本發(fā)明涉及一種用于檢測(cè)肼的新型熒光探針及其應(yīng)用，屬于分析化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

肼(hydrazine)是一種無色易揮發(fā)的液體，在水溶液中亦稱作水合肼，具有強(qiáng)堿性。水合肼是一種重要的化工原料和中間體，它能夠合成發(fā)泡劑，供熱系統(tǒng)中的除氧劑；水合肼還是藥物合成重要的原料，常備用來制備農(nóng)藥，抗癌藥和降壓藥；肼還在紡織染料，攝影化學(xué)中右重要的作用；肼易燃易爆，也被用來作為火箭推進(jìn)劑和染料。雖然肼有很多應(yīng)用價(jià)值，但是肼也是具有一定的毒性，所以在肼的生產(chǎn)、運(yùn)輸、應(yīng)用和后處理中不恰當(dāng)?shù)氖褂煤筒僮鞫紩?huì)帶來肼的泄漏，從而對(duì)環(huán)境帶來一定的污染。肼的水溶性較好，人體很容易通過水環(huán)境吸收肼，長(zhǎng)時(shí)間的累積可能會(huì)對(duì)人體的多種器官如肝、腎和肺帶來危害。除此之外，肼還具有致癌性。綜上所述，測(cè)定環(huán)境和生物體內(nèi)肼的含量具有十分重要的意義。

相比于傳統(tǒng)的測(cè)定肼的氣相色譜法和化學(xué)滴定法，熒光成像分析法具有靈敏度高、選擇性好、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，并且在生物樣本檢測(cè)中不會(huì)對(duì)樣品帶來?yè)p傷，已廣泛用于各種生物體內(nèi)的小分子檢測(cè)。因此開發(fā)新的具有高靈敏度、高選擇性、光穩(wěn)定性，能夠?qū)崟r(shí)快速檢測(cè)肼的熒光探針具有重要的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明要解決的問題是提供一種新型檢測(cè)肼的熒光探針及其應(yīng)用。

一種用于檢測(cè)肼的新型熒光探針，其化學(xué)結(jié)構(gòu)通式如式（）所示：

式（）

本發(fā)明的熒光探針，在肼存在的環(huán)境下，其乙酰酯基水解為羥基，生成具有高熒光發(fā)射能力的熒光物質(zhì)；也就是說本發(fā)明的熒光探針的乙酰酯基部分為肼的響應(yīng)位點(diǎn)；所生成的熒光物質(zhì)發(fā)射羅丹明衍生物染料的紅色熒光（峰值約為630nm）。另外，本發(fā)明的熒光探針只對(duì)肼有響應(yīng)，而對(duì)hcys、na2s、na2so3、no、h2o2、hclo4、gsh、nano2、vc等小分子沒有響應(yīng)。所以，本發(fā)明的熒光探針是對(duì)肼的特異性探針，基本不受其他小分子的干擾。通過熒光檢測(cè)器檢測(cè)加入本發(fā)明的熒光探針之后環(huán)境和細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，從而確定確定肼在環(huán)境和細(xì)胞中的含量，從而實(shí)現(xiàn)肼的快速靈敏檢測(cè)。因此，本發(fā)明的熒光探針能應(yīng)用于環(huán)境和細(xì)胞內(nèi)肼的檢測(cè)評(píng)價(jià)。

本發(fā)明的熒光探針在應(yīng)用于環(huán)境和細(xì)胞內(nèi)肼的檢測(cè)評(píng)價(jià)時(shí)的檢測(cè)條件為：激發(fā)波長(zhǎng)為560nm，在590~700nm之間進(jìn)行熒光發(fā)射光譜的檢測(cè)。

本發(fā)明的熒光探針應(yīng)用于環(huán)境內(nèi)肼的檢測(cè)評(píng)價(jià)時(shí)的具體測(cè)定方法為：將待測(cè)樣品加入到的熒光探針的乙醇水溶液中，測(cè)定溶液的熒光強(qiáng)度作為是否含有肼及肼濃度的評(píng)價(jià)指標(biāo)。

本發(fā)明采用mtt比色法，通過分析活細(xì)胞在加入熒光探針之后的存活率，討論熒光探針對(duì)細(xì)胞的毒性；然后進(jìn)一步研究通過研究加入熒光探針后活細(xì)胞的熒光成像。實(shí)驗(yàn)證明本發(fā)明的熒光探針對(duì)活細(xì)胞沒有毒性、且熒光成像清晰可以對(duì)活細(xì)胞內(nèi)的肼進(jìn)行快速檢測(cè)。

將本發(fā)明所述熒光探針的乙醇水溶液注入細(xì)胞的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，然后用pbs(磷酸鹽緩沖溶液)沖洗培養(yǎng)細(xì)胞，再進(jìn)行熒光成像；根據(jù)熒光成像結(jié)果判斷是否含有肼。

本發(fā)明的熒光探針的制備方法：

式（ⅱ）化合物、乙酸酐用有機(jī)溶劑溶解后，在三乙胺存在的條件下進(jìn)行反應(yīng)，然后將所得固體進(jìn)行柱層析純化得到棕紅色的產(chǎn)物，即可；層析純化所用洗脫液v(dcm)：v(meoh)=50:1；

式（ⅱ）

上述制備方法，優(yōu)選的，所用溶劑為二氯甲烷。

上述制備方法，優(yōu)選的，式（ⅱ）化合物、酸酐、三乙胺和二氯甲烷的用量比為1mmol：2mmol：2.2mmol：5ml；反應(yīng)時(shí)間為4小時(shí)。

上述制備方法，所述式（ⅱ）化合物的制備方法：4-二乙氨基酮酸和1-6萘酚以濃硫酸為溶劑，于90℃回流；然后將反應(yīng)液冷卻至-5~0℃，加入高氯酸使其析出沉淀，抽濾、烘干及過層析柱純化，純化所用洗脫液v(dcm)：v(meoh)=10:1。

式（ⅱ）合成路線：

。

本發(fā)明中，μm是指μmol/l；mm是指mmol/l；dcm即為二氯甲烷，meoh即為甲醇。

本發(fā)明的有益效果為：

本發(fā)明所述的檢測(cè)肼的熒光探針可經(jīng)化學(xué)合成獲得，合成工藝簡(jiǎn)單易行，原料廉價(jià)易得，制備成本低，易于推廣。

本發(fā)明所述的檢測(cè)細(xì)肼的熒光探針具有高特異性，在進(jìn)行相應(yīng)肼檢測(cè)過程中基本不受其他組分的干擾，可用于環(huán)境和活細(xì)胞內(nèi)肼的實(shí)時(shí)測(cè)定，具有廣闊的應(yīng)用前景。

本發(fā)明所述的檢測(cè)肼的熒光探針靈敏度高，具有良好的熒光發(fā)射光譜特性（590~700nm），可以實(shí)現(xiàn)對(duì)環(huán)境和活細(xì)胞中的肼快速準(zhǔn)確檢測(cè)的目的。

附圖說明

圖1是本發(fā)明熒光探針的¹hnmr圖譜；

圖2是本發(fā)明熒光探針在不同濃度肼條件下的熒光光譜；

圖3是本發(fā)明熒光探針與不同物質(zhì)反應(yīng)后的熒光光譜；

圖4是本發(fā)明熒光探針在活細(xì)胞中的成像應(yīng)用；

圖2中，從下向上肼的濃度依次為：0μm-5μm-10μm-15μm-20μm-25μm-30μm-35μm-40μm-45μm-50μm-55μm-60μm-65μm-70μm-75μm-80μm-85μm-90μm-95μm-100μm-105μm-110μm-115μm-120μm-125μm-130μm-135μm-140μm-145μm-150μm；

圖4中，a圖：只加10μm探針的細(xì)胞明場(chǎng)照片；b圖：只加10μm探針的細(xì)胞紅色通道熒光照片；c圖：a圖和b圖的疊加照片；d圖：加入10μm探針和100μm肼的細(xì)胞明場(chǎng)照片；e圖：加入10μm探針和100μm肼的細(xì)胞紅色通道熒光照片；f圖：d圖和e圖的疊加照片。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明，但本發(fā)明保護(hù)內(nèi)容不僅限于此。

實(shí)施例1：本發(fā)明所述檢測(cè)癌細(xì)胞內(nèi)肼的熒光探針的制備

取50ml圓底燒瓶將313mg、1mmol的4-二乙氨基酮酸（化合物1，cas:5809-23-4,)及160mg、1mmol的1-6萘酚（化合物2，cas:59335-81-8,）加入到瓶中，加入4ml濃硫酸做溶劑，于90℃回流6h。等待反應(yīng)液冷卻至室溫，將燒瓶放入低溫環(huán)境（-5~0℃）緩慢滴加高氯酸使其析出沉淀，抽濾、烘干及過柱子純化，洗脫液極性（v(dcm)：v(meoh)=10:1）得到紅色固體產(chǎn)品即為式（ⅱ）化合物，產(chǎn)率58%。

將式（ⅱ）所示的化合物(1mmol)、乙酸酐（2mmol）、三乙胺（2.2mmol）和二氯甲烷(5ml)加入到50ml的單口燒瓶中，室溫?cái)嚢?小時(shí)，旋干。將所得固體進(jìn)行柱層析純化(v(dcm)：v(meoh)=50:1)，得到棕紅色的產(chǎn)物即為本發(fā)明所述檢測(cè)肼的熒光探針，產(chǎn)率54%；其¹hnmr圖譜見圖1。

實(shí)施例2：本發(fā)明所述熒光探針在不同肼濃度下的熒光光譜

本專利采用肼溶解在水溶液中供應(yīng)肼。預(yù)先準(zhǔn)備30份5ml的5μm的探針緩沖溶液（乙醇的體積含量為5%）；分別加入肼使得探針緩沖溶液中肼依次為0μm、5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm、50μm、55μm、60μm、65μm、70μm、75μm、80μm、85μm、90μm、95μm、100μm、105μm、110μm、115μm、120μm、125μm、130μm、135μm、140μm、145μm、150μm。然后進(jìn)行熒光檢測(cè)（ex=560nm）；計(jì)算各體系中熒光強(qiáng)度；通過分析630nm處的熒光強(qiáng)度與肼濃度的關(guān)系，評(píng)估該探針對(duì)肼的響應(yīng)性能（見圖2）。圖2表明，隨著肼濃度的增大，溶液的熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)。

實(shí)施例3：熒光探針與不同物質(zhì)反應(yīng)后的熒光光譜

預(yù)先準(zhǔn)備10份5ml的5μm的探針緩沖溶液(含5%乙醇，ph=7.4)，然后分別向該體系中依次加入50μl濃度為200μm的肼、hcys、na2s、na2so3、no、h2o2、hclo4、cys、gsh、nano2、vc等小分子的pbs溶液。然后進(jìn)行熒光檢測(cè)（λex=580nm）；計(jì)算各體系中熒光強(qiáng)度；評(píng)估該不同物質(zhì)對(duì)熒光探針溶液的干擾性（見圖3）。從圖中看出，只有當(dāng)探針溶液中加入肼時(shí)，能夠使溶液產(chǎn)生顯著的熒光；而當(dāng)探針溶液中加入hcys、na2s、na2so3、no、h2o2、hclo4、gsh、nano2、vc等小分子時(shí)，溶液熒光基本沒有變化；這表示該探針只對(duì)肼有響應(yīng)，而基本不受其他小分子的干擾。

實(shí)施例4：熒光探針在活細(xì)胞中的成像應(yīng)用

將癌細(xì)胞hela細(xì)胞放在培養(yǎng)基(培養(yǎng)基中dmem培養(yǎng)液和胎牛血清的體積比為9:1)中，放置于條件為37℃、5%（體積分?jǐn)?shù)）co2和20%（體積分?jǐn)?shù)）o2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-48h。加入本發(fā)明所述熒光探針的乙醇溶液(熒光探針濃度為5μm，含5%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇，ph=7.4)，注入含有hela細(xì)胞的培養(yǎng)基中，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30min，pbs(磷酸鹽緩沖溶液)沖洗培養(yǎng)細(xì)胞3次。加入肼，使得培養(yǎng)基中肼的濃度為25μm，繼續(xù)培養(yǎng)30min。之后用pbs沖洗培養(yǎng)細(xì)胞3次，進(jìn)行熒光成像。

結(jié)果見圖4：從a、b和c圖中看出，只加入探針時(shí)，細(xì)胞無紅色熒光；從d、e和f圖中看出，加入探針之后，再加入100μ肼，細(xì)胞有明顯的紅色熒光產(chǎn)生，這表示該探針可用于檢測(cè)癌細(xì)胞中的肼。