本發(fā)明屬于生物基因工程領(lǐng)域，具體涉及厚藤金屬硫蛋白IpMT(Ipomoea pes-caprae metallothionein，IpMT)及其編碼基因IpMT在調(diào)控工程菌釀酒酵母鎘耐受和鎘積累方面的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

近年來，重金屬污染已成為影響生態(tài)環(huán)境和人類健康重要因素之一，而重金屬對(duì)植物(尤其是農(nóng)作物)生長和品質(zhì)的影響也成為制約國民經(jīng)濟(jì)的重要方面。在中國，以鎘污染最為嚴(yán)重。鎘是一種生物體非必需的毒性元素，一般在自然界中以非活化的化合物狀態(tài)存在，含量極低，對(duì)生物體的毒性也較弱。隨著人類活動(dòng)對(duì)環(huán)境的干擾，具有較高生物學(xué)活性的鎘被越來越多地釋放到自然界中，并不同程度地積累于植物和農(nóng)作物體內(nèi)，危害植物的生長，并影響農(nóng)作物的品質(zhì)。鎘也可通過食物鏈進(jìn)入人體，從而對(duì)人體健康造成危害。

厚藤(Ipomoea pes-caprae L.)又名馬鞍藤、二葉紅薯、馬蹄草，主要分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)海邊沙灘上及向陽的路邊，是一種優(yōu)良的濱海適生野生植物資源。有研究表明，在重金屬污染的鉛鋅礦地區(qū)，野生厚藤對(duì)重金屬鎘的富集系數(shù)和轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)均較高，表明厚藤對(duì)鎘具有一定的富集能力，具備作為海灘重金屬鎘污染修復(fù)植物的基礎(chǔ)。此外，厚藤作為一種泛熱帶性分布型鹽生植物(halophyte)，除了耐鹽性強(qiáng)、生長迅速、地上部分生物量較大之外，還具備其他潛在的特征使其在濱海地區(qū)重金屬污染植物修復(fù)方面比淡土植物(glycophyte)或超積累植物(hyperaccumulator)更具有優(yōu)勢(shì)。首先，鹽生植物通常體內(nèi)會(huì)合成一定的滲透調(diào)節(jié)劑，用來保護(hù)植物免受高鹽或滲透壓脅迫的傷害，而重金屬毒害通常也會(huì)造成植物細(xì)胞內(nèi)水平衡失衡和細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂，富余的植物滲透調(diào)節(jié)劑也可以通過緩解重金屬脅迫引起的水分脅迫傷害，從而提高鹽生植物對(duì)重金屬脅迫的耐受性；其次，鹽生植物體內(nèi)具備較強(qiáng)的抗氧化體系，而這些抗氧化物質(zhì)也會(huì)降低重金屬引發(fā)的氧化脅迫傷害，從而提高植物對(duì)重金屬毒性的耐受性；此外，鹽滯土壤中的鹽離子還可在一定程度上促進(jìn)重金屬在植物體內(nèi)的轉(zhuǎn)移，從而提高鹽生植物對(duì)重金屬的富集效率。

金屬硫蛋白是生物體內(nèi)廣泛存在的金屬結(jié)合蛋白，分子量較低，富含半胱氨酸，可以結(jié)合鎘、鋅、銅在內(nèi)的多種重金屬。同時(shí)，由于半胱氨酸殘基具有較強(qiáng)的還原性，金屬硫蛋白也是一個(gè)還原性的蛋白，能清除細(xì)胞內(nèi)富余的活性氧，降低由各種逆境脅迫照成的氧化脅迫傷害。研究表明，金屬硫蛋白不僅參與體內(nèi)微量元素的儲(chǔ)存、轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝，拮抗電離輻射，清除自由基以及對(duì)重金屬的解毒作用，還與生物體生長發(fā)育、抗病等有關(guān)。由于金屬硫蛋白的這種特征，決定了該類蛋白已經(jīng)在醫(yī)學(xué)、環(huán)境、食品、化妝品等領(lǐng)域進(jìn)行了開發(fā)和應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的之一是提供一個(gè)厚藤金屬硫蛋白IpMT，及其編碼基因IpMT的應(yīng)用。

本發(fā)明的所闡述的厚藤金屬硫蛋白IpMT，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示，其編碼基因IpMT的cDNA閱讀框核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示。應(yīng)當(dāng)理解，考慮到密碼子的簡并性，在不改變氨基酸序列的前提下，對(duì)上述編碼基因的核苷酸序列進(jìn)行修改，也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。即所述IpMT基因的cDNA閱讀框?yàn)槿鏢EQ ID NO.2所示的核苷酸序列，或?yàn)榕cSEQ ID NO.2互補(bǔ)配對(duì)的核苷酸序列，或?yàn)榫幋a序列氨基酸序列如SEQ ID NO.1的核苷酸序列。

本發(fā)明的另一目的是提供一種將上述厚藤金屬硫蛋白基因IpMT應(yīng)用于植物基因工程中，用于改變轉(zhuǎn)基因植物對(duì)重金屬鎘的耐受和富集的可能性。本發(fā)明公開了厚藤金屬硫蛋白基因在鎘脅迫下的誘導(dǎo)表達(dá)特征，表明了該基因參與重金屬鎘脅迫的應(yīng)答及解毒。本發(fā)明采用real time RT-PCR的方法鑒定了一個(gè)厚藤金屬硫蛋白基因在重金屬Cd脅迫下的表達(dá)特征，論證了該基因?yàn)楹裉袤w內(nèi)應(yīng)答重金屬鎘脅迫的重要基因，進(jìn)一步延伸了該基因作為影響植物體內(nèi)鎘積累和脅迫的候選功能基因。

本發(fā)明的另一目的是公開一個(gè)釀酒酵母重組表達(dá)載體，該重組表達(dá)載體插入了厚藤金屬硫蛋白基因IpMT。將該重組載體轉(zhuǎn)化進(jìn)入釀酒酵母中，能夠在鎘脅迫下，提高轉(zhuǎn)基因酵母菌對(duì)重金屬鎘的耐受，并提高酵母細(xì)胞內(nèi)鎘積累。

本發(fā)明以厚藤幼苗為材料，提取RNA，并將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板，設(shè)計(jì)以下引物分別擴(kuò)增IpMT基因的cDNA全長序列，用于獲取插入至釀酒酵母表達(dá)載體pYES2的cDNA閱讀框片。引物如SEQ ID NO.3(IpMTYEF：5’-TACCGAGCTCGGATCCATGTCTTCCGGTTGCAAGTG-3’)和SEQ ID NO.4(IpMTYER：5’-TAGATGCATGCTCGAGCTAACAGTTGCAAGGGTCAC-3’)所示。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種釀酒酵母工程菌株及其應(yīng)用，該釀酒酵母工程菌株轉(zhuǎn)化有上述的釀酒酵母重組表達(dá)載體。上述的釀酒酵母工程菌株在對(duì)環(huán)境中重金屬鎘污染的修復(fù)中的應(yīng)用。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種提高厚藤中重金屬鎘耐受性的生物制劑。

所述提高厚藤中重金屬鎘耐受性的生物制劑其活性成份來源于上述釀酒酵母重組表達(dá)載體或上述釀酒酵母，或其活性成份含有調(diào)控IpMT基因表達(dá)的生物制品，所述IpMT基因的cDNA閱讀框?yàn)槿鏢EQ ID NO.2所示的核苷酸序列，或?yàn)榕cSEQ ID NO.2互補(bǔ)配對(duì)的核苷酸序列，或?yàn)榫幋a序列氨基酸序列如SEQ ID NO.1的核苷酸序列。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種提高厚藤中重金屬鎘耐受性的生物制劑。

所述提高植物中重金屬鎘積累的生物制劑，其活性成份來源于上述釀酒酵母重組表達(dá)載體或上述釀酒酵母，或其活性成份含有調(diào)控IpMT基因表達(dá)的生物制品，所述IpMT基因的cDNA閱讀框?yàn)槿鏢EQ ID NO.2所示的核苷酸序列，或?yàn)榕cSEQ ID NO.2互補(bǔ)配對(duì)的核苷酸序列，或?yàn)榫幋a序列氨基酸序列如SEQ ID NO.1的核苷酸序列。

所述調(diào)控植物中重金屬鎘耐受性或重金屬鎘積累的方法，該方法包括調(diào)控所述植物的IpMT基因的表達(dá)，所述IpMT基因的cDNA閱讀框?yàn)槿鏢EQ ID NO.2所示的核苷酸序列，或?yàn)榕cSEQ ID NO.2互補(bǔ)配對(duì)的核苷酸序列，或?yàn)榫幋a序列氨基酸序列如SEQ ID NO.1的核苷酸序列。

以上PCR采用高保真的Taq酶進(jìn)行擴(kuò)增，并將得到的目的DNA片段進(jìn)行回收，連接于酵母表達(dá)載體pYES2上(BamHI和XhoI之間)，形成重組載體IpMT-pYES2，并測(cè)序。

采用醋酸鋰的方法將上述厚藤金屬硫蛋白重組載體轉(zhuǎn)化進(jìn)入釀酒酵母中，采用誘導(dǎo)的極限培養(yǎng)基(添加半乳糖)培養(yǎng)酵母轉(zhuǎn)化子克隆，以轉(zhuǎn)化pYES2空載體的酵母菌株為對(duì)照，30℃培養(yǎng)酵母至OD₆₀₀為1.5-2，用于檢測(cè)轉(zhuǎn)基因酵母菌對(duì)重金屬鎘脅迫的耐受性以及對(duì)鎘積累的變化。

在本發(fā)明中，我們公開了厚藤體內(nèi)的一個(gè)金屬硫蛋白基因，該基因在厚藤體內(nèi)的表達(dá)對(duì)重金屬鎘脅迫響應(yīng)。厚藤金屬硫蛋白IpMT基因的表達(dá)能夠提高酵母菌對(duì)重金屬鎘的耐受性，并影響重金屬鎘在酵母體內(nèi)的積累，提供了將該基因應(yīng)用于工程菌釀酒酵母的耐鎘遺傳改良的應(yīng)用，也可應(yīng)用于針對(duì)鎘污染微生物修復(fù)工程菌的遺傳改造；本發(fā)明也簡單闡述了可將該基因應(yīng)用于植物的遺傳改造，培育用于重金屬鎘污染植物修復(fù)的轉(zhuǎn)基因重金屬超積累植物。

本發(fā)明的有益效果如下：在本發(fā)明中，我們通過逆轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增獲得的一個(gè)厚藤金屬硫蛋白基因IpMT的應(yīng)用性進(jìn)行探索，闡述了該基因以下應(yīng)用方式：(1)該金屬硫蛋白基因IpMT在厚藤體內(nèi)的表達(dá)具備重金屬Cd誘導(dǎo)表達(dá)的特征，表明該基因具有鎘脅迫應(yīng)答的基本功能，可將該基因應(yīng)用于植物(作物)針對(duì)重金屬鎘的遺傳育種，改變植物(作物)對(duì)鎘的耐受性或富集性。(2)厚藤金屬硫蛋白基因IpMT在釀酒酵母中能夠提高酵母對(duì)重金屬鎘的耐受性，可將該類基因應(yīng)用于工程菌針對(duì)重金屬鎘的耐受性基因工程改良；(3)厚藤金屬硫蛋白基因在釀酒酵母中的表達(dá)能夠提高酵母細(xì)胞對(duì)重金屬鎘的積累，促進(jìn)酵母對(duì)外界環(huán)境中鎘的富集?？蓪⒃摶驊?yīng)用于針對(duì)重金屬鎘污染的微生物修復(fù)工程菌的遺傳改造。

附圖說明

圖1示IpMT基因的cDNA閱讀框序列PCR擴(kuò)增電泳分析。

圖2示構(gòu)建完成的釀酒酵母重組表達(dá)載體IpMT-pYES2的示意圖。

圖3示轉(zhuǎn)化IpMT-pYES2的轉(zhuǎn)基因酵母突變體菌株ycflΔ對(duì)鎘的耐受性提高，可以在含有0.1mM的Cd的培養(yǎng)基上生長。

圖4示轉(zhuǎn)化IpMT-pYES2的轉(zhuǎn)基因酵母野生型菌株WT對(duì)鎘的耐受性提高，可以在含有0.2mM的Cd的培養(yǎng)基上正常生長。

圖5示釀酒酵母重組表達(dá)載體IpMT-pYES2和空載體對(duì)照pYES2轉(zhuǎn)化酵母野生型菌株WT在未添加Cd的培養(yǎng)基中生長曲線測(cè)定。

圖6示釀酒酵母重組表達(dá)載體IpMT-pYES2和空載體對(duì)照pYES2轉(zhuǎn)化酵母野生型菌株WT在添加20μM Cd的培養(yǎng)基中生長曲線測(cè)定。

圖7示釀酒酵母重組表達(dá)載體IpMT-pYES2和空載體對(duì)照pYES2轉(zhuǎn)化酵母野生型菌株WT和突變體菌株ycf1Δ后鎘離子含量測(cè)定。

圖8示厚藤金屬硫蛋白基因IpMT在厚藤體內(nèi)的表達(dá)中受到重金屬鎘的誘導(dǎo)。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明描述了厚藤金屬硫蛋白基因IpMT在生物工程方面的應(yīng)用。本發(fā)明首先克隆了厚藤金屬硫蛋白基因IpMT的cDNA閱讀框全長。以采于惠州海灘(N22°41′24.81″，E114°44′48.02″)的幼嫩厚藤植物樣品為材料，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板，采用引物對(duì)IpMTYEF和IpMTYER擴(kuò)增IpMT的cDNA閱讀框全長，并采用In-Fusion的方法插入至釀酒酵母表達(dá)載體pYES2中。之后將這一重組載體轉(zhuǎn)化進(jìn)入釀酒酵母，使IPMT基因在酵母中超量表達(dá)，可以提高酵母對(duì)重金屬鎘的耐受性，并增加酵母對(duì)外界環(huán)境中重金屬鎘污染的富集。依次類推，由于該類基因來源于植物(厚藤)，通過控制該金屬硫蛋白基因IpMT在植物中的表達(dá)，也可將這一類基因應(yīng)用于植物基因工程，用于培育耐鎘的植物轉(zhuǎn)基因品種，也可用來培育重金屬鎘超積累轉(zhuǎn)基因植物，應(yīng)用于環(huán)境重金屬鎘污染的植物修復(fù)工程。

我們以實(shí)驗(yàn)室萌發(fā)并培育的厚藤幼苗為材料，采用重金屬Cd進(jìn)行脅迫處理，采用real time RT-PCR方法分別檢測(cè)IpMT基因在厚藤幼根和幼葉中的表達(dá)特征，所用的引物序列為SEQ ID NO.3(IpMTYEF：5’-TACCGAGCTCGGATCCATGTCTTCCGGTTGCAAGTG-3’)和SEQ ID NO.4(IpMTYER：5’-TAGATGCATGCTCGAGCTAACAGTTGCAAGGGTCAC-3’)，采用的內(nèi)參基因?yàn)楹裉偌?dòng)蛋白基因IpActin(NCBI登錄號(hào)為：KU564627)，其檢測(cè)引物序列為SEQ ID NO.5(IpACTRTF：5’-TGGCGCTGAGAGATTTCGTT-3’)和SEQ ID NO.6(IpACTRTR：5’-GCTCATGCGATCGGCAATAC-3’)。本發(fā)明中，我們所公開的厚藤金屬硫蛋白基因IpMT在厚藤植株中的表達(dá)受到重金屬Cd的誘導(dǎo)，且在根中的誘導(dǎo)表達(dá)特征明顯，表明該基因參與了厚藤應(yīng)答重金屬Cd的脅迫，具有進(jìn)行煙草重金屬鎘解毒的基本特征，在本發(fā)明中，具有可推廣應(yīng)用于植物(作物)針對(duì)重金屬的遺傳育種的潛力。

SEQ ID NO.1

氨基酸序列

＞IpMT protein

MSSGCKCGADCKCGSDCGCEEVTTTVTIIEGVAPVKLTLEGSSEKATEGGHACKCGSNCTCDPCNC

SEQ ID NO.2

cDNA閱讀框核苷酸序列

＞IpMT

ATGTCTTCCGGTTGCAAGTGTGGCGCCGACTGCAAGTGCGGCAGTGACTGTGGATGTGAAGAGGTGACCACCACCGTCACCATCATCGAGGGGGTTGCACCAGTGAAGTTGACCTTAGAGGGGTCTTCTGAGAAGGCTACAGAGGGAGGACATGCCTGCAAGTGTGGATCAAACTGCACCTGTGACCCTTGCAACTGTTAG

SEQ ID NO.3

RT-PCR擴(kuò)增IpMT閱讀框序列的上游引物核苷酸序列

＞IpMTYEF

TACCGAGCTCGGATCCATGTCTTCCGGTTGCAAGTG

SEQ ID NO.4

RT-PCR擴(kuò)增IpMT閱讀框序列的下游引物核苷酸序列

＞IpMTYER

TAGATGCATGCTCGAGCTAACAGTTGCAAGGGTCAC

SEQ ID NO.5

Real time RT-PCR檢測(cè)厚藤內(nèi)參基因IpActin的表達(dá)的上游引物核苷酸序列

＞IpACTRTF

TGGCGCTGAGAGATTTCGTT

SEQ ID NO.6

Real time RT-PCR檢測(cè)厚藤內(nèi)參基因IpActin的表達(dá)的下游引物核苷酸序列

＞IpACTRTR

GCTCATGCGATCGGCAATAC

為了便于理解本發(fā)明，下面將對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更全面的描述。本發(fā)明可以以許多不同的形式來實(shí)現(xiàn)，并不限于本文所描述的實(shí)施例。相反地，提供這些實(shí)施例的目的是使對(duì)本發(fā)明公開內(nèi)容的理解更加透徹全面。

下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例中所用到的各種常用化學(xué)試劑，均為市售產(chǎn)品。

除非另有定義，本發(fā)明所使用的所有的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與屬于本發(fā)明的技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員通常理解的含義相同。本發(fā)明的說明書中所使用的術(shù)語只是為了描述具體的實(shí)施例的目的，不用于限制本發(fā)明。本發(fā)明所使用的術(shù)語“和/或”包括一個(gè)或多個(gè)相關(guān)的所列項(xiàng)目的任意的和所有的組合。

實(shí)施例1：厚藤金屬硫蛋白IpMT基因cDNA序列的RT-PCR擴(kuò)增

取采于惠州海灘(N22°41′24.81″，E114°44′48.02″)的幼嫩厚藤植物樣品為材料提取總RNA，按照Magen公司HiPure Plant RNA Kits(R4151)的操作說明書提取葉片總RNA。對(duì)提取的葉片總RNA進(jìn)行NanoDrop1000核酸蛋白檢測(cè)儀檢測(cè)濃度。

采用兩步法以總RNA為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)獲取cDNA第一鏈。cDNA單鏈的合成依照全式金公司TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix的說明書進(jìn)行。

以厚藤葉片的cDNA單鏈為模板，采用高保真DNA聚合酶Probest^TM DNA Polymerase擴(kuò)增厚藤金屬硫蛋白IpMT基因。所采用的引物為IpMTYEF(SEQ ID NO.3)和IpMTYER(SEQ ID NO.4)，PCR反應(yīng)體積為50μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為：10x PCR Buffer 5μL，10mM dNTP Mixture 4μL，10 μMIpMTYEF 1μL，10μM IpMTYER1μl，Probest^TM DNA Polymerase 0.5μL，cDNA模板2μL，ddH₂O36.5μL。各種成分混勻后置于PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min；94℃變性30s、56℃退火45s、72℃延伸30s，30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。

PCR產(chǎn)物通過1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，可獲得單一的DNA條帶(約220bp)，即為PCR擴(kuò)增得到的IpMT基因片段(見圖1所示)。IpMT片段依照Magen公司HiPure Gel Pure DNA Kits說明書進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳回收。

實(shí)施例2：厚藤金屬硫蛋白IpMT基因的酵母重組表達(dá)載體的構(gòu)建

釀酒酵母表達(dá)載體pYES2經(jīng)BamHI和XhoI雙酶切處理，回收線性化載體。回收后IpMT的PCR片段和線性化pYES2載體經(jīng)NanoDrop公司紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度，采用TaKaRa公司的HD Cloning Kit進(jìn)行DNA片段和載體的同源重組連接。按照說明書的方法將反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109(TaKaRa公司)感受態(tài)菌株。挑取單克隆，提取質(zhì)粒，經(jīng)測(cè)序鑒定為正確的陽性克隆后，保存質(zhì)粒備用。經(jīng)測(cè)序分析后，IpMT的cDNA閱讀框核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。構(gòu)建好的釀酒酵母重組表達(dá)載體IpMT-pYES2如圖2所示。

實(shí)施例3：厚藤金屬硫蛋白IpMT基因在釀酒酵母中的表達(dá)提高酵母對(duì)重金屬鎘的耐受性

培養(yǎng)釀酒酵母菌株WT和ycflΔ(購自歐洲酵母研究中心Euroscarf，http://web.uni-frankfurt.de/fb15/mikro/euroscarf/，菌株編號(hào)Y00000和Y04069)，用pYES2質(zhì)粒和重組質(zhì)粒IpMT-pYES2對(duì)上述酵母進(jìn)行轉(zhuǎn)化。由于IpMT基因是置于酵母半乳糖誘導(dǎo)的啟動(dòng)子pGAL1調(diào)控之下(見圖2所示)，將IpMT-pYES2轉(zhuǎn)化釀酒酵母并置于添加半乳糖的生長選擇合成培養(yǎng)基(Synthetic Dropout Medium plus Galactose，SDG medium)上生長，即可誘導(dǎo)IpMT在酵母中異源超量表達(dá)。

酵母轉(zhuǎn)化采用的方法為醋酸鋰轉(zhuǎn)化法，具體步驟如下：

1)接種待轉(zhuǎn)化的酵母菌株WT和ycflΔ的單菌落于5mLYPD液體培養(yǎng)基中，于30℃恒溫?fù)u床(200rpm)，培養(yǎng)過夜達(dá)到飽和。

2)按照1∶100比例轉(zhuǎn)移上述培養(yǎng)物到20mLYPD液體培養(yǎng)基中于30℃恒溫?fù)u床(200rpm)繼續(xù)培養(yǎng)，搖3-5h至菌液OD600值達(dá)0.4-0.6。

3)培養(yǎng)液在室溫條件下4000g離心5min，收集細(xì)胞。細(xì)胞用10mL無菌超純水重懸，再于室溫下5000-6000g離心5min，沉淀細(xì)胞。

4)細(xì)胞用2mL鋰鹽溶液重懸，鋰鹽溶液按照下表配制(現(xiàn)配現(xiàn)用)：

5)將2μL待轉(zhuǎn)化質(zhì)粒(約500ng/μL)和10μL變性鮭魚精DNA一起加入1.5mL離心管中混勻。

6)往每個(gè)離心管中加入200μL用鋰鹽溶液重懸的細(xì)胞懸液，再加入1mL新鮮配制的PEG溶液。PEG溶液的配方為：

30℃搖蕩溫育30min。

7)于42℃熱激15min，室溫下離心5s，細(xì)胞沉淀用200μL-1 mL 1×TE緩沖液(從10×儲(chǔ)液新鮮配制)重懸，并取其中200μL涂布在添加了2％半乳糖的SDG固體培養(yǎng)基平板上。30℃培養(yǎng)2-5天，直到出現(xiàn)轉(zhuǎn)化子。

本方法中所采用的液體YPD培養(yǎng)基的配方為：酵母浸出物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L；所采用的液體SDG培養(yǎng)基的配方為：未添加氨基酸的酵母氮源(YNB，BD Difco，USA)1.7g/L，硫酸銨5g/L，半乳糖20g/L，pH6.8，組氨酸20mg/L，亮氨酸60mg/L，甲硫氨酸20mg/L。相應(yīng)的固體培養(yǎng)基為液體培養(yǎng)基中添加20g/L的瓊脂粉，115℃，高溫高壓滅菌15分鐘。

挑取酵母菌株WT和ycflΔ轉(zhuǎn)化空載體pYES2和IpMT基因超表達(dá)載體IpMT-pYES2的單克隆，接種于2ml添加了半乳糖的SDG液體培養(yǎng)基中，30℃恒溫?fù)u床(200rpm)培養(yǎng)至菌液OD600值達(dá)2。按照1∶1、1∶10、1∶100、1∶1000將菌液進(jìn)行逐級(jí)稀釋，分別吸取2μl逐級(jí)稀釋的菌液滴至無添加和添加有0.1mM CdCl₂的SDG固體培養(yǎng)基平板上。30℃培養(yǎng)7天，觀察酵母生長情況。

如圖3所示，WT示釀酒酵母野生型菌株，ycflΔ示釀酒酵母對(duì)鎘敏感的突變體菌株，該菌株突變了一個(gè)鎘轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(yeast cadmium factorl)，體內(nèi)易富集鎘并產(chǎn)生毒性，在添加了0.1mM CdCl₂的培養(yǎng)基上不能生長，即該菌株對(duì)鎘敏感，耐受性較低。酵母菌株野生型WT作為對(duì)照，則可以在添加了0.1mM CdCl₂的培養(yǎng)基上正常生長。很顯然，超表達(dá)IpMT基因的轉(zhuǎn)基因酵母(轉(zhuǎn)化重組載體IpMT-pYES2)相比較于轉(zhuǎn)化空載體pYES2的ycflΔ酵母突變株而言，能夠在添加0.1mM CdCl₂的SDG固體培養(yǎng)基平板上生長，而未表達(dá)IpMT基因的酵母(轉(zhuǎn)化空載體pYES2)則不能生長，表明IpMT基因在酵母中的表達(dá)能夠降低鎘對(duì)酵母菌株ycflΔ的毒害，提高酵母突變體菌株ycflΔ對(duì)重金屬鎘的耐受性。

我們同樣檢測(cè)了IpMT基因能否提高野生型酵母菌株WT對(duì)重金屬鎘的耐受性。如圖4所示，超表達(dá)IpMT基因的轉(zhuǎn)基因酵母(轉(zhuǎn)化重組載體IpMT-pYES2)相比較于轉(zhuǎn)化空載體pYES2的野生型酵母菌株WT而言，能夠在添加0.2mM CdCl₂的SDG固體培養(yǎng)基平板上生長，而未表達(dá)IpMT基因的酵母(轉(zhuǎn)化空載體pYES2)則生長收到抑制，表明IpMT基因在野生型酵母菌株WT中的表達(dá)能夠降低鎘對(duì)酵母的毒害，提高野生型酵母菌株WT對(duì)重金屬鎘的耐受性。

此外，我們還檢測(cè)了厚藤金屬硫蛋白基因IpMT在發(fā)酵瓶中對(duì)于提高酵母對(duì)重金屬鎘的耐受性方面的應(yīng)用。將上述轉(zhuǎn)化空載體pYES2的酵母野生型菌株WT和轉(zhuǎn)化有厚藤金屬硫蛋白基因(IpMT-pYES2)的轉(zhuǎn)基因酵母菌株WT接種于2ml添加了半乳糖的SDG液體培養(yǎng)基中，30℃恒溫?fù)u床(200rpm)培養(yǎng)至菌液OD600值達(dá)0.5。此時(shí)，菌株的生長狀態(tài)一致，且處于生長分裂較旺盛的時(shí)期。按照1∶100的比例將各種菌株接種于添加了半乳糖的20ml的SD液體培養(yǎng)基的發(fā)酵瓶中，以添加了20μM的CdCl₂的發(fā)酵瓶為檢測(cè)對(duì)象，而未添加CdCl₂的發(fā)酵瓶作為對(duì)照。將發(fā)酵瓶置于30℃恒溫?fù)u床(200rpm)培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)后的0小時(shí)、2小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)、60小時(shí)和72小時(shí)取菌液測(cè)定其OD600的值，作為酵母菌的生長指標(biāo)。如圖5所示，在未添加CdCl₂的發(fā)酵瓶中，2個(gè)待檢的酵母株系均有一致的生長狀態(tài)，且生長良好；而在添加了20μM的CdCl₂的發(fā)酵瓶中，作為對(duì)照的轉(zhuǎn)化有空載體pYES2的野生型酵母菌株WT生長受到一定的抑制，而轉(zhuǎn)化了厚藤金屬硫蛋白基因IpMT的酵母菌株(IpMT-pYES2)則可以正常生長(如圖6所示)，表明厚藤金屬硫蛋白基因IpMT能夠提高工程菌株酵母對(duì)重金屬鎘的耐受性。

實(shí)施例4：厚藤金屬硫蛋白IpMT基因在釀酒酵母中的表達(dá)提高酵母體內(nèi)鎘的積累

培養(yǎng)釀酒酵母菌株野生型WT和ycflΔ(購自歐洲酵母研究中心Euroscarf，http://web.uni-frankfurt.de/fb15/mikro/euroscarf/，菌株編號(hào)Y00000和Y04069)，采用實(shí)施例3的方法轉(zhuǎn)化酵母表達(dá)載體空載體pYES2和IpMT基因超表達(dá)載體IpMT-pYES2。在超凈臺(tái)中用無菌牙簽挑取四種酵母轉(zhuǎn)化子(酵母菌株野生型WT和ycflΔ分別轉(zhuǎn)化pYES2和IpMT-pYES2)到10mL添加了半乳糖的SDG液體培養(yǎng)基中，30℃恒溫?fù)u床(200rpm)培養(yǎng)至菌液OD600值達(dá)到2左右。之后將兩種酵母按照1∶500的體積比接種于600ml添加了2％半乳糖的SDG液體培養(yǎng)基中，30℃搖床(200-250rpm)培養(yǎng)約12小時(shí)至OD600值達(dá)2，之后分別添加CdCl₂至終濃度10μM。繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后離心收集菌體。采用雙蒸水清洗菌體3遍后，將菌體65℃干燥3-5天，干燥的酵母塊進(jìn)行微波消解后，采用火焰法原子吸收光譜測(cè)定酵母細(xì)胞中鎘的積累。

在本發(fā)明中，轉(zhuǎn)化IpMT-pYES2的兩種酵母菌株(WT和ycf1Δ)在添加有10μM的CdCl₂的培養(yǎng)基中，體內(nèi)積累的鎘均明顯高于轉(zhuǎn)化pYES2空載體的酵母菌株(見圖7所示)，這表明IpMT基因在酵母細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)提高了酵母對(duì)重金屬鎘的富集，可通過蛋白質(zhì)螯合等方式促進(jìn)了酵母體內(nèi)鎘的解毒。

實(shí)施例5：厚藤金屬硫蛋白IpMT基因在厚藤體內(nèi)受重金屬Cd誘導(dǎo)表達(dá)的檢測(cè)

本發(fā)明中所用的厚藤材料為本實(shí)驗(yàn)室萌發(fā)的厚藤小苗，種子采集于惠州海灘(N22°41′24.81″，E114°44′48.02″)。取100粒左右的飽滿厚藤種子，采用40％硫酸浸泡12小時(shí)，之后用自來水清洗20遍，采用蛭石萌發(fā)厚藤種子(22℃，每天16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗)，約一個(gè)月后長成小苗，將厚藤幼苗轉(zhuǎn)移1/2MS液體培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)3天。然后用含有CdCl₂(50μM)的1/2MS液體培養(yǎng)基處理厚藤幼苗，收集脅迫處理0h、2小時(shí)、24小時(shí)和48小時(shí)后的厚藤幼葉和幼根各0.5g，用于提取總RNA。RNA的提取依照Magen公司HiPure Plant RNA Kits(R4151)的說明書進(jìn)行。采用兩步法以總RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄cDNA。cDNA鏈的合成依照全式金公司TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix的說明書進(jìn)行。

通過克隆獲得的IpMT基因的cDNA序列及網(wǎng)站NCBI(http://www.dtd.nlm.nih.gov/)在線設(shè)計(jì)real-time RT-PCR引物。用于檢測(cè)IpMT基因表達(dá)模式的引物為IpMTYEF(SEQ ID NO.3)和IpMTYER(SEQ ID NO.4)。內(nèi)參基因?yàn)楹裉偌?dòng)蛋白基因IpActin，引物為IpACTRTF：5’-TGGCGCTGAGAGATTTCGTT-3’(SEQ ID NO.5)和IpACTRTR：5’-GCTCATGCGATCGGCAATAC-3’(SEQ ID NO.6)。參考BIO-RAD公司iTaq^TM Universal SYBR Green Supermix的說明書配制real time RT-PCR反應(yīng)體系(冰上操作)。采用兩步法PCR反應(yīng)，擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)程序如下：

所有檢測(cè)均采用兩個(gè)生物學(xué)樣本重復(fù)，每個(gè)生物學(xué)樣本進(jìn)行三次重復(fù)檢測(cè)反應(yīng)。引物第一次使用時(shí)添加程序Stage3檢測(cè)溶解曲線，確認(rèn)引物的特異性。

如圖8所示，在鎘脅迫處理下，無論在厚藤幼苗的根或者葉中，IpMT基因的表達(dá)都受到鎘的強(qiáng)烈誘導(dǎo)，其最大誘導(dǎo)量可達(dá)到7倍。以上公開的內(nèi)容表明了IpMT基因是一個(gè)重金屬鎘脅迫應(yīng)答基因，該基因具備應(yīng)用于針對(duì)重金屬鎘脅迫和富集的植物遺傳工程改良的潛力。

以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對(duì)本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。

SEQUENCE LISTING

<110> 中國科學(xué)院華南植物園

<120> 一種厚藤金屬硫蛋白IpMT及其編碼基因的應(yīng)用

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 66

<212> PRT

<213> IpMT protein

<400> 1

Met Ser Ser Gly Cys Lys Cys Gly Ala Asp Cys Lys Cys Gly Ser Asp

1 5 10 15

Cys Gly Cys Glu Glu Val Thr Thr Thr Val Thr Ile Ile Glu Gly Val

20 25 30

Ala Pro Val Lys Leu Thr Leu Glu Gly Ser Ser Glu Lys Ala Thr Glu

35 40 45

Gly Gly His Ala Cys Lys Cys Gly Ser Asn Cys Thr Cys Asp Pro Cys

50 55 60

Asn Cys

65

<210> 2

<211> 201

<212> DNA

<213> IpMT cDNA閱讀框

<400> 2

atgtcttccg gttgcaagtg tggcgccgac tgcaagtgcg gcagtgactg tggatgtgaa 60

gaggtgacca ccaccgtcac catcatcgag ggggttgcac cagtgaagtt gaccttagag 120

gggtcttctg agaaggctac agagggagga catgcctgca agtgtggatc aaactgcacc 180

tgtgaccctt gcaactgtta g 201

<210> 3

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

taccgagctc ggatccatgt cttccggttg caagtg 36

<210> 4

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tagatgcatg ctcgagctaa cagttgcaag ggtcac 36

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tggcgctgag agatttcgtt 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gctcatgcga tcggcaatac 20