7個突變點設(shè)計PCR上下游特異性富集引物。針對NRAS的Q61K設(shè)計PCR特異性富集引物：上游U-NRAS-Q61K-TN:CGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGTCTCATGGCACTGTACTC(SEQIDNO：19)。下游D-NRAS-Q61K-TN:CGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGGGACATACTGGATACAGCT(SEQIDNO：20)。針對KRAS的G12D設(shè)計PCR特異性富集引物：上游U-KRAS-G12D-TN:CGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGGTATCGTCAAGGCACTCTTGCC(SEQIDNO：21)。下游D-KRAS-G12D-TN:CGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGAACTTGTGGTAGTTGGAG(SEQIDNO：22)。針對PIK3CA的E545K設(shè)計PCR特異性富集引物,上游U-PIK3CA-E545K-TN:CGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGTGTGACTCCATAGAAAATCT(SEQIDNO：23)。下游D-PIK3CA-E545K-TN:CGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGATTTCTACACGAGATCCT(SEQIDNO：24)。針對EGFR的E746-A750設(shè)計PCR特異性富集引物,上游U-EGFR-E746-A750-TN:CGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGTTCCTTGTTGGCTTTCGGAG(SEQIDNO：25)。下游D-EGFR-E746-A750-TN:CGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGAAGTTAAAATTCCCGTCGC(SEQIDNO：26)。針對EGFR的V769_D770insASV設(shè)計PCR特異性富集引物：上游U-EGFR-V769_D770insASV-TN:CGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCTCCAGGAAGCCTACGTG(SEQIDNO：27)。下游D-EGFR-V769_D770insASV-TN:CGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGAGATGCCCAGCAGGCGGCA(SEQIDNO：28)。針對EGFR的T790M設(shè)計PCR特異性富集引物：上游U-EGFR-T790M-TN:CGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGGGAGGCAGCCGAAGGGCATG(SEQIDNO：29)。下游D-EGFR-T790M-TN:CGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGAGGAAGCCTACGTGATGGC(SEQIDNO：30)。針對EGFR的L858R設(shè)計PCR特異性富集引物：上游U-EGFR-L858R-TN:CGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGGTATTCTTTCTCTTCCGCAC(SEQIDNO：31)。下游D-EGFR-L858R-TN:CGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGGTCAAGATCACAGATTTTGG(SEQIDNO：32)。各個待檢測位點的PCR上游特異性富集引物等物質(zhì)的量混合構(gòu)成PCR上游特異性富集引物組。PCR下游特異性富集引物等物質(zhì)的量混合構(gòu)成PCR下游特異性富集引物組。4.最終PCR引物序列如下：UQ-P1:CAAGCAGAAGACGGCATACGA(SEQIDNO：33)；UQ-P2:AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG(SEQIDNO：34)。5.用于本實施例的背景樣本為一名健康人糞便中提取出的混合DNA(人糞便中提取出的DNA為混合DNA，其中大約60％的DNA來源于腸道細菌，剩余的絕大部分DNA來源于動物或植物食物殘渣，可用于檢測的結(jié)腸黏膜脫落細胞的DNA占總DNA的千分之一甚至更少。使用STRATECMolecular品牌PSPSpinStoolDNAPlusKit(Catalogue#:1038110300)進行糞便樣本DNA抽提。用于本實施例的突變摻和樣本來自HORIZONDISCOVERY公司的商業(yè)化標(biāo)準品MultiplexIcfDNAReferenceStandardSet(Catalogue#:HD780)，取該產(chǎn)品5％MultiplexI(每個待檢位點實際突變頻率見下表2)的DNA樣本與健康背景DNA片段按照1：999進行摻和。摻和后的樣本均分為兩份，一份用來進行本發(fā)明的實驗，另一份進行數(shù)字微滴PCR檢測(對照實驗)。5％MultiplexI各位點實際突變頻率：表2NRAS-Q61K6.3％KRAS-G12D6.3％PIK3CA-E545K6.3％EGFR-E746-A7505％EGFR-V769_D770insASV5％EGFR-T790M5％EGFR-L858R5％6.糞便基因組DNA片段化糞便基因組DNA取50ug，使用CovarisS220，超聲波DNA破碎儀片段化至平均250bp大小。7.片段化DNA末端修復(fù)反應(yīng)體系如下表3：表3金屬浴上20℃溫浴30分鐘。使用120μlAmpureXPbeads進行純化，100μl洗脫緩沖液洗脫。8.DNA摻和5％MultiplexIDNA與片段化DNA按照1：999進行摻和。取20ug摻和DNA進行本發(fā)明的如下實驗。剩余摻和DNA進行數(shù)字微滴PCR實驗(對照實驗)。9.3’端加多聚腺嘌呤尾反應(yīng)體系如下表4：表4末端修復(fù)的DNA溶液20ugKlenow酶緩沖液5μldATP10μlKlenowexo-酶3μl總體積50μl金屬浴上37℃溫浴30分鐘。使用60μlAmpureXPbeads進行純化，100μl洗脫緩沖液洗脫。10.連接接頭反應(yīng)體系如下表5：表53’加A的DNA溶液10ugT4DNA連接酶緩沖液25μl2μMDNA接頭1μlT4DNA連接酶5μl總體積50μlDNA接頭為ADT1或ADT2或ADT3。金屬浴上20℃溫浴15分鐘。使用60μlAmpureXPbeads進行純化，34.8μl去離子水洗脫。11.探針雜交預(yù)富集配制如下表6反應(yīng)1：表6蒸發(fā)濃縮至7ul。PCR儀上95℃5分鐘，66℃5分鐘。反應(yīng)體系如下表7：表7PCR儀上66℃雜交16小時。漂洗后使用DynabeadsTMM-270Streptavidin(Catalognos.65305，invitrogen)磁珠進行篩選。PCR儀上98℃10分鐘加熱洗脫。12.PCR特異性富集將步驟11的產(chǎn)物均分兩份，分別使用上游特異性引物組和下游特異性引物組進行PCR特異性富集。反應(yīng)體系如下表8：表8探針雜交預(yù)富集產(chǎn)物100ngAmplitaqGold360MasterMix25μlPCR特異性富集引物組(25uM)1μlGC-增強劑1μlUQ-P1(25uM)1μl總體積50μlPCR程序如下：e)95℃10分鐘；f)20個循環(huán)程序如下：95℃30秒62℃30秒72℃1分鐘g)72℃7分鐘h)4℃保存。使用60μlAmpureXPbeads進行純化，20μl洗脫緩沖液洗脫。13.終文庫擴增反應(yīng)體系如下表9：表9PCR特異性富集產(chǎn)物20μlHIFIReadyMix(KAPABIOSYSTEMS)25μlUQ-P1+UQ-P2(各5uM)5μl總體積50μlPCR程序如下：a)98℃45秒；b)10循環(huán)程序如下：98℃15秒60℃30秒72℃30秒c)72℃1分鐘d)4℃保存。取其中5μl產(chǎn)物進行2％瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖4所示。使用60μlAmpureXPbeads進行純化，30μl洗脫緩沖液洗脫。14.最終文庫經(jīng)過熒光定量PCR質(zhì)控后，利用Illumina公司NextSeq500進行75bp雙端測序。15.將高通量測序下機數(shù)據(jù)經(jīng)過質(zhì)控過濾后，進行BWA比對，計算目標(biāo)位點的突變頻率，結(jié)果見下表10：表10實驗結(jié)果證明，應(yīng)用本發(fā)明的實驗方法能夠從多種復(fù)雜混合DNA中準確檢測出痕量目標(biāo)DNA突變。以上內(nèi)容是結(jié)合具體的實施方式對本發(fā)明所作的進一步詳細說明，不能認定本發(fā)明的具體實施只局限于這些說明。對于本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明的保護范圍。SEQUENCELISTING<110>人和未來生物科技（長沙）有限公司<120>一種從多種混合DNA中超靈敏檢測痕量DNA的方法和試劑<130>16I23775<160>34<170>PatentInversion3.3<210>1<211>73<212>DNA<213>接頭序列<220><221>misc_feature<222>(25)..(32)<223>nisa,c,g,ort<400>1caagcagaagacggcatacgagatnnnnnnnnggaattagtgactggagttcagacgtgt60gctcttccgatct73<210>2<211>73<212>DNA<213>接頭序列<220><221>misc_feature<222>(25)..(32)<223>nisa,c,g,ort<400>2caagcagaagacggcatacgagatnnnnnnnnatccggcgtgactggagttcagacgtgt60gctcttccgatct73<210>3<211>73<212>DNA<213>接頭序列<220><221>misc_feature<222>(25)..(32)<223>nisa,c,g,ort<400>3caagcagaagacggcatacgagatnnnnnnnncaggccggtgactggagttcagacgtgt60gctcttccgatct73<210>4<211>12<212>DNA<213>接頭序列<400>4gatcggaagagc12<210>5<211>20<212>DNA<213>引物序列<400>5ccttaccctccacaccccca20<210>6<211>16<212>DNA<213>引物序列<400>6gttaatatccgcaaat16<210>7<211>21<212>DNA<213>引物序列<400>7gtgacatgttctaatatagtc21<210>8<211>21<212>DNA<213>引物序列<400>8taatatgcatattaaaacaag21<210>9<211>20<212>DNA<213>引物序列<400>9tattttacagagtaacagac20<210>10<211>20<212>DNA<213>引物序列<400>10agatcagccaaattcagtta20<210>11<211>20<212>DNA<213>引物序列<400>11acaattgccagttaacgtct20<210>12<211>20<212>DNA<213>引物序列<400>12cagacatgagaaaaggtggg20<210>13<211>20<212>DNA<213>引物序列<400>13agcttttcctccatgagtac20<210>14<211>18<212>DNA<213>引物序列<400>14gatgcccagcaggcggca18<210>15<211>18<212>DNA<213>引物序列<400>15tccaccgtgcagctcatc18<210>16<211>20<212>DNA<213>引物序列<400>16atctcccctccccgtatctc20<210>17<211>20<212>DNA<213>引物序列<400>17acttggaggaccgtcgcttg20<210>18<211>19<212>DNA<213>引物序列<400>18agtgggaaggcagcctggt19<210>19<211>50<212>DNA<213>引物序列<400>19cgtcggcagcgtcagatgtgtataagagacagtctcatggcactgtactc50<210>20<211>51<212>DNA<213>引物序列<400>20cgtcggcagcgtcagatgtgtataagagacagggacatactggatacagct51<210>21<211>54<212>DNA<213>引物序列<400>21cgtcggcagcgtcagatgtgtataagagacaggtatcgtcaaggcactcttgcc54<210>22<211>50<212>DNA<213>引物序列<400>22cgtcggcagcgtcagatgtgtataagagacagaacttgtggtagttggag50<210>23<211>52<212>DNA<213>引物序列<400>23cgtcggcagcgtcagatgtgtataagagacagtgtgactccatagaaaatct52<210>24<211>50<212>DNA<213>引物序列<400>24cgtcggcagcgtcagatgtgtataagagacagatttctacacgagatcct50<210>25<211>52<212>DNA<213>引物序列<400>25cgtcggcagcgtcagatgtgtataagagacagttccttgttggctttcggag52<210>26<211>51<212>DNA<213>引物序列<400>26cgtcggcagcgtcagatgtgtataagagacagaagttaaaattcccgtcgc51<210>27<211>50<212>DNA<213>引物序列<400>27cgtcggcagcgtcagatgtgtataagagacagctccaggaagcctacgtg50<210>28<211>51<212>DNA<213>引物序列<400>28cgtcggcagcgtcagatgtgtataagagacagagatgcccagcaggcggca51<210>29<211>52<212>DNA<213>引物序列<400>29cgtcggcagcgtcagatgtgtataagagacagggaggcagccgaagggcatg52<210>30<211>51<212>DNA<213>引物序列<400>30cgtcggcagcgtcagatgtgtataagagacagaggaagcctacgtgatggc51<210>31<211>52<212>DNA<213>引物序列<400>31cgtcggcagcgtcagatgtgtataagagacaggtattctttctcttccgcac52<210>32<211>52<212>DNA<213>引物序列<400>32cgtcggcagcgtcagatgtgtataagagacaggtcaagatcacagattttgg52<210>33<211>21<212>DNA<213>引物序列<400>33caagcagaagacggcatacga21<210>34<211>62<212>DNA<213>引物序列<400>34aatgatacggcgaccaccgagatctacactcgtcggcagcgtcagatgtgtataagagac60ag62當(dāng)前第1頁1 2 3