一、技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及痕量檢測領(lǐng)域，特別涉及一種潛在指紋中蛋白質(zhì)成分的提取及顯現(xiàn)方法。

二、

背景技術(shù)：

指紋鑒定是進(jìn)行個人識別的最可靠的方法之一，目前警方利用刑事技術(shù)偵破的案件中，指紋識別占七成左右。指紋一度被司法界公認(rèn)為“物證之首”。潛在指紋中包含著復(fù)雜的成分，如內(nèi)源性的蛋白質(zhì)、氨基酸、藥物代謝物，以及外源性的爆炸物、違禁藥物等。這些成分可以通過相應(yīng)的抗體進(jìn)行識別檢測。充分、準(zhǔn)確地了解潛在指紋的組成成分，不僅有助于人們選擇合適的顯現(xiàn)方法以達(dá)到成功識別指紋的目的，還能為研究者提供更多有價值的附加信息，如指紋的遺留時間、主人的性別、年齡甚至生活習(xí)慣等。

申請公布號為“cn103543145a”的中國發(fā)明專利公開了“基于化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫分析的潛在指紋成像的方法”，該方法在指紋上直接加入手指代謝物的抗體溶液進(jìn)行孵育，孵育完成后用緩沖液進(jìn)行沖洗；將所述的指紋樣本干燥，然后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗進(jìn)行孵育；孵育后，用緩沖溶液沖洗指紋樣本，干燥后將指紋樣本置于化學(xué)發(fā)光反應(yīng)底物溶液中，采集指紋圖像。該方法雖然簡單快速，但是該方法容易受雜質(zhì)影響(如指紋中的油脂、灰塵)，存在非特異性吸附的問題。

蛋白質(zhì)印跡法是蛋白質(zhì)分析最成熟的技術(shù)之一。該方法主要利用抗原抗體的高特異性結(jié)合原理，通過信號放大作用，將基底的蛋白部分以圖像的形式顯現(xiàn)出來，方法直觀、方便。本發(fā)明采用蛋白質(zhì)印跡法提取潛在指紋中的蛋白質(zhì)成分，可避免油脂、灰塵等雜質(zhì)對檢測結(jié)果的影響，提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。本發(fā)明為研究潛在指紋中的蛋白質(zhì)成分提供了科學(xué)依據(jù)，并可有效地提高公安機(jī)關(guān)提取鑒別潛在指紋的工作效率。

三、

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足，解決現(xiàn)有技術(shù)中蛋白質(zhì)成分提取難度大，后期檢驗鑒定困難的問題，本發(fā)明提供了一種潛在指紋中蛋白質(zhì)成分的提取及顯現(xiàn)方法。本發(fā)明方法簡單、檢測特異性好、發(fā)光強(qiáng)度高，可對指紋清晰顯現(xiàn)。

本發(fā)明的技術(shù)方案為：

一種潛在指紋中蛋白質(zhì)成分的提取及顯現(xiàn)方法，包括步驟：

1)將客體上殘留的潛在指紋樣本轉(zhuǎn)移至sds-page膠上；

2)將指紋樣本上的目的蛋白轉(zhuǎn)移至pvdf膜上；

3)將步驟2)處理后的pvdf膜浸入脫脂牛奶中封閉0.5-2h，然后清洗pvdf膜上過多的牛奶；

4)向步驟3)處理后的pvdf膜上滴加一抗溶液進(jìn)行孵育，孵育完成后清洗過多抗體；

5)向步驟4)處理后的pvdf膜上滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗溶液進(jìn)行孵育，孵育完成后清洗過多抗體；

6)向步驟5)處理后的pvdf膜上滴加顯影液，暗箱中顯影，得到清晰的指紋圖像。

作為優(yōu)選方案，步驟1)中所述基底為無孔玻璃基底或者多孔紙質(zhì)基底。

作為優(yōu)選方案，步驟1)中，sds-page膠的組成如下：4-5ml水、2-3ml30％的丙烯酰胺、2-3ml濃度為1.5mol/lph為8.8的tris溶液、0.05-0.15ml10％的sds溶液、5-7μltemed。指紋中的蛋白質(zhì)分子與sds結(jié)合形成帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)-sds復(fù)合物，在電壓作用下轉(zhuǎn)移到pvdf膜上。

作為優(yōu)選方案，步驟2)中采用濕轉(zhuǎn)儀將目的蛋白轉(zhuǎn)移至pvdf膜上。

進(jìn)一步地，濕轉(zhuǎn)時，設(shè)定電壓110-130v，轉(zhuǎn)移時間為20-40min?？梢允沟鞍踪|(zhì)充分轉(zhuǎn)移到pvdf膜上。

作為優(yōu)選方案，步驟3)中脫脂牛奶的濃度為4-6％(w/v)。該濃度可以有效地結(jié)合pvdf膜上的非特異性吸附位點。

作為優(yōu)選方案，步驟3)、4)、5)中清洗均采用tbst緩沖液清洗；所述tbst緩沖液為含0.05％tween-20的tbs緩沖液，tbs緩沖溶液為0.1mtris-hcl，ph為7.5，含0.15mnacl。

作為優(yōu)選方案，步驟4)中所述一抗溶液為兔抗人egf、兔抗人溶菌酶、兔抗人皮離蛋白溶液中的任意一種，所述一抗溶液的濃度為0.01-0.03mg/ml。

作為優(yōu)選方案，步驟5)中所述二抗溶液為辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔igg，所述二抗溶液的濃度為0.005-0.015mg/ml。

作為優(yōu)選方案，步驟6)中所述顯影液為ph為8.5的0.1mtris-hcl含0.4-0.6mm魯米諾、0.2-0.3mm對碘苯酚和2-5mm過氧化氫。

本發(fā)明方法實現(xiàn)了對潛在指紋的高靈敏檢測，主要包括：將客體上殘留的潛在指紋樣本轉(zhuǎn)移至sds-page膠上；利用濕轉(zhuǎn)方式將目標(biāo)蛋白轉(zhuǎn)移至pvdf膜；選擇特異性檢測目標(biāo)蛋白的一抗與辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，利用抗體與目標(biāo)物的特異性反應(yīng)，將辣根過氧化物酶連接到目標(biāo)檢測物上；增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光底物在辣根過氧化物酶催化下產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，從而顯現(xiàn)出指紋并可由此確定待測物的存在。

本發(fā)明的有益效果為：

1、本發(fā)明在添加檢測試劑前預(yù)先提取潛在指紋中的蛋白質(zhì)成分，特異性強(qiáng)，避免了非特異性吸附問題；

2、本發(fā)明使用pvdf膜作為蛋白質(zhì)載體，蛋白質(zhì)的附著力強(qiáng)；

3、本發(fā)明的檢測方法使蛋白質(zhì)信號放大，靈敏度高，且發(fā)光試劑造價低；

4、本發(fā)明操作簡單，采用傳統(tǒng)蛋白質(zhì)印跡方法，可靠，穩(wěn)定。

四、附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動性的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1為本發(fā)明潛在指紋中蛋白質(zhì)成分的提取及顯現(xiàn)方法檢測潛在指紋示意圖；

圖2為實施例1潛在指紋中蛋白質(zhì)成分的提取及顯現(xiàn)方法檢測潛在指紋的發(fā)光圖像。

圖3為實施例2潛在指紋中蛋白質(zhì)成分的提取及顯現(xiàn)方法檢測潛在指紋的發(fā)光圖像。

五、具體實施方式

實施例1

潛在指紋中蛋白質(zhì)成分的提取及顯現(xiàn)方法，包括：

1)將指紋按捺在無孔玻璃基底上；玻璃基底分別用無水乙醇，水超聲清洗20min；

2)將基底上的指紋樣本轉(zhuǎn)移到8％的sds-page膠上；

8％的sds-page膠的配制如下：

水：4.6ml；30％的丙烯酰胺：2.7ml；1.5mtris(ph8.8)：2.5ml；10％的sds：0.1ml；temed：6μl；

3)使用濕轉(zhuǎn)儀，設(shè)定電壓120v，轉(zhuǎn)移時間30min，將sds-page膠上指紋樣本的目的蛋白轉(zhuǎn)移到pvdf膜上；

4)轉(zhuǎn)移完成后，將pvdf膜浸入5％(w/v)的脫脂牛奶中封閉1h；

5)用tbst清洗膜上過多的牛奶，清洗3次，每次5min；

6)向步驟6)處理后的pvdf膜上滴加0.02mg/ml一抗(兔抗人egf)，4℃過夜孵育一抗溶液進(jìn)行孵育；

7)tbst清洗膜上過多的抗體，清洗3次，每次10min；

8)向步驟8)處理后的pvdf膜上滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(羊抗兔igg)常溫孵育1h，二抗?jié)舛葹?.01mg/ml；

9)tbst清洗膜上過多的抗體，清洗3次，每次10min；

10)配制顯影液(顯影液為ph為8.5的0.1mtris-hcl，含0.5mm魯米諾、0.23mm對碘苯酚和3mm過氧化氫)，將其均勻滴到步驟10)處理后的pvdf膜上，暗箱中顯影，得到清晰指紋圖像。在辣根過氧化物酶的作用下，過氧化氫與魯米諾反應(yīng)產(chǎn)生波長為425nm的光，從而顯現(xiàn)出指紋。

其中，步驟5)、7)、9)中的tbst為含0.05％tween-20的tbs緩沖液，tbs緩沖溶液為0.1mtris-hcl，ph為7.5，含0.15mnacl。

本發(fā)明潛在指紋中蛋白質(zhì)成分的提取及顯現(xiàn)方法檢測潛在指紋示意圖如圖1所示，選擇特異性檢測目標(biāo)蛋白的一抗與辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，利用抗體與目標(biāo)物的特異性反應(yīng)，將辣根過氧化物酶連接到目標(biāo)檢測物上；增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光底物在辣根過氧化物酶催化下產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，從而顯現(xiàn)出指紋并可由此確定待測物的存在。

本實施例潛在指紋中蛋白質(zhì)成分的提取及顯現(xiàn)方法檢測潛在指紋的發(fā)光圖像如圖2所示，可見本發(fā)明方法可獲得的指紋圖像，指紋紋線清晰。

實施例2

潛在指紋中蛋白質(zhì)成分的提取及顯現(xiàn)方法，包括：

1)將指紋按捺在多孔紙質(zhì)基底(普通商品化a4紙)上；

2)將基底上的指紋樣本轉(zhuǎn)移到10％的sds-page膠上；

10％的sds-page膠的配制如下：

水：4.1ml；30％的丙烯酰胺：3.3ml；1.5mtris(ph8.8)：2.5ml；10％的sds：0.1ml；temed：6μl；

3)使用濕轉(zhuǎn)儀，設(shè)定電壓110v，轉(zhuǎn)移時間30min，將sds-page膠上指紋樣本的目的蛋白轉(zhuǎn)移到pvdf膜上；

4)轉(zhuǎn)移完成后，將pvdf膜浸入4％(w/v)的脫脂牛奶中封閉1.5h；

5)用tbst清洗膜上過多的牛奶，清洗3次，每次5min；

6)向步驟6)處理后的pvdf膜上滴加0.03mg/ml一抗(兔抗人皮離蛋白)，4℃過夜孵育一抗溶液進(jìn)行孵育；

7)tbst清洗膜上過多的抗體，清洗3次，每次10min，

8)向步驟8)處理后的pvdf膜上滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(羊抗兔igg)常溫孵育1h，二抗?jié)舛葹?.02mg/ml；

9)tbst清洗膜上過多的抗體，清洗3次，每次10min；

10)配制顯影液(顯影液為ph為8.5的0.1mtris-hcl含0.5mm魯米諾、0.23mm對碘苯酚和2mm過氧化氫)，將其均勻滴到步驟10)處理后的pvdf膜上，暗箱中顯影，得到清晰指紋圖像。在辣根過氧化物酶的作用下，過氧化氫與魯米諾反應(yīng)產(chǎn)生波長為425nm的光，從而顯現(xiàn)出指紋。

其中，步驟5)、7)、9)中的tbst為含0.05％tween-20的tbs緩沖液，tbs緩沖溶液為0.1mtris-hcl，ph為7.5，含0.15mnacl。

實施例3

潛在指紋中蛋白質(zhì)成分的提取及顯現(xiàn)方法，包括：

1)將指紋按捺在多孔紙質(zhì)基底(普通商品化a4紙)上；

2)將基底上的指紋樣本轉(zhuǎn)移到10％的sds-page膠上；

10％的sds-page膠的配制如下：

水：4.1ml；30％的丙烯酰胺：3.3ml；1.5mtris(ph8.8)：2.5ml；10％的sds：0.1ml；temed：6μl；

3)使用濕轉(zhuǎn)儀，設(shè)定電壓110v，轉(zhuǎn)移時間30min，將sds-page膠上指紋樣本的目的蛋白轉(zhuǎn)移到pvdf膜上；

4)轉(zhuǎn)移完成后，將pvdf膜浸入4％(w/v)的脫脂牛奶中封閉1.5h；

5)用tbst清洗膜上過多的牛奶，清洗3次，每次5min；

6)向步驟6)處理后的pvdf膜上滴加0.03mg/ml一抗(兔抗人溶菌酶)，4℃過夜孵育一抗溶液進(jìn)行孵育；

7)tbst清洗膜上過多的抗體，清洗3次，每次10min，

8)向步驟8)處理后的pvdf膜上滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(羊抗兔igg)常溫孵育1h，二抗?jié)舛葹?.02mg/ml；

9)tbst清洗膜上過多的抗體，清洗3次，每次10min；

10)配制顯影液(顯影液為ph為8.5的0.1mtris-hcl含0.5mm魯米諾、0.23mm對碘苯酚和2mm過氧化氫)，將其均勻滴到步驟10)處理后的pvdf膜上，暗箱中顯影，得到清晰指紋圖像。在辣根過氧化物酶的作用下，過氧化氫與魯米諾反應(yīng)產(chǎn)生波長為425nm的光，從而顯現(xiàn)出指紋。

其中，步驟5)、7)、9)中的tbst為含0.05％tween-20的tbs緩沖液，tbs緩沖溶液為0.1mtris-hcl，ph為7.5，含0.15mnacl。