本發(fā)明屬于n-聚糖合成，具體涉及一種全合成n-聚糖的方法。

背景技術(shù)：

1、蛋白質(zhì)n-糖基化是指n-乙酰葡萄糖胺(glcnac)通過βn-鍵連接到天冬酰胺(asn)側(cè)鏈的氮原子上，是最常見的蛋白質(zhì)翻譯后修飾之一。n-糖基化存在于大多數(shù)生物體中，n-糖結(jié)構(gòu)在進(jìn)化中高度保守。所有天然存在的n-糖都含有保守結(jié)構(gòu)，稱為核心五糖，在此結(jié)構(gòu)上可以添加或去除不同數(shù)量的單糖，從而在活細(xì)胞中產(chǎn)生極其多樣化的n-糖結(jié)構(gòu)。

2、n-聚糖與蛋白質(zhì)的附著會(huì)影響糖蛋白的許多特性，從而調(diào)節(jié)許多生理過程，例如蛋白質(zhì)折疊、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸、亞細(xì)胞定位和配體-受體相互作用。眾所周知，異常的n-糖基化，包括位點(diǎn)占用率和聚糖結(jié)構(gòu)異常，與癌癥和許多其他疾病有很強(qiáng)的關(guān)系。因此，結(jié)構(gòu)明確的n-糖在基礎(chǔ)研究和藥物化學(xué)中具有巨大的應(yīng)用潛力。例如，核心巖藻糖基化n-糖是被fda批準(zhǔn)用于早期檢測肝細(xì)胞癌(hcc)的生物標(biāo)志物。

3、從天然來源提取一直是獲取結(jié)構(gòu)明確的n-聚糖的主要方法。然而，n-聚糖作為難以分離的混合物以低豐度在自然界存在。近年來，化學(xué)酶法已成為獲取結(jié)構(gòu)確定的n-聚糖的流行策略。該策略依賴于短n-糖前體的化學(xué)合成和隨后的酶擴(kuò)展來獲得復(fù)雜的n-糖。由于結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，需要數(shù)十到一百多個(gè)步驟來制備高級中間體，例如核心五糖和七糖，以實(shí)現(xiàn)酶的多樣化。只有高度專業(yè)化的實(shí)驗(yàn)室才能進(jìn)行如此高要求的合成?；蛘?，酶促降解從蛋黃中提取的唾液酰糖肽(sgp)也可以產(chǎn)生用于酶促延伸的n-糖核心前體。然而，sgp在蛋黃中以低豐度(僅約0.3％(w/w))作為混合物存在，sgp提取過程需要消耗大量的有機(jī)溶劑，并且操作相當(dāng)耗時(shí)和勞動(dòng)密集型。因此，難以獲得足夠數(shù)量的構(gòu)建塊或n-糖核前體來大量構(gòu)建許多n-糖結(jié)構(gòu)，一直是糖化學(xué)的障礙。

4、在活細(xì)胞中，n-聚糖的從頭生物合成是從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜胞質(zhì)側(cè)的多力酚磷酸開始，天冬酰胺連接的糖基轉(zhuǎn)移酶(alg)家族負(fù)責(zé)前幾個(gè)步驟。alg7和alg13/14催化向磷酸多力酚中添加兩個(gè)glcnac殘基，從而產(chǎn)生glcnac?β1，4glcnac-pp-多力醇(gn2-pp-dol)。隨后，alg1和alg2添加三個(gè)甘露糖殘基，使用gdp-d-man作為供體產(chǎn)生man3gn2-pp-dol。alg2是一種雙功能酶，負(fù)責(zé)將α-1，3-和α-1，6-連接的甘露糖添加到alg1(man1gn2-pp-dol)的產(chǎn)物上以形成man3gn2-pp-dol。然后，八種alg酶催化glc3man9gn2-pp-dol的形成，這是蛋白質(zhì)糖基化步驟之前的常見前體。組裝后，glc3man9gn2寡糖通過寡糖轉(zhuǎn)移酶(ost)的βn-連接轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)的asn殘基。在此結(jié)構(gòu)上進(jìn)一步去除或添加幾個(gè)糖殘基會(huì)在活細(xì)胞中形成極其復(fù)雜的n-糖結(jié)構(gòu)。

5、盡管n-聚糖的生物合成途徑已經(jīng)闡明多年，但人們普遍認(rèn)為，完全遵循天然生物合成途徑酶法制備n-聚糖是不切實(shí)際的。有三個(gè)主要挑戰(zhàn)：首先，參與n-聚糖生物合成的酶難以制備；其次，由于結(jié)構(gòu)復(fù)雜，天然多力醇難以合成，人類中主要的多力醇是dol-19(c95脂質(zhì))，具有高度疏水性，不適合用于酶促合成；第三，糖基化供體(糖核苷酸和多力酚磷酸甘露糖)難以大規(guī)模制備。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、基于上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，發(fā)明人開發(fā)了一種化學(xué)酶促全合成n-聚糖的方法，該方法從常見的起始材料高效組裝，只需幾個(gè)簡單的化學(xué)反應(yīng)和酶促反應(yīng)步驟，合成n-糖核心五糖和核心七糖(多克級)；接下來，核心五糖和核心七糖通過糖基轉(zhuǎn)移酶延伸，產(chǎn)生多種對稱和不對稱的n-聚糖。特別是，本發(fā)明提供了一種可逆酶促半乳糖基化作為合成不對稱n-聚糖的保護(hù)策略，成功制備了49個(gè)復(fù)合型不對稱n-聚糖。本發(fā)明所述方法可以大規(guī)模、高效地制備n-聚糖，而且無需繁瑣的純化操作，具有成本低廉、適應(yīng)性強(qiáng)的特點(diǎn)。

2、鑒于此，第一個(gè)方面，本發(fā)明提供式(i)所示核心五糖或式(ii)所示核心七糖的合成方法，

3、

4、式(i)或式(ii)中，

5、表示d-吡喃甘露糖，

6、表示n-乙酰氨基葡萄糖，

7、β4表示一個(gè)糖半縮醛羥基與另一個(gè)糖4位碳上的羥基通過β構(gòu)型的糖苷鍵相連，

8、β2表示一個(gè)糖半縮醛羥基與另一個(gè)糖2位碳上的羥基通過β構(gòu)型的糖苷鍵相連，

9、α3表示一個(gè)糖半縮醛羥基與另一個(gè)糖3位碳上的羥基通過α構(gòu)型的糖苷鍵相連，

10、α6表示一個(gè)糖半縮醛羥基與另一個(gè)糖6位碳上的羥基通過α構(gòu)型的糖苷鍵相連；

11、所述合成方法包括以下步驟：

12、s5：化合物5與化合物c反應(yīng)得到化合物6，其反應(yīng)式如下所示：

13、

14、式中，r選自c6～c95直鏈或支鏈烷基，優(yōu)選為c6～c50直鏈或支鏈烷基，更優(yōu)選為c6～c20直鏈或支鏈烷基，進(jìn)一步優(yōu)選地，r選自：更進(jìn)一步優(yōu)選地，r為

15、s6：化合物6脫乙酰得到化合物7，其反應(yīng)式如下所示：

16、

17、式中，r如步驟s5中所定義；

18、s7：化合物7和鳥苷二磷酸甘露糖(gdp-man)在殼二糖基二磷酸多酚β-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶(alg1)或在alg1的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有alg1活性的由alg1衍生的蛋白質(zhì)的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)榛衔?，其反應(yīng)式如下所示：

19、

20、式中，r如步驟s5中所定義；

21、s8：在α-1，3/1，6-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶(alg2)或在alg2的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有alg2活性的由alg2衍生的蛋白質(zhì)的作用下，化合物8和鳥苷二磷酸甘露糖(gdp-man)轉(zhuǎn)變?yōu)榛衔?，其反應(yīng)式如下所示：

22、

23、式中，r如步驟s5中所定義；

24、s9：化合物9脫去脂質(zhì)尾部得到式(i)所示的核心五糖，其反應(yīng)式如下所示：

25、

26、s10：在α-1，3-甘露糖糖蛋白2-β-n-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶(mgat1)或在mgat1的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有mgat1活性的由mgat1衍生的蛋白質(zhì)的作用下，式(i)所示的核心五糖和尿苷二磷酸n-乙酰氨基葡萄糖(udp-glcnac)轉(zhuǎn)變?yōu)榛衔?8，其反應(yīng)式如下所示：

27、

28、s11：在α-1，6-甘露糖糖蛋白2-β-n-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶(mgat2)或在mgat2的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有mgat2活性的由mgat2衍生的蛋白質(zhì)的作用下，化合物28和尿苷二磷酸n-乙酰氨基葡萄糖(udp-glcnac)轉(zhuǎn)變?yōu)槭?ii)所示的核心七糖，其反應(yīng)式如下所示：

29、

30、在具體的實(shí)施方式中，化合物5可以通過以下方法制備：

31、s1：化合物1與乙酸酐發(fā)生反應(yīng)生成化合物2，其反應(yīng)式如下所示：

32、

33、s2：化合物2選擇性脫除1位乙?；玫交衔?，其反應(yīng)式如下所示：

34、

35、s3：化合物3先與4，5-二氰基咪唑、二芐基n，n′-二異丙基亞磷酰胺反應(yīng)，后與過氧叔丁醇反應(yīng)得到化合物4，其反應(yīng)式如下所示：

36、

37、s4：化合物4還原得到化合物5，其反應(yīng)式如下所示：

38、

39、步驟s1

40、在一些實(shí)施方式中，反應(yīng)在溶劑1中進(jìn)行，例如，所述溶劑1可以為吡啶；

41、在一些實(shí)施方式中，化合物1與乙酸酐的摩爾比可以為14.5～15.5∶1；

42、在一些實(shí)施方式中，所述反應(yīng)在20～30℃、攪拌條件下進(jìn)行；優(yōu)選地，反應(yīng)終點(diǎn)可以通過薄層層析色譜監(jiān)測；

43、在一些實(shí)施方式中，反應(yīng)完成后，還包括分離純化步驟：將反應(yīng)液中溶劑去除，加入二氯甲烷溶解，經(jīng)洗滌后，收集二氯甲烷相，干燥、濃縮即得到化合物2；優(yōu)選地，洗滌可以為依次經(jīng)1m鹽酸溶液、飽和碳酸氫鈉溶液和飽和氯化鈉溶液洗滌；優(yōu)選地，干燥為使用無水硫酸鈉干燥。

44、步驟s2

45、在一些實(shí)施方式中，反應(yīng)在溶劑2中進(jìn)行，例如，所述溶劑2可以為四氫呋喃；

46、在一些實(shí)施方式中，反應(yīng)在甲醇氨作用下進(jìn)行，例如，甲醇氨中，氨的濃度為6～8mol/l，例如，甲醇氨與溶劑2的體積比為1∶2～4；

47、在一些實(shí)施方式中，反應(yīng)在20～30℃、攪拌條件下進(jìn)行；優(yōu)選地，反應(yīng)終點(diǎn)可以通過薄層層析色譜監(jiān)測；

48、在一些實(shí)施方式中，反應(yīng)完成后，還包括分離純化步驟：在反應(yīng)液中加入二氯甲烷稀釋，洗滌后收集有機(jī)相，經(jīng)干燥、濃縮、柱層析純化后即得到化合物2；優(yōu)選地，洗滌可以為依次經(jīng)1m鹽酸溶液、飽和碳酸氫鈉溶液和飽和氯化鈉溶液洗滌；優(yōu)選地，干燥為使用無水硫酸鈉干燥；優(yōu)選地，柱層析的層析液為二氯甲烷/甲醇＝95∶5，v/v。

49、步驟s3

50、在一些實(shí)施方式中，反應(yīng)在溶劑3中進(jìn)行，例如，所述溶劑3可以為乙腈；

51、在一些實(shí)施方式中，化合物3與4，5-二氰基咪唑的摩爾比為1∶2.5～3.5；化合物3與二芐基n，n′-二異丙基亞磷酰胺的摩爾比為1∶1.5～2.5；化合物3與過氧叔丁醇的摩爾比為1∶3.5～4.5；

52、在一些實(shí)施方式中，化合物3與4，5-二氰基咪唑、二芐基n，n′-二異丙基亞磷酰胺反應(yīng)，以及與過氧叔丁醇的反應(yīng)，均在20～30℃、攪拌條件下進(jìn)行；優(yōu)選地，過氧叔丁醇以癸烷溶液的形式加入反應(yīng)體系；優(yōu)選地，反應(yīng)終點(diǎn)通過薄層層析色譜監(jiān)測；

53、在一些實(shí)施方式中，反應(yīng)完成后，還包括分離純化步驟：反應(yīng)液經(jīng)硅藻土過濾后濃縮，加入二氯甲烷稀釋，經(jīng)洗滌后收集有機(jī)相，經(jīng)干燥、濃縮、柱層析純化后即得到化合物4；優(yōu)選地，洗滌可以為依次經(jīng)1m鹽酸溶液、飽和碳酸氫鈉溶液和飽和氯化鈉溶液洗滌；優(yōu)選地，干燥為使用無水硫酸鈉干燥；優(yōu)選地，柱層析的層析液為二氯甲烷/甲醇＝95∶5，v/v。

54、步驟s4

55、在一些實(shí)施方式中，反應(yīng)在溶劑4中進(jìn)行，例如，所述溶劑4可以為甲醇；

56、在一些實(shí)施方式中，反應(yīng)在鈀碳存在下用氫氣進(jìn)行還原，例如化合物4與鈀碳的質(zhì)量比為1∶0.05～0.15；

57、在一些實(shí)施方式中，反應(yīng)在20～30℃、攪拌條件下進(jìn)行；優(yōu)選地，反應(yīng)終點(diǎn)通過薄層層析色譜監(jiān)測；

58、在一些實(shí)施方式中，反應(yīng)完成后，還包括分離純化步驟：反應(yīng)液經(jīng)硅藻土過濾后濃縮，即得化合物5。

59、步驟s5

60、在一些實(shí)施方式中，首先將化合物5溶于溶劑5，例如，所述溶劑5為甲醇，然后加入三乙胺轉(zhuǎn)變?yōu)槿一@鹽；將三乙基銨鹽在溶劑6中用n，n-碳酰二咪唑活化磷酸基團(tuán)后，再與化合物c反應(yīng)，例如，溶劑6可以為n，n-二甲基甲酰胺。

61、在一些實(shí)施方式中，化合物5與三乙胺的用量比為1.0g∶0.5～1.5ml；化合物5與n，n-碳酰二咪唑的摩爾比為1∶5～6；化合物5與化合物c的用量比為1∶1.0～1.5；

62、在一些實(shí)施方式中，通過濃縮轉(zhuǎn)變?yōu)槿一@鹽，然后與甲苯共蒸發(fā)去除多余的三乙胺，優(yōu)選地，與甲苯共蒸發(fā)3次；

63、在一些實(shí)施方式中，n，n-碳酰二咪唑活化磷酸基團(tuán)的反應(yīng)條件為室溫下活化3～6h；優(yōu)選地，活化反應(yīng)完成后，加入甲醇淬滅未反應(yīng)的n，n-碳酰二咪唑；

64、在一些實(shí)施方式中，化合物c溶于溶劑7，以溶液的方式加入前述反應(yīng)體系中；優(yōu)選地，溶劑7為二氯甲烷；在一些實(shí)施方式中，與化合物c反應(yīng)的條件為20～30℃、攪拌反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間為2～4天；

65、在一些實(shí)施方式中，反應(yīng)完成后，還包括分離純化步驟：將反應(yīng)液濃縮，并通過柱層析純化，即得到化合物6；優(yōu)選地，柱層析的層析液為乙酸乙酯∶甲醇∶水＝70∶30∶0.3。

66、在一些實(shí)施方式中，化合物c可以按照如下方法制備：

67、(a)化合物a先與4，5-二氰基咪唑、二芐基n，n′-二異丙基亞磷酰胺反應(yīng)，后與過氧叔丁醇反應(yīng)得到磷酸化的化合物b；

68、(b)化合物b被氫氣還原得到化合物c；

69、其反應(yīng)式如下所示：

70、

71、其中，r如步驟s5中所定義；

72、步驟(a)中

73、在一些實(shí)施方式中，化合物a在溶劑3中反應(yīng)，例如，所述溶劑3為乙腈；

74、在一些實(shí)施方式中，化合物a與4，5-二氰基咪唑的摩爾比為1∶2.5～3.5；化合物a與二芐基n，n′-二異丙基亞磷酰胺的摩爾比為1∶1.5～2.5；化合物a與過氧叔丁醇的摩爾比為1∶3.5～4.5；

75、在一些實(shí)施方式中，化合物a與4，5-二氰基咪唑、二芐基n，n′-二異丙基亞磷酰胺反應(yīng)，以及與過氧叔丁醇的反應(yīng)，均在20～30℃、攪拌條件下進(jìn)行；優(yōu)選地，過氧叔丁醇以癸烷溶液的形式加入反應(yīng)體系；優(yōu)選地，反應(yīng)終點(diǎn)通過薄層層析色譜監(jiān)測；

76、在一些實(shí)施方式中，反應(yīng)完成后，還包括分離純化步驟：反應(yīng)液經(jīng)硅藻土過濾后濃縮，加入二氯甲烷稀釋，經(jīng)洗滌后收集有機(jī)相，經(jīng)干燥、濃縮、柱層析純化后即得到化合物b；優(yōu)選地，洗滌可以為依次經(jīng)1m鹽酸溶液、飽和碳酸氫鈉溶液和飽和氯化鈉溶液洗滌；優(yōu)選地，干燥為使用無水硫酸鈉干燥；優(yōu)選地，柱層析的層析液為二氯甲烷/甲醇＝85∶5，v/v；

77、步驟(b)中

78、在一些實(shí)施方式中，化合物b在甲醇中還原，在一些實(shí)施方式中，化合物b在加氫催化劑存在下被氫氣還原，例如，所述加氫催化劑為鈀碳；

79、在一些實(shí)施方式中，反應(yīng)完成后，還包括分離純化步驟：反應(yīng)液經(jīng)硅藻土過濾后濃縮，即得到化合物c。

80、步驟s6

81、在一些實(shí)施方式中，反應(yīng)在溶劑8中進(jìn)行，例如，溶劑8為二氯甲烷、甲醇混合溶劑，優(yōu)選地，其中二氯甲烷與甲醇比為1∶1，v/v；

82、在一些實(shí)施方式中，化合物6在甲醇鈉存在下發(fā)生脫乙酰反應(yīng)?；衔?與甲醇鈉的摩爾比為1∶1.5～2.5；優(yōu)選地，甲醇鈉以溶液的形式加入反應(yīng)體系，溶劑優(yōu)選為甲醇；

83、在一些實(shí)施方式中，所述反應(yīng)在20～30℃、攪拌條件下進(jìn)行，反應(yīng)時(shí)間為8～14h；

84、在一些實(shí)施方式中，反應(yīng)完成后，還包括分離純化步驟：反應(yīng)液使用氫型離子交換樹脂中和后過濾，濾液濃縮后即得到化合物7。

85、步驟s7

86、在一些實(shí)施方式中，所述殼二糖基二磷酸多酚β-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶(alg1)，是釀酒酵母saccharomyces?cerevisiae來源的；特別地，其氨基酸序列如seq?id：1所示。

87、在一些實(shí)施方式中，反應(yīng)在mg2+存在下進(jìn)行；

88、在一些實(shí)施方式中，反應(yīng)在ph值為6-9，例如6.5、7.0、7.2、7.5、7.8、8.0、8.5等，優(yōu)選為7.4的條件下進(jìn)行。

89、步驟s8

90、在一些實(shí)施方式中，α-1，3/1，6-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶(alg2)是人來源的；特別地，其氨基酸序列如seq?id：2所示。

91、在一些實(shí)施方式中，反應(yīng)在mg2+存在下進(jìn)行；

92、在一些實(shí)施方式中，反應(yīng)在ph值為7-8，例如7.0、7.2、7.4、7.5、7.8、8.0等，優(yōu)選為7.4的條件下進(jìn)行。

93、步驟s9

94、在一些實(shí)施方式中，反應(yīng)在hcl溶液中進(jìn)行。例如，hcl溶液中hcl的濃度為0.5～1.5m。

95、在一些實(shí)施方式中，反應(yīng)溫度為60-80℃，優(yōu)選70℃，反應(yīng)時(shí)間為1.5～2.5h。

96、步驟s10

97、在一些實(shí)施方式中，α-1，3-甘露糖糖蛋白2-β-n-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶(mgat1)是人來源的，特別地，其氨基酸序列如seq?id：3所示。

98、在一些實(shí)施方式中，反應(yīng)在mn2+、mg2+存在下進(jìn)行；

99、在一些實(shí)施方式中，反應(yīng)在ph值為7-8，例如7.0、7.2、7.4、7.5、7.8、8.0等，優(yōu)選為7.4的條件下進(jìn)行。

100、步驟s11

101、在一些實(shí)施方式中，α-1，6-甘露糖糖蛋白2-β-n-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶(mgat2)是人來源的；特別地，其氨基酸序列如seq?id：4所示。

102、在一些實(shí)施方式中，反應(yīng)在mn2+、mg2+存在下進(jìn)行；

103、在一些實(shí)施方式中，反應(yīng)在ph值為7-8，例如7.0、7.2、7.4、7.5、7.8、8.0等，優(yōu)選為7.4的條件下進(jìn)行。

104、在一些實(shí)施方式中，步驟s7和s8可以分開進(jìn)行或者按照一鍋法在同一反應(yīng)體系中進(jìn)行。

105、在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，步驟s7和s8在同一反應(yīng)體系中進(jìn)行，此時(shí)可以將化合物7、鳥苷二磷酸甘露糖(gdp-man)作為底物，在金屬mg2+存在下，在步驟s7中所述的殼二糖基二磷酸多酚β-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶(alg1)或在alg1的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有alg1活性的由alg1衍生的蛋白質(zhì)和步驟s8中所述的α-1，3/1，6-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶(alg2)或在alg2的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有alg2活性的由alg2衍生的蛋白質(zhì)的作用下，催化合成man3-gn2-pp-lipid(化合物9)，其反應(yīng)式如下：

106、

107、在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，步驟s10、s11可以分開進(jìn)行或者按照一鍋法在同一反應(yīng)體系中進(jìn)行。

108、在一些實(shí)施方式中，步驟s10、s11在同一反應(yīng)體系中進(jìn)行，此時(shí)可以將式(i)所示的核心五糖、尿苷二磷酸n-乙酰氨基葡萄糖(udp-glcnac)作為底物，在金屬mg2+、mn2+存在下，在步驟s10中所述的α-1，3-甘露糖糖蛋白2-β-n-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶(mgat1)或在mgat1的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有mgat1活性的由mgat1衍生的蛋白質(zhì)，和步驟s11中所述的α-1，6-甘露糖糖蛋白2-β-n-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶(mgat2)或在mgat2的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有mgat2活性的由mgat2衍生的蛋白質(zhì)的作用下，催化合成式(ii)所示的核心七糖glcnac2-man3-glcnac2，其反應(yīng)式如下：

109、

110、第二個(gè)方面，本發(fā)明提供一種制備式(iii)所示的n-聚糖的方法，

111、

112、在式(iii)中，

113、表示d-吡喃甘露糖，

114、表示n-乙酰氨基葡萄糖，

115、表示n-乙酰神經(jīng)氨酸，

116、表示d-吡喃半乳糖，

117、表示l-吡喃巖藻糖，

118、β4表示一個(gè)糖半縮醛羥基與另一個(gè)糖4位碳上的羥基通過β構(gòu)型的糖苷鍵相連，

119、β2表示一個(gè)糖半縮醛羥基與另一個(gè)糖2位碳上的羥基通過β構(gòu)型的糖苷鍵相連，

120、α3表示一個(gè)糖半縮醛羥基與另一個(gè)糖3位碳上的羥基通過α構(gòu)型的糖苷鍵相連，

121、α6表示一個(gè)糖半縮醛羥基與另一個(gè)糖6位碳上的羥基通過α構(gòu)型的糖苷鍵相連；

122、---表示含有或者不含有上述單糖結(jié)構(gòu)；

123、所述方法包括：在前述n-聚糖中式(i)所示核心五糖或式(ii)所示核心七糖的合成方法的基礎(chǔ)上，通過酶促反應(yīng)或化學(xué)反應(yīng)延伸核心五糖或核心七糖，以制備式(iii)所示n-聚糖；

124、其中，所述酶促反應(yīng)或化學(xué)反應(yīng)選自以下一種或多種：

125、(1)在β1，3-半乳糖基化轉(zhuǎn)移酶(b3galt)或在b3galt的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有b3galt活性的由b3galt衍生的蛋白質(zhì)的作用下，n-聚糖與尿苷二磷酰半乳糖(udp-gal)反應(yīng)，在n-聚糖的天線末端處的n-乙酰氨基葡萄糖a上添加以β1，3-糖苷鍵連接的半乳糖c；

126、優(yōu)選地，所述b3galt是紫羅蘭色桿菌chromobacterium?violaceum來源的；特別地，其氨基酸序列如seq?id：5所示；

127、優(yōu)選地，上述酶促反應(yīng)在mg2+存在下進(jìn)行；反應(yīng)體系的ph值為6至9，優(yōu)選為約7.5；

128、(2)在β1，4-半乳糖基化轉(zhuǎn)移酶(b4galt)或在b4galt的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有b4galt活性的由b4galt衍生的蛋白質(zhì)的作用下，n-聚糖與尿苷二磷酰半乳糖(udp-gal)反應(yīng)，在n-聚糖的天線末端處的n-乙酰氨基葡萄糖基a和/或b上添加以β1，4-糖苷鍵連接的半乳糖c和/或d；

129、優(yōu)選地，所述b4galt是人來源的；特別地，其氨基酸序列如seq?id：6所示；

130、優(yōu)選地，上述酶促反應(yīng)在mn2+存在下進(jìn)行；反應(yīng)體系的ph值為6至9，優(yōu)選為約7.5；

131、(3)在α2，6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶(pd2，6st)或在pd2，6st的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有pd2，6st活性的由pd2，6st衍生的蛋白質(zhì)，或者在α2，6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶(st6gal1)或在st6gal1的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有st6gal1活性的由st6gal1衍生的蛋白質(zhì)的作用下，n-聚糖和與胞苷單磷酰n-乙酰神經(jīng)氨酸(cmp-neu5ac)反應(yīng)，在n-聚糖的天線末端處的半乳糖基c和/或d上添加以α2，6-糖苷鍵連接的n-乙酰神經(jīng)氨酸e和/或f；

132、優(yōu)選地，所述pd2，6st是光桿菌屬photobacterium?damsela來源的；特別地，其氨基酸序列如seq?id：7所示；所述st6ga11是人來源的，特別地，其氨基酸序列如seq?id：8所示；

133、優(yōu)選地，上述酶促反應(yīng)在mg2+存在條件下進(jìn)行，反應(yīng)體系的ph值為6至9，優(yōu)選為約7.5；

134、(4)在α2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶(btst)或在btst的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有btst活性的由btst衍生的蛋白質(zhì)，或者在α2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶(ppst)或在ppst的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有ppst活性的由ppst衍生的蛋白質(zhì)的作用下，n-聚糖與胞苷單磷酰n-乙酰神經(jīng)氨酸(cmp-neu5ac)反應(yīng)，在n-聚糖的天線末端處的半乳糖基c和/或d上添加以α2，3-糖苷鍵連接的n-乙酰神經(jīng)氨酸e和/或f；

135、優(yōu)選地，所述btst是比伯斯坦氏菌bibersteinia?trehalosi來源的，特別地，其氨基酸序列如seq?id：9所示；所述ppst是磷光桿菌photobacterium?phosphoreum來源的，特別地，其氨基酸序列如seq?id：10所示；

136、優(yōu)選地，上述酶促反應(yīng)在mg2+存在條件下進(jìn)行；反應(yīng)體系的ph值為6至9，優(yōu)選為約7.5。

137、(5)在α1，3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(fuct)或在fuct的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有fuct活性的由fuct衍生的蛋白質(zhì)的作用下，n-聚糖與鳥苷二磷酸巖藻糖(gdp-fucose)反應(yīng)，在n-聚糖的天線上的n-乙酰氨基葡萄糖基a和/或b上添加以α1，3-糖苷鍵連接的巖藻糖g和/或h；

138、優(yōu)選地，所述fuct是幽門螺桿菌helicobacter?pylori來源的；特別地，其氨基酸序列如seq?id：11所示；

139、優(yōu)選地，上述酶促反應(yīng)在mg2+存在條件下進(jìn)行；反應(yīng)體系的ph值為6至9，優(yōu)選為約7.5。

140、(6)在β1，3-半乳糖基化水解酶(b3galh)或在b3galh的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有b3galh活性的由b3galh衍生的蛋白質(zhì)的作用下，去掉n-聚糖的天線末端的以β1，3-糖苷鍵連接在n-乙酰氨基葡萄糖a上的半乳糖c；

141、優(yōu)選地，上述酶促反應(yīng)的反應(yīng)體系的ph值為6至9，優(yōu)選為約7.0；

142、(7)在β1，4-半乳糖基化水解酶(b4galh)或在b4galh的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有b4galh活性的由b4galh衍生的蛋白質(zhì)的作用下，去掉n-聚糖的天線末端的以β1，4-糖苷鍵連接在n-乙酰氨基葡萄糖a和/或b上的半乳糖c和/或d；

143、優(yōu)選地，上述酶促反應(yīng)的反應(yīng)體系的ph值為6至9，優(yōu)選為約7.0；

144、(8)在β1，2-n-乙酰氨基葡萄糖基化水解酶(glcnach)或在glcnach的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有g(shù)lcnach活性的由glcnach衍生的蛋白質(zhì)的作用下，去掉n-聚糖的天線末端的以β1，2-糖苷鍵連接在半乳糖上的n-乙酰氨基葡萄糖a和/或b；

145、優(yōu)選地，上述酶促反應(yīng)的反應(yīng)體系的ph值為6至9，優(yōu)選為約7.0。

146、(9)在五角鏈球菌streptococcus?penumoniae來源的α2，3-唾液酸水解酶(nanc)或在nanc的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有nanc活性的由nanc衍生的蛋白質(zhì)的作用下，去掉n-聚糖天線末端的以α2，3-糖苷鍵連接在半乳糖基c和/或d上的n-乙酰神經(jīng)氨酸e和/或f；

147、優(yōu)選地，所述nanc是五角鏈球菌streptococcus?penumoniae來源的；

148、優(yōu)選地，上述酶促反應(yīng)的反應(yīng)體系的ph值為6至9，優(yōu)選為約7.0。

149、(10)在α1，3-巖藻糖基水解酶(fuch)或在fuch的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有fuch活性的由fuch衍生的蛋白質(zhì)的作用下，去掉n-聚糖的以α1，3-糖苷鍵連接在n-聚糖的天線上的n-乙酰氨基葡萄糖基a和/或b上的巖藻糖g和/或h；

150、優(yōu)選地，上述酶促反應(yīng)的反應(yīng)體系的ph值為6至9，優(yōu)選為約7.0；

151、(11)在醋酸的作用下，去掉n-聚糖天線末端處的以α2，6-糖苷鍵連接在半乳糖基c或d上的n-乙酰神經(jīng)氨酸e和/或f；

152、優(yōu)選地，醋酸以醋酸水溶液的形式，其濃度為1.5-2.5m；反應(yīng)的溫度為70～90℃；

153、優(yōu)選地，反應(yīng)完成后經(jīng)加入碳酸氫鈉中和反應(yīng)，用p2柱濃縮純化，得到目標(biāo)產(chǎn)物。

154、上述步驟(1)-(11)中，可以進(jìn)一步包括分離純化步驟。具體地，所述純化步驟包括：在反應(yīng)結(jié)束后，加入乙醇，固液分離(例如，10000g，離心10分鐘)，上清液用p2柱濃縮純化，得目標(biāo)產(chǎn)物。

155、在一些實(shí)施方式中，式(iii)所示的n-聚糖選自以下結(jié)構(gòu)所示的化合物：

156、

157、

158、

159、在一些實(shí)施方式中，上述制備由(iii)所示的n-聚糖的方法包括如下步驟：

160、

161、(a)以式(ii)所示的核心七糖為底物，在β1，3-半乳糖基化轉(zhuǎn)移酶(b3galt)或在b3galt的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有b3galt活性的由b3galt衍生的蛋白質(zhì)的作用下，在式(ii)所示的核心七糖的天線末端處的n-乙酰氨基葡萄糖a上添加一個(gè)以β1，3-糖苷鍵連接的半乳糖c，得到化合物40；

162、(b)然后在β1，4-半乳糖基化轉(zhuǎn)移酶(b4galt)或在b4galt的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有b4galt活性的由b4galt衍生的蛋白質(zhì)的作用下，在化合物40天線末端處n-乙酰氨基葡萄糖b上添加一個(gè)以β1，4-糖苷鍵連接的半乳糖d，得到化合物41；

163、(c)隨后在β1，3-半乳糖基化水解酶(b3galh)或在b4galh的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有b4galh活性的由b4galh衍生的蛋白質(zhì)的作用下，去掉末端的以β1，3-糖苷鍵連接的半乳糖c，得到不對稱雙天線n-聚糖42。

164、在一些實(shí)施方式中，上述制備由(iii)所示的雙天線n-聚糖的方法還包括以下反應(yīng)式所示方法：

165、

166、

167、

168、具體步驟包括：

169、(d)在β1，4-半乳糖基化轉(zhuǎn)移酶(b4galt)或在b4galt的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有b4galt活性的由b4galt衍生的蛋白質(zhì)的作用下，式(ii)化合物、化合物28、化合物43、化合物49、化合物53、化合物56、化合物61、化合物64和尿苷二磷酰半乳糖(udp-gal)反應(yīng)，在n-聚糖的天線末端處的n-乙酰氨基葡萄糖基上添加以β1，4-糖苷鍵連接的半乳糖，分別得到化合物30、化合物35、化合物44、化合物50、化合物54、化合物57、化合物62、化合物65；

170、(e)在α2，6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶(pd2，6st)或在pd2，6st的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有pd2，6st活性的由pd2，6st衍生的蛋白質(zhì)，或者在α2，6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶(st6gal1)或在st6gal1的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有st6gal1活性的由st6gal1衍生的蛋白質(zhì)的作用下，化合物30、化合物35、化合物42、化合物44、化合物57、化合物72分別與胞苷單磷酰n-乙酰神經(jīng)氨酸(cmp-neu5ac)反應(yīng)，在n-聚糖的天線末端處的半乳糖基上添加以α2，6-糖苷鍵連接的n-乙酰神經(jīng)氨酸，分別得到化合物33、化合物38、化合物61、化合物48、化合物68、化合物77；

171、(f)在α2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶(btst)或在btst的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有btst活性的由btst衍生的蛋白質(zhì)，或者在α2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶(ppst)或在ppst的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有ppst活性的由ppst衍生的蛋白質(zhì)的作用下，化合物30、化合物31、化合物35、化合物36、化合物42、化合物45、化合物52、化合物57、化合物65、化合物68、化合物70、化合物72、化合物74分別與胞苷單磷酰n-乙酰神經(jīng)氨酸(cmp-neu5ac)反應(yīng)，在n-聚糖的天線末端處的半乳糖基上添加以α2，3-糖苷鍵連接的n-乙酰神經(jīng)氨酸，分別得到化合物32、化合物34、化合物37、化合物39、化合物43、化合物46、化合物53、化合物58、化合物66、化合物69、化合物71、化合物75、化合物76；

172、(g)在α1，3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(fuct)或在fuct的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有fuct活性的由fuct衍生的蛋白質(zhì)的作用下，化合物31、化合物35、化合物51、化合物54、化合物42、化合物62、化合物65、化合物72分別與鳥苷二磷酸巖藻糖(gdp-fucose)反應(yīng)，在n-聚糖的天線上的n-乙酰氨基葡萄糖基上添加以α1，3-糖苷鍵連接的巖藻糖，得到化合物32、化合物36、化合物52、化合物55、化合物56、化合物70、化合物67、化合物74；

173、(h)在β1，3-半乳糖基化水解酶(b3galh)或在b3galh的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有b3galh活性的由b3galh衍生的蛋白質(zhì)的作用下，去掉化合物41的天線末端的以β1，3-糖苷鍵連接在n-乙酰氨基葡萄糖上的半乳糖，得到化合物42；

174、(i)在β1，4-半乳糖基化水解酶(b4galh)或在b4galh的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有b4galh活性的由b4galh衍生的蛋白質(zhì)的作用下，去掉化合物49、化合物59或化合物72的天線末端的以β1，4-糖苷鍵連接在n-乙酰氨基葡萄糖上的半乳糖，分別得到化合物50、化合物60、化合物73；

175、(j)在β1，2-n-乙酰氨基葡萄糖基化水解酶(glcnach)或在glcnach的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有g(shù)lcnach活性的由glcnach衍生的蛋白質(zhì)的作用下，去掉化合物42的天線末端的以β1，2-糖苷鍵連接在半乳糖上的n-乙酰氨基葡萄糖，得到化合物72；

176、(k)在五角鏈球菌streptococcus?penumoniae來源的α2，3-唾液酸水解酶(nanc)或在nanc的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有nanc活性的由nanc衍生的蛋白質(zhì)的作用下，去掉化合物45或化合物48天線末端的以α2，3-糖苷鍵連接在半乳糖基上的n-乙酰神經(jīng)氨酸，分別得到化合物47、化合物49；

177、(1)在α1，3-巖藻糖基水解酶(fuch)或在fuch的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有fuch活性的由fuch衍生的蛋白質(zhì)的作用下，去掉化合物58的以α1，3-糖苷鍵連接在n-聚糖的天線上的n-乙酰氨基葡萄糖基上的巖藻糖，得到化合物59：

178、(m)在醋酸的作用下，去掉化合物50天線末端處的以α2，6-糖苷鍵連接在半乳糖基上的n-乙酰神經(jīng)氨酸，得到化合物51。